嗜热细菌的分离和表征从约旦温泉:地衣芽孢杆菌和Thermomonas hydrothermalis耐热性的酶的分离株作为潜在的生产者

文摘

本研究的目的是嗜热细菌的分离和表征从温泉在约旦。十隔离的特点是形态,微观、生化、分子和生理特征。测序的16 s rDNA隔离随后爆炸搜索显示,9株可以确定为地衣芽孢杆菌和一个隔离Thermomonas hydrothermalis。这是第一次报告的隔离Thermomonas物种从约旦温泉。隔离显示的能力产生一些耐热性的酶如淀粉酶、蛋白酶、纤维素、明胶、卵磷脂。此外,UPGMA系统十分离的酶的特点是构造;结果显示高的表型多样性,鼓励未来的研究,进一步探索工业和环境的应用程序。

1。介绍

地热领域被认为是嗜热微生物的主要栖息地的来源(1]。地热特征并不常见的生态功能;他们出现在集群,在世界相隔数个地点发生的条件是正确的。由于地热资源的这个特定的性质,温泉只可在几个领域。最好的识别领域,这些研究大多是在冰岛,美国、新西兰、日本、意大利、印尼、中美洲、非洲中部[2- - - - - -4]。热水资源的吸引力的特性是生态有着各种各样的生物5和其组件的分子强度6]。

在过去几年,极端微生物的不同类别,嗜热菌(高温)上的嗜酸生物(低pH值),alkaliphiles(高pH值),嗜盐菌(高盐度),和它们(低温)7),在许多领域的研究者所吸引,因为他们承受极端条件下和功能的能力。

嗜热微生物(最佳生长温度50°C或以上)极端微生物中引起了极大关注,因为她们是热稳定的酶的来源(如淀粉酶、多种纤维素酶,几丁质酶、果胶酶、木聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、和DNA聚合酶);这些酶显示出独特的功能,这些功能可适合执行生物技术过程在高温(8]。此外,他们已报告更稳定的对许多溶剂,洗涤剂,酸性和碱性pH值(9,10]。在这些商业上重要的酶是蛋白酶酶:碱性蛋白酶具有的性质非常稳定时用于洗涤剂和蛋白酶酶发现应用程序在洗涤粉等生物产业,食品行业、皮革加工、制药和研究生物学11,12]。此外,纤维素酶酶表现出极大的商业潜力生产葡萄糖的原料从农业纤维素材料13)和生产生物乙醇和增值有机化合物来自可再生农业残留物(14]。各种酶在生物产业有意义的应用;例如,蛋白酶和淀粉酶一起使用在许多行业,如食品工业,洗涤剂行业,药品(15]。另一个重要的酶白明胶酶已经获得药物发展的一个重要目标,因为他们的角色在结缔组织退化与肿瘤转移(16]。

嗜热微生物可分为中度嗜热微生物(最优增长,50 - 60°C),极端嗜热微生物(增长最佳,60 - 80°C),和超嗜热菌(最优增长,80 - 110°C) (17]。嗜热微生物从不同生态区域隔离(例如,温泉和深海)。最高的生物生长温度(103 - 110°C)是属的成员Pyrobaculum,Pyrodictium,海床,Melanopyrus属于古生菌;在子囊菌纲真菌,和接合菌纲类有高增长温度(18),同时,在细菌的情况下,Thermotoga海上和Aquifex pyrophilus展览的最高生长温度90和95°C,分别为(19]。嗜热微生物可分为革兰氏阳性和革兰氏阴性,他们可以在有氧或无氧条件下存在,其中一些可以形成孢子。由于他们的重要性增加,潜在的应用程序,和角色在不同领域,科学家们集中研究发现新属,物种在世界各地(20.- - - - - -22]。

在约旦,有许多温泉在全国不同地区,温度介于30和63°C。他们详细的分布和特征描述在文献[23]。大约有200在约旦温泉遍布全国。主要网站Al Hammah泉北Shouneh,水井,马Zarqa除Al Azraq泉Al Barbitah春天,身兼泉(24]。

