形态学和遗传多样性的根瘤菌结瘤豇豆(豇豆属unguiculata肯尼亚东部低l .)从农业土壤

文摘

有限的土壤中氮(N)的内容是一个主要的挑战,可持续和高作物生产在许多发展中国家。豆科植物与根瘤菌的共生固氮中扮演一个重要的角色在提供足够的N豆类和随后的非豆科作物。识别根瘤菌菌株适合bioinoculant生产,表征根瘤菌是一个先决条件。本研究的目的是评估的形态学和遗传多样性根瘤菌结瘤豇豆在肯尼亚东部低农业土壤。28根瘤菌分离从采集土壤样本中恢复过来从农民在Machakos Makueni, Kitui县肯尼亚东部低,基于形态特征的特征。13代表隔离选择并使用框重复元素PCR指纹特征。从形态特征、基于系统树图生成测试隔离被分成两个主要的集群在75%的相似度。系统发育树,基于PCR框重复元素,分组分离成两个集群在90%相似性水平。隔离不显示的聚类关系的起源土壤样本,尽管基因隔离是多样化。本研究是一个先决条件的选择合适的豇豆根瘤菌在肯尼亚发展可持续作物生产bioinoculants。

1。介绍

根瘤菌是土壤细菌感染的根豆科植物形成根瘤,在那里他们分化和修复大气氮(N)的优势植物(1]。氮是一种重要的植物的生长和发育所需营养。缺乏的土壤和作物不利影响植物生长和产量在小农农场在非洲2]。豆类依赖氮的生物固定通过与根瘤菌共生协会获得所需数量的N高粮食产量(3]。legume-rhizobium共生提供至少50%的每年1.75亿吨的N在农业生产4]。这个过程是一个可持续的和具有成本效益的策略添加N陆地生态系统在非洲小农农业系统。

豇豆(豇豆属unguiculatal .)是一年一度的豆类作物广泛种植在东非(5]。这是第三个最重要的豆科作物生长在肯尼亚,豆类和鸽子豌豆(后6]。作物获得了重要的膳食蛋白质小规模农民在肯尼亚。由于其固氮能力的土壤,它是生长在混合间作系统没有化肥的应用程序(7]。然而,信息的多样性cowpea-nodulating根瘤菌在肯尼亚东部低土壤是有限的,虽然它在管理有巨大的潜在土壤肥力,增加作物产量。考虑到土壤的物理化学性质的变化较低的肯尼亚东部[8),选择高效菌株的豇豆根瘤菌有节在不同土壤提高良率是一个重要的一步。因此,评价土著根瘤菌菌株的形态学和遗传多样性代表一个重要的先决条件获得小说一样。

鉴于根瘤菌分类学的不同(9)、高效的方法分类隔离是必要的鉴别菌株高固氮能力(10]。初步鉴定和筛选根瘤菌基于形态学特征;然而,这种方法由于形态可塑性非常容易出错。根瘤菌的多样性信息可以提高通过结合形态分析和基因型菌株之间的差异。几个分子技术包括随机扩增多态性DNA (11),限制片段长度多态性(11,12,重复基因外palindromic-polymerase连锁反应(rep-PCR和BOX-PCR) (13- - - - - -15)已经申请了根瘤菌的鉴定和遗传多样性研究。重复基因外回文PCR过程已经成功地用于描述细菌;事实证明要快、简单和可再生的高潜力的区分隔离的菌株(16,17]。此外,这种技术产生好结果的相关性成对dna dna分析(18]。

迄今为止,没有研究已经完成的各种形态和农业土壤中土著根瘤菌的遗传多样性较低的肯尼亚东部。土著根瘤菌株的鉴定能很好地适应当地环境条件和土壤特征作为bioinoculants豇豆的肯尼亚土壤有显著的经济和环境的影响。考虑经济豇豆和缺乏研究的重要性的豇豆根瘤菌数量在肯尼亚东部低,土壤细菌从豇豆结节生长在肯尼亚东部较低的土壤是孤立和特点。本研究的目标是(i)的形态特征进行评估cowpea-nodulating根瘤菌分离土壤样本在肯尼亚东部低,农民的田地(ii)评估豇豆根瘤菌的遗传变异性隔离使用BOX-PCR指纹。