虽然兴趣研究嗜热微生物从温泉在约旦已经证明了几个以前的微生物研究,仍然没有持续的研究集中在进一步利用这些嗜热微生物。本研究的目的是建立一个连续筛选研究线,隔离和表征的新extremophilic微生物能拥有高生物技术和环境的潜力。

2。材料和方法

2.1。样本收集和描述

总共有二十个水样收集从温泉使用200毫升无菌热玻璃容器。被选出的五个温泉在约旦收集样本,包括马Hammamat除,Zara死海,Hammamat Afra, Al-Burbita, Al-Hemma。三个复制每个样本取自同一地点相同的位置和三个不同的深度被认为包括10厘米,20厘米,30厘米。温度、pH值和电导率测量通过使用温度计,分别酸度计和热导计。水样本立即用于浓缩在营养肉汤55°C。为期一天的浓缩文化是有营养琼脂和血琼脂基地(HiMedia、孟买)获得独立的殖民地。冷冻袋被用来避免干燥的样品在孵化。描述每个隔离是通过考试的菌落颜色、大小、高度、保证金、质地、色素和绵羊红细胞溶血在5%琼脂媒体,除了革兰氏染色法。

2.2。基因型的研究

2.2.1。ITS-PCR指纹识别转录间隔器

从纯菌株基因组DNA提取使用DNA提取工具(Promega工具包)。DNA浓度测定采用Nanodrop分光光度计(Bio-Rad)。放大的16 s-23s内部转录间隔区(ITS)如前所述执行(25分别]使用通用引物s - d - bact - 1494 - 20 (5′GTCGTAACAAGGTAGCCGTA3′)和l - d - bact - 0035 - 15 (5′CAAGGCATCCACCGT 3′)。1 x PCR反应的放大反应混合物包括缓冲区,2.5毫米MgCl₂0.3毫米0.2毫米deoxynucleoside三磷酸,每个引物1 U Taq DNA聚合酶,1µl的总DNA。PCR程序由一个初始步骤在94°C 3分钟,35周期在94°C的变性45 s,退火为1分钟55°C,和伸长2分钟在72°C,紧随其后的是最终伸长步骤8分钟的72°C。ITS-PCR放大模式迁移0.5 x三羟甲基氨基甲烷borate-EDTA缓冲液和1%的琼脂糖凝胶染色0.5毫克升30分钟⁻¹溴化乙锭的解决方案。ITS-PCR概要文件和菌株相比显示比较概要文件被认为是相同的单体型。

2.2.2。16 s rDNA扩增和测序

据Sambrook基因组DNA提取和纯化和罗素26]。测序的16 s rDNA隔离和放大目标基因的使用普遍的细菌完成底漆1492 r (5′- TAC GGY TAC CTT GTT ACG法案条t - 3′)和域bacteria-specific底漆27 f (5′- AGA GTT TGA中医TGG CTC AG-3′)。扩增的DNA在下列条件下进行:在94°C变性5分钟紧随其后30 94°C的周期30年代,52°C 30年代,72°C 1.5分钟,最终在72°C扩展了10分钟。放大PCR产品的细菌分离分析与1%琼脂糖凝胶电泳。PCR产物纯化使用卡塔尔投资局快速PCR净化设备(试剂盒)。纯化PCR产物测序,Genewiz Inc .)、美国、利用基因分析仪(应用生物系统公司3130 XL,瑞士)。推导出序列受到爆炸算法从国家生物技术中心,马里兰州贝塞斯达美国医学检索基因库的同源序列。系统树是由使用NT系统执行距离矩阵分析。数据库搜索和比较是用爆炸数据库。

2.3。代谢和生化特性的隔离

单是由API测试50慢性乙肝带(BioMerieux, Inc .,法国)利用以下基质:丙三醇、赤藓糖醇,D-arabinose, L-arabinose,核糖,D-xylose, L-xylose,核糖醇,Β-methyl木糖甙、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、L-sorbose、鼠李糖、半乳糖醇、肌醇,山梨糖醇,甘露醇,L-methyl-D-mannoside, D-methyl-D-glucoside, N-acetylglucosamine,苦杏仁甙,熊果苷,七叶树素,水杨苷,纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、龙胆二糖、蜜二糖、棉子糖、松三糖,淀粉,糖原,菊粉,D-turanose, D-tagatose, D-fucose, L-fucose, D-lyxose, D-arabitol, L-arabitol、木糖醇、葡萄糖酸,和2,5-ketogluconate。一百年µl悬浮细菌注入条和孵化在50 - 55°C 48 h。任何改变在黄色的颜色是根据测量设备指令。过氧化氢酶和氧化酶酶研究根据普雷斯科特等描述的方法。27]。

2.4。评估酶的生产

2.4.1。纤维素酶活性

CMC板试验用于检测纤维素酶生产隔离(28]。板块在37°C 5天孵化允许纤维素酶的分泌。孵化后,琼脂培养基是洋溢着水溶液中刚果红1% (w / v)的持续时间15分钟。刚果红溶液被丢弃,盘子被洪水进一步治疗1 M氯化钠15分钟。形成清晰的水解纤维素降解表示带收养谢赫et al。29日]。殖民地与间隙区被镀在最小的琼脂培养基补充1% CMC和孵化37°C和储存在4°C进行进一步的研究。

2.4.2。卵磷脂的活动

卵磷脂酶,10毫升的50%蛋黄加入90毫升的消毒胰蛋白酶的大豆琼脂。白色沉淀的形成或下培养液现货透露卵磷脂形成(30.]。

2.4.3。脂肪酶活性

脂肪酶活性观察到的外观浑浊的光环对大豆胰蛋白酶的接种物琼脂板补充与1%渐变80解释Rollof et al。31日]。

2.4.4。蛋白酶活性

蛋白酶活动检测Muller-Hinton琼脂包含3%的脱脂牛奶。板块中还夹杂着测试菌株其次是孵化24小时37°C。透明带在殖民地的存在表明caseinase活动(32]。

2.4.5。白明胶酶活动

白明胶酶生产检测到刺接种测试压力营养琼脂补充3%明胶保持在37°C 24小时后跟制冷在4°C为30分钟。液化明胶被认为是积极的33]。

2.4.6。淀粉酶活性

淀粉水解方法用于确定淀粉分解的特性。淀粉琼脂板被微生物有隔离在37°C其次是孵化24小时。孵化后,1%碘溶液(刚做好的)淀粉琼脂板上已经被水淹没。蓝色的存在在增长表示负面结果(34]。

3所示。结果

3.1。描述的样品

五个温泉网站在约旦展望2015年9月至2016年3月。温泉位于不同的城市,代表一个中度嗜热嗜热(39.9 -60°C)和中性alkalophilic pH值(7.03 - -8.6)的环境变量导电性女士(0.51 - -3.27厘米⁻¹)。和Zara Hammamat马除温泉与最高温度,pH值和电导率(表1)。

3.2。隔离的形态和生化检查

各种识别测试,例如内生孢子的形成运动性,乏氧生活,过氧化氢酶和氧化酶进行。形态、显微观察和生化试验表明,细菌属于芽孢杆菌sp。所选菌株被观察和生长特性研究(图1)。

形态学,隔离显示一些变化颜色,边缘、形状和纹理的殖民地(表2)。他们是灰色,奶油,白色;不透明或半透明的;粗糙或光滑;规则还是不规则的边缘。殖民地可能出现细皱纹和琼脂表面附着。他们表现出抗体生成α-或beta-hemolytic活动5%。革兰氏染色法的基础上,发现隔离主要是革兰氏阳性和显微观察发现孢子形成杆状细菌排列成链。增长发生在BHI琼脂、营养琼脂和血琼脂但不是MacConkey琼脂。API 50慢性乙肝资料十隔离了表型多样性,和没有十分离共享相同的表型(表模式3)。一个人可以看到,利用碳水化合物变化;例如,应变H4可以利用各种各样的基质,相比仅有可以利用只有四个基板。此外,应变H8是唯一一个与淀粉和糖原产生反应的能力。从分类的角度,应变H1一个有趣的资料由于其无法使用所有API 50慢性乙肝的碳源系统七叶树素除外。