2。材料和方法

2.1。现场站点和土壤采样程序的描述

18从选定的农田土壤样品采集,这从未接种根瘤菌,Machakos, Kitui, Makueni县肯尼亚东部低。这三个县的特点是半干旱土地与高度风化的土壤有机质和低生产率较低。高温和低抽样地区年降雨量主导(表1)。至少5个字段在每县随机选择。用手铲、土壤(1公斤)收集每个字段的深度从每个采样点5厘米。手铲是清洗每次取样后用自来水和使用无菌干布。土壤样本彻底混合形成复合试样。土壤样本放置在塑料聚乙烯袋、标签、储存在室温下( °C)为后续根瘤菌的分离。

2.2。隔离的根瘤菌豇豆属unguiculata

土壤样本放置在标签塑料锅(直径5厘米,250克)和认证的豇豆(豇豆属unguiculata)品种271 KV用作植物在温室的陷阱。豇豆品种271 KV当地长白猪和种子栗色的颜色,喜欢较低的肯尼亚东部的农民由于其高产,抗病性和卓越的烹饪质量和口感。收集土壤样本放置在标签塑料锅和浇水,直到与自来水充分湿润。四个豇豆种子播种在每个土样一式三份,减少每锅两苗种植后7天。剩下的两个植物作为植物根瘤菌的陷阱。锅放在一个表在温室,每当需要浇水。实验有一个完全随机设计。植物种植后被连根拔起60 - 70天,根是用自来水清洗,结节是分离的。收集到的结节立即被允许脱水与硅胶玻璃瓶,薄薄的一层棉花,螺丝控油罩(19]。

从豇豆根瘤菌孤立结节完成后由Somasegaran和Hoben描述的方法(20.]。健康的、完整的和粉色的根结节从每个土壤样本随机选择根瘤菌的分离。结节在层流柜表面消毒浸没在乙醇(95% v / v) 30秒后4分钟的浸泡在3.8%次氯酸钠,最后用六变化的无菌重蒸馏的水冲洗。100年的结节被压碎μl使用消毒的无菌蒸馏水冲钳。一个铂环量的结节悬挂无菌飞跑到YEMA (10 g甘露醇,0.2 g MgSO₄h·7₂啊,0.2克氯化钠,0.5 g K₂HPO₄、1克酵母提取物、琼脂和15克、pH值 )中含有溴麝香草酚蓝。盘子是用铝箔(黑暗),孵化出了28°C,并观察日常的必要描述殖民地增长(21]。

2.3。对根瘤菌的分离形态特征

形态特征的根瘤菌做是为了确定其增长率(缓慢或快速),粘液生产(粘液量和弹性),改变介质的pH值在隔离的增长,和群体特征。殖民地的形成在YEMA板块为10天,每天监测和生长介质的pH值变化得分YEMA板块包含0.25 mg / l溴百里酚蓝(BTB)。文化孕育了10天在28°C和观察每天的颜色变化。把黄色的生长介质的分离酸生产者和种植者归类为快。的隔离中变成了蓝色,被认为是碱性生产者和被分类为缓慢的种植者。孵化后28°C 2至10天,不同的殖民地特征基于它们的大小(小:< 2毫米,中:2 - 3毫米,大:4 - 5毫米),颜色(白色/乳白色透明),形状(圆形,椭球),透明度,边界,和海拔(凸、提高,夷为平地,凸形的)。

2.4。革兰氏染色法、刚果红吸收能力

革兰氏染色法和显微镜来确定文化革兰氏阴性或阳性。染色完成后由哈罗德(描述的方法22]。一群细菌培养与无菌接种了线圈,和一个薄涂片制备一滴水在干净的载玻片。涂片风干,热固定的,与结晶紫染色一分钟,然后用蒸馏水洗净。诽谤是碘溶液淹了一分钟之后,一分钟用乙醇脱色(95% v / v),然后用蒸馏水清洗停止酒精的作用,并与红色染料复染色20分钟。幻灯片是用蒸馏水洗净,晒干,在1000 x光显微镜下观察放大使用油浸。隔离的能力吸收刚果红测试通过添加1%刚果红溶液在准备和热压处理过的YEMA媒体涌入无菌中盘子。

2.5。对根瘤菌的分离遗传变异性

十三28根瘤菌的分离回收被选为进一步分子变异研究基于形态特征的聚类分析。

2.6。从根瘤菌悬挂文化中提取DNA

基因组DNA为根瘤菌文化孤立使用cetyltrimethylammonium溴铵(CTAB)方法被威尔逊[23]。孤立的DNA在无菌水溶解。DNA的质量和完整性被琼脂糖电泳证实1 x Tris-acetate-EDTA (TAE)和量化是用分光光度计(美国贝克人Coulter UV / VIS)。乐队使用DNR-Imaging可视化和拍摄系统。DNA是储存在-20°C到使用。

2.7。重复的元素序列PCR分析

十三根瘤菌分离使用BOX-PCR指纹识别进行了分析。放大进行使用BOXA1R引物(5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′)所描述的Versalovic et al。14]。20的总量μl用于放大反应。包含100 ng的基因组DNA, PCR反应1μl BOXA1R底漆,4μl PCR预混料(PCR缓冲,核苷酸聚合酶)和最终体积调整到20μl使用无菌重蒸馏的水。使用以下thermocycler条件:初始变性在94°C 5分钟,30个周期94°C的变性1分钟,退火在52°C 1分钟,在65°C扩展了8分钟,最终在65°C扩展前15分钟冷却在4°C。分析了放大产品使用2% (w / v)琼脂糖凝胶电泳在80伏150分钟。这种凝胶是可视化和使用DNR-Imaging拍摄系统。

条带模式的一致性验证了重复PCR反应至少三次每个根瘤菌的分离。只有不同的和可再生的乐队为每个样本都得分和用于生成二进制矩阵中存在一个乐队被列为一(1),没有一个乐队为0(零)。

2.8。数据分析

形态和文化特点,rhizobial殖民地取得数值,受到一个层次聚类分析获得的数据使用的平方欧氏距离的相似性和程序使用SPSS软件版本20团体之间的联系。

存在放大产品得分(1)和(0)的乐队。使用未加权的分子多样性分析两组平均算术法(UPGMA)算法和Jaccard系数生成/构建系统树图。

3所示。结果

3.1。隔离对根瘤菌的分离和鉴定

28隔离的根瘤菌从根瘤中恢复过来诉unguiculata生长在三个县的农业土壤收集肯尼亚东部(表低1)。所有的28根瘤菌分离株革兰氏阴性,杆状细胞(图1)。所有隔离吸收小刚果红生产殖民地淡粉色到白色的颜色。

3.2。对根瘤菌的分离形态特征

当孵化28°C时,隔离是快速增长的55%,而45%是增长缓慢。YEMA中含有溴百里酚蓝(BTB),快速增长的根瘤菌菌株产生的殖民地,利润率与奶油黄色或黄或奶油从2 - 5毫米直径在3天的孵化(图2)。增长缓慢的隔离产生白色的殖民地,但在某些情况下,殖民地乳白色半透明的或黄色和< 2 - 3毫米直径范围孵化后7 - 10天。殖民地的形状在大多数隔离是一轮除了少数隔离点状的,有些是不规则的。边缘光滑许多隔离或波状的隔离。培养基的pH值变化的BTB对快速增长的隔离是酸性除了隔离MC4从土壤中收集Machakos县碱性介质。增长缓慢分离碱性介质除了隔离KT2 Kitui县酸化中。