3.3。ITS-PCR指纹分析

ITS-PCR产品通过1%琼脂糖凝胶电泳分析。几个乐队的低迁移率和留在的上部凝胶在明显位置超过600个基点的位置标准。图2显示16 s-23s内部转录间隔区区域的放大使用底漆s - d - bact - 1494 a - 20和l - d - bact - 0035 a - 15。ITS-PCR实验重复三次使用不同提取DNA扩增。放大产品一贯的电泳分析显示两到四强烈,锋利的乐队为每个样本(主要片段),从300年到600年不等的基点。主要乐队的乐队的区别的基础上,隔离被分成10个单。图2显示了十代表- PCR模式的样本。

3.4。分子识别的隔离

最后的识别和隔离的系统发育分析评估了16 s rDNA测序。十个单的16 s rDNA序列与他们密切相关的参考细菌序列从基因库,获得基本的局部比对搜索工具(爆炸)计划。序列分析显示高相似性与参考株基因库中可用的数据库。的16 s rDNA序列比对发现,隔离H2-H10物种内的下降地衣芽孢杆菌与温和的序列相似,这表明它们可能是潜在的新亚种。然而,序列分析显示一个强烈的相似性(99%)之间的测试应变H1和基因库的代表菌株Thermomonas hydrothermalis。

的结合ITS-PCR指纹和16 s rDNA基因测序技术允许十隔离物种的识别水平。结果显示一个明确的属的统治芽孢杆菌由地衣芽。不同温泉在约旦覆盖广泛的地理区域。基于16 s rDNA序列比对,分离的菌株的系统发育树构建(图3)。H1隔离显示相似的序列Thermomonas hydrothermalis(99%),而H2 H10概要文件对应地衣芽。。

3.5。细胞外酶的生产

细菌隔离从温泉收集筛选淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、白明胶酶,纤维素和卵磷脂活动(图4)。十个确认单中,至少有一个胞外水解酶是由每个隔离。七个分离株(70%)产生淀粉酶、2隔离(20%)生产的蛋白酶,6白明胶酶产生隔离(60%),6隔离产生纤维素(60%),8隔离卵磷脂酶产生的(80%)。没有观察到的脂肪酶活性之间的隔离。此外,1隔离(10%)5个测试酶相结合,4隔离产生三种胞外酶(40%),1例(10%)隔离产生了两种酶,和2隔离产生一个酶(20%)(表的筛选4)。SPSS酶活性之间的相关性和各种生化测试用于表征的十个单估计统计(表5)。进一步说明酶活性,酶配置文件的系统树图H1-H10隔离了使用MVSP v3.2软件,基于UPGMA方法和Jaccard系数(图5)。

4所示。讨论

温泉代表极端环境的原始质量是维持一段时间。存在地球上的陆地温泉(35代表不同寻常的生命形式的热点,基因和代谢产物。自从托马斯·布洛克发现的存在水生栖热菌在黄石国家公园的热喷口,大量的研究者们调查了世界各地类似的环境。地球我们现有充斥着各种各样的微生物,研究人员仍远离能够完成他们的标识和隔离,这导致强化和扩展进行研究,为了充分调查这样有前途的微生物。

全球地热领域对嗜热生物的栖息地是有限的数量限制的网站。在约旦,有几个温泉而闻名振兴和药用品质。气温往往高于40°C。在这些条件下生物不得不应对极端温度、湿度低、低可用性的营养成分。这些条件减少生物多样性但一些细菌的生存策略,以适应这种压力。在这项研究中,总共十个菌株分离出不同的温泉编码的形式H1-H10然后受到各种形态、生化、分子和生理测试。所有隔离除了H1和孢子形成的杆状革兰氏阳性形态(图1)。菌株能够生长的温度50°C。因此,他们可以归类为嗜热细菌根据布鲁克(36],佩里和Staley [37),Souza和马丁斯(38]。分离的菌株形态和微观特征的九是类似于属的特征芽孢杆菌,被戈登et al。39)和Souza,马丁斯(38]。