关于粘液生产,20例(哪,MC5 MC6, MC14, MC7, MC13, MC12, MK11, MK9, MK12, MK10, KT5, MC2, KT4, MC8, MC10, MC9, MC4, MC11, KT6)有很高的粘液生产而8隔离(KT3、KT2 MK20, MK18, MK15, MC3 KT1, MC15)中间粘液生产。没有干燥的殖民地。隔离不同的外观最孤立的扩散和非弹性(KT5、MC14 MC7, MC13, MC12, MK12, MK11, KT5, MK9, MK20, KT4, KT2, MC10, MC9, MC4, MK10, MC8, MC11, MC1, MC5, MK20, MC6, MC3 MC2)当别人在外观密度和弹性(KT3、MC15 KT1, MK18)。

3.3。根瘤菌分离株的形态特征的分析

的表型特征根瘤菌分离通过聚类分析进行了比较。得到的聚类图分离根瘤菌的分离成两个主要的集群,A和B在75%的相似水平(图3)。集群B是只有两个隔离(MC7和MC13)生长缓慢,乳白色的,不规则的,半透明的。集群由许多隔离有两个subclusters, 1和2。Subcluster 1进一步包括两个大组,我和二世。集群subcluster 1组由生长缓慢的隔离(KT5、MK15 MC9, MC14, MC12, MC10, MC8, KT4, KT6),白色和中型平滑利润和碱性YMA包含BTB的媒介。的平均相似性隔离范围从95%(隔离KT6)到98%(隔离KT5、MK15 MC9, MC14, MC10, MC12, MC8, KT4)。

集群subcluster 1组II由快速增长的除了KT2孤立隔离,生长缓慢,但酸化中,黄色。的平均相似性隔离从90%到98%不等。Subcluster 2由快速增长的隔离(MK9、MK12 MC15, MK18, KT1)的混合特征与一些与奶油黄色利润率(MK9、MK12 KT1)或黄色(MK18和M15),不规则(MK12和MK9)或圆(MK18, MC15 KT1)在形状、大小和大型(MK9, MK12 KT1)。

3.4。根瘤菌的遗传变异性BOX-PCR隔离

指纹特征都是由根瘤菌分离不同和scorable乐队从250年到2500年英国石油公司和他们的数量从4到12乐队/隔离(图4)。PCR是至少重复三次使用不同的DNA样本相同的隔离,只有那些可再生的乐队和相似的指纹被用于分析。系统树图的相似性产生从BOX-PCRs调查获得的数据隔离分开的根瘤菌分离成两个主要的集群,集群和集群B(图5)。集群由九个隔离(MC8、MC7 MK9, MC4, MC2, MC6, KT2, MK12,和MK11)从土壤中获得收集到所有的三个县,而集群B包含四个隔离(MC10, MC5、KT1 KT3)从Machakos Kitui县。集群之间的遗传相似水平是100%。

集群分为两个subclusters I和II基因相似度为98%。Subcluster我包含8隔离从土壤样本三个县,虽然Subcluster二只有一个隔离(MK11)从土壤采样Makueni县。集群B也分为两个subclusters, subcluster I和II, 95%的遗传相似性。Subcluster我只包含一个隔离(MC10)从Machakos县。Subcluster II包含三个分离株(MC5、KT1 KT3)从土壤采样Machakos和Kitui县和一个隔离(MC10)从Machakos县。

4所示。讨论

这项研究报告的形态学和遗传变异细菌结瘤豇豆在从Machakos收集土壤样本,Makueni,肯尼亚东部低和Kitui县,特点是高热能振幅和低降雨量。28根瘤菌的分离从豇豆植物根瘤中恢复过来。这些隔离被指定为根瘤菌群体特征的基础上,细胞形态,无法吸收刚果红染料。所有的隔离是革兰氏阴性,有杆状细胞。此外,所有的分离培养YEMA介质包含刚果红染料生产的殖民地,白色到淡粉色表明隔离不吸收染料在黑暗中孵化。隔离的能力吸收根瘤菌的刚果红染料是一种独特的字符24]。种根瘤菌不吸收刚果红染料或吸收少量给淡粉色外观(20.,24]。Shoukry et al。25]也观察到白色或淡粉色的殖民地蚕豆根瘤菌分离包含刚果红YEMA媒体。不过,也有例外的根瘤菌菌株吸收刚果红取决于文化的时代,染料浓度和光照20.)生产橙色或深粉色殖民地,例如,物种的洋葱(26]。

基于增长率YEMA介质,根瘤菌科家庭的细菌可以分为两大类,即快速增长缓慢的根瘤菌。在目前的研究中,两组观察根瘤菌在所有三个县的土壤。这一发现与先前的研究[的情况相符27- - - - - -29日]报道的出现快速和slow-slowing根瘤菌在许多亚热带和热带土壤。结果还表明,豇豆根瘤菌是由两组结节状的,但是快种植者形成多数。百分之五十五的根瘤菌隔离在这项研究中形成的殖民地YEMA媒体的三天内孵化,因此分为快速种植者根据Odee et al。30.]。殖民地由这些快速增长的隔离与奶油的利润,目前的研究是黄色的凸圆,整个利润的大小从2到5毫米。分离株根瘤菌形成殖民地在72小时内被辛格报道et al。31日在大豆和Ngakou et al。32在班巴拉族花生、豇豆和大豆。生长缓慢分离形成的殖民地后7 - 10天的孵化中小型,白色或乳白色,半透明的,在成长过程中得到了光滑的边缘。这些特点Bradyrhizobium种虫害Howieson和所述:帝尔沃斯历史学(26]。桑锦格et al。27)报道,生长缓慢的根瘤菌菌株在热带土壤主导;然而,从目前的研究结果显示,反向隔离的55%是快速增长的物种。隔离在这项研究中有黄色和白色的殖民地与乳白色的外表,而一些隔离显示透明的殖民地YEMA中含有溴麝香草酚蓝。根据约旦(33),殖民地的根瘤菌是白色、黄色或粉红色的颜色,尽管很少发现黄色或粉红色根瘤菌的殖民地34]。

基于根瘤菌的生长与BTB YEMA中补充(酸碱指示剂),隔离被分为两组,即生产者和alkalizers酸。结果表明,两组的根瘤菌结节状的豇豆和酸生产商比alkalizers更普遍。百分之五十五的隔离了与BTB YEMA媒体补充的颜色,黄色的五天内孵化,表明它们是酸生产商,从而证实了快速和Assefa吉大种植者所描述的35]除了MC4碱性媒体。快速增长的根瘤菌菌株证实酸化YEMA中补充了BTB隔绝其他豆类包括班巴拉族花生,花生,豇豆(36,37]。这个快速增长的分离频率太高了豇豆植物通常被认为是由细菌种类的结节状的Bradyrhizobium由生长缓慢的菌株与碱化媒体的能力(38]。这些发现可能表明,豇豆有节剂量不仅涉及的物种Bradyrhizobium而且根瘤菌的其他物种。在这个研究结果同意那些报道Zhang et al。11人孤立的快速增长的豇豆根瘤菌的植物物种。此外,高数量的快速增长的隔离在这个研究可能是由于这样的事实:快速增长的根瘤菌在干旱和半干旱土地,更常见的特征三个县的土壤采样站点肯尼亚东部低。根瘤菌从这些地区有能力乘快速在短期降雨和更宽容的应力条件比增长缓慢的菌株(39),这些生存策略可以解释他们的土壤样本中更大的频率用于这项研究。