属芽孢杆菌从所有探索站点被隔离;的存在芽孢杆菌在所有的采样位置的能力可能是由于这个属高和他们的抵抗恶劣的环境条件40),除了适应热环境(22,41]。菌株的芽孢杆菌一直在主导研究由不同的人员交叉世界。例如,97.5%的菌株恢复了Aanniz et al。22从摩洛哥温泉属于这类。此外,Maugeri et al。2]孤立87高温厌氧、有氧和孢子形成的细菌从伊奥利亚群岛(意大利),保留的优势种的属芽孢杆菌。此外,高温芽孢杆菌从约旦新毒株温泉Abou-Shanab报道(42]和Malkawi al omari [24]。

在目前的研究中,结果从ITS-PCR和16 s rDNA十分离分析。基于爆炸对齐这些隔离基因库序列,系统发育树构建(图3)。这允许十隔离物种水平的识别。在这些隔离,其中9个(H2-H10)属于物种地衣芽。与温和的序列相似度(25 - 67%),其中一个隔离显示强烈的相似性属(99%)Thermomonas hydrothermalis。系统发育树来自16 s rDNA,除了不同菌株的形态学和生理行为(H2-H10)(表2和3),显示亚种之间的存在的可能性地衣芽。。变种亚种基因型是术语表达微观不均一性的概念在一个物种。亚种的意义似乎允许的可能性显著重要的表型和生态位分离株之间的差异43]。然而,传统方法包括形态学和生化特征用于识别隔离的麻烦,有时候结果很难解释。测序获得的信息能够识别出10个单物种水平。

这些研究结果是一致的与其他研究由De Clerck和德沃斯(44];伯吉斯et al。45];和Aanniz et al。22]。此外,Manachini et al。46在182]报道三个不同的组地衣芽。菌株孤立。同样,这一毒株从不同的温泉也被孤立在世界范围内,如印度(19- - - - - -47],摩洛哥[48)、土耳其(4],宝格丽[49)和印度尼西亚(50]。在约旦,先前的发现报道的隔离嗜热细菌属于芽孢杆菌属。例如,一个耐热性的蛋白酶生产杆菌、已经从美没有孤立的温泉在约旦河谷的北部[51]。此外,Geobacillus物种被孤立,特点是Obeidat et al。52),以确定他们的酶的活动。

这显然是发现所有被研究约旦温泉填充在这项研究中被发现地衣芽孢杆菌物种。低多样性中观察到我们的研究可能相关的高温等环境条件和营养状况的增长芽孢杆菌地层水的温泉。以前的研究显示在温泉越来越多样性,减少温度(53]。五个温泉在约旦的微生物多样性研究Malkawi和al omari24)利用微生物和分子的方法。大部分的孤立的报道是革兰氏阳性细菌棒(94.7%)和(90.9%)属于属芽孢杆菌。

生态环境建立在温泉知道是中度到高温度和营养物。这些水域,从下面涌出地面,形成一个孤立的环境中从一个生物地理的的观点。属的菌株芽孢杆菌还能很好地适应热环境。通常他们也简单的营养需求。因此,他们能够在贫瘠环境如盐沼,温泉,和沙漠土壤(54]。