所有募集的增长缓慢的分离介质的pH值除了隔离KT2酸化中这是一个不寻常的增长缓慢的隔离的行为。这个观察表明,豇豆窝藏细菌不同的文化特色可以形成共生关系。这些结果一致与Zilli et al。19]报告增长缓慢的根瘤菌株酸生产商。快速和缓慢分离显示粘液生产范围从高中间有隔离密度和弹性和其他分散,无弹性的。粘液生产可能代表了根瘤菌的适应机制和耐力在恶劣气候和土壤条件。防止干燥的细菌,帮助他们抵御波动温度、盐度、和酸度40]。巴蒂斯塔et al。41]指出增加生产隔离的粘液Bradyrhizobium作为一种机制的适应在巴西塞拉多地区的酸性土壤。粘液生产大多数根瘤菌分离是一项基本特征与有节[相关联41]。这表明根瘤菌分离粘液高生产能力有很高的竞争优势在最初感染,殖民,根瘤的形成。

基因指纹识别基于BOX-PCR被用来理解根瘤菌的遗传多样性,因为它是快速、简单,可再生的歧视在菌株水平高42]。放大sequence-related框元素提供指纹细菌的不同菌株之间建立系统发育关系(43]。在这项研究中,BOX-PCR分析显示高多态性进行隔离。大部分的隔离产生独特的带型指示高可变性之间的隔离。这清楚地显示了根瘤菌分离株高的遗传变异性肯尼亚东部农业土壤的低。这些发现同意报告从世界的其他地方,在观察高分子根瘤菌的多样性在耕地44]。高遗传多样性栽培土壤可以是由于植物对氮的高需求,进而刺激有节导致根瘤菌扩散(45]。田et al。46)也报道高分子根瘤菌的多样性隔绝蚕豆根尖使用BOX-PCR。高根瘤菌多样性中观察到三个县的土壤种植豆类早些时候可能是因为属于类似cross-inoculation组豇豆。

利用UPGMA算法和Jaccard相似系数的聚类分析显示配置文件,加入10%的相似性较低水平。这些结果同意先前的报道,托雷斯et al。47),Menna et al。48],Binde et al。49)观察到的高可变性在根瘤菌分离使用BOX-PCR相似性较低水平的10 - 20%的聚类分析。根瘤菌的遗传特性隔离使用BOX-PCR过程因此有效区分在这项研究中使用的隔离。的存在高隔离在任何土壤的多样性增加了几种豆科作物的概率找到兼容的根瘤菌结节的形成。

比较这两个系统树图构造基于形态特征和基因图谱,隔离KT3 MC4, MC7, MC8显示差异的聚类分析。隔离KT3和MC4形态相似但基因不同,而MC7和MC8形态不同,但基因相似。类似的研究结果报道De莱拉et al。50花生根瘤菌菌株的分离,高差异基于文化特征和遗传属性聚类分析基于BOXA1R概要文件。这些相似性差异可以用这一事实来解释形态变化比遗传因素与非生物因素。

5。结论

在肯尼亚东部低,土壤主要根瘤菌分离快速增长,酸化YMA介质和生产高中间胞外(粘液生产)。这些都是在半干旱地区相关属性的生存策略。目前的研究结果显示快速增长的多样性和结瘤生长缓慢的根瘤菌隔离诉unguiculata并建议在形态学变化诉unguiculata菌株作为候选人的选择工具隔离作为生物肥料。高遗传多样性与隔离BOX-PCR基因组指纹分析观察到显示不同模式的碎片从4 - 12所示。根瘤菌的遗传特性使用BOX-PCR被证明是一种有效的方法来识别隔离。本研究为进一步的研究提供了重要信息的多样性和根瘤细菌之间复杂的互动,寄主植物和环境因素。根瘤菌的分离特征在本研究中需要筛选的能力使用不同的豇豆固氮基因型和其他豆类肯尼亚东部低的经济重要性。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢学院生物科学和生物化学系,内罗毕大学(时续订)提供研究设备用于本研究。

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