另一方面,在这项研究中有趣的发现,应变H1的隔离,是由16 s rDNAThermomonas hydrothermalis;没有先前报道的隔离从温泉在约旦应变;此外,全球一些报告关于这一毒株是可用的。属Thermomonas,属于家庭Xanthomonadaceae首先建立和描述会et al。55]。本属植物包括五种孤立从广阔的栖息地,高岭土泥浆(类型的物种,Thermomonas haemolytica(55]],一个温泉Thermomonas hydrothermalis(56]],一个脱氮反应器(Thermomonas短和Thermomonas fusca(57]],人参字段(Thermomonas koreensis(58]]。Thermomonas hydrothermalis从温泉孤立首次在葡萄牙中部圣Gemil [56]。这是密切相关Thermomonas haemolytica但有一个高于这个物种的生长温度范围。这一毒株被形容为革兰氏阴性,杆状细胞。细胞是不动的,它们形成浅棕色颜色菌落直径0.5 - 2.0毫米,扩散性的棕色色素在旧文化。最近,这个略嗜热细菌分离从地热区域在土耳其4]。因为没有很多报道关于这些隔离,这使得它成为了一个引人入胜的菌株进一步追究其生物技术和环境的应用程序。

的一个重要潜力的嗜热微生物酶的活动;由于他们的能力在切断条件如温度、pH值、和压力,这将加强工业和生物技术领域的重要性。这种酶可以隔绝extremophilic微生物。这表明,菌株可能已经开发出特殊机制的基因和生理上能利用有机物,通过酶生产(48),除了采用系统的可能性,这些微生物的生存在这样的条件下和任何可用的营养素的吸收。微生物具有耐热性的酶有许多有吸引力的特性,比如能力减少微生物污染的可能性在大规模工业反应和长时间工作59,60]。

在这项研究中,没有一个十隔离脂肪酶是积极的,而六的纤维素酶阳性(包括H1),和两只蛋白酶是积极的。UPGMA构建的系统树图的十个菌株的酶的特征从五个温泉显示三个集群分离(A、B和C)。第一个集群(A)包括一个隔离相应表型P1和单体型(H2)。第二个集群(B)也包含一个分离株代表表型P2。最后一个集群(C)可以分为七个分支对应于6不同的表现型(P3 P9)。表型P3, P4, P5、P6 P8,和票数被代表,分别隔离的单体型H8、H9, H3, H7, H5和H1。表型P7重整旗鼓的两个隔离两种不同单(编辑和H9)。根据获得的系统树图结果,十个分离株表现出高的表型多样性研究。

H5和H8观察正相关,与蛋白酶生产能力利用阿拉伯糖、核糖、木糖、山梨糖、甘露醇、甘露糖甙、淀粉、糖原和海藻糖(P< 0.05)。然而,纤维素酶,卵磷脂酶和淀粉酶产生的地衣芽b菌株和t . hydrothermalis呈负相关(P< 0.05)与一些生化测试表明隔离高纤维素酶,卵磷脂,树胶醛醣代谢能力和淀粉酶活性低,核糖、木糖、甘露糖醇、甘露糖苷,淀粉,糖原,和海藻糖,反之亦然。

芽孢杆菌菌株研究了密集的能力产生非常重要的thermoenzymes [61年]。是观察到细胞外酶菌株之间的排泄的变化(H2-H10)证实的亚种的存在地衣芽孢杆菌。与其他报道关于淀粉分解的结果是一致的,蛋白水解和cellulatic活动(22,62年]。然而,之前没有详细的酶配置文件可用Thermomonas菌株除了Baltaci等的研究。4],它报道积极的淀粉酶和脂肪酶活性和消极的纤维素酶,这是与获得的结果在我们的研究中,在应变显示积极的纤维素酶活动但消极脂肪酶活性。这鼓励进一步的研究进行进一步的酶分析应变在未来。

5。结论

嗜热细菌地衣芽孢杆菌和Thermomonas hydrothermalis被孤立,他们初步的酶潜在的特点。这是第一次报告的隔离Thermomonas从约旦温泉应变。表型的多样性和酶分析中地衣芽。菌株表明亚种的存在。这些可喜的成果可以进一步利用生物技术生产的重要和工业热稳定的酶。本研究扩大的机会进行进一步的研究来探索更多的这些菌株的巨大意义Thermomonas隔离,缺乏深入研究关于这个有机体。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者承认金融支持院长以来德国约旦大学的科学研究在研究批准号导弹的14/2015。

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