持久性有毒发酵活性提取物苏云金杆菌var. israelensis超过三十年后的存储

文摘

本研究进行了确定持久性发酵提取物的毒性苏云金杆菌var。israelensis经过三十年多的存储空间。为此,人口埃及伊蚊成立。死亡率20 spore-crystal提取纯化使用acetone-lactose共沉淀法测定和评估生物根据修改后的协议。死亡率最高的提取测定LD一式三份₅₀和LD_98年。所有提取显示毒性最高剂量(1000 ppm)和一些测试,如菌株3260和3501年,仍然杀幼虫剂低至0.01 ppm。这些数据是令人惊讶的,因为没有研究的活动b基因毒性蛋白经过这么长时间的存储时间已经被报道。

1。介绍

蚊子今天代表的一个最严重的公共卫生威胁,因为它们hematophagous性质和向量的能力。等属伊蚊、按蚊、和库蚊,传播病原体和寄生虫(病毒、原生动物、或线虫)导致毁灭性的疾病,如登革热、Zika病毒,基孔肯雅热、脑炎、黄热病、疟疾、象皮病,负责高发病率和死亡率在几十亿人分布在几乎一半的地球(1- - - - - -6]。

需要更多的环保杀虫剂和抗化学物质的增加提供了一个极好的机会与生物制品基于消灭蚊子苏云金杆菌var。israelensis发言)。这些细菌保护parasporal H-14血清型的晶体和孢子,当摄入的蚊子幼虫中肠的可溶性在碱性环境中。这导致晶体的杀虫蛋白的激活与受体结合的细胞壁,形成肠道毛孔,导致幼虫死亡。这四个毒素产生的杀虫效果称为Cry4A, Cry4B Cry11Aa, Cyt1A。他们的主要属性是高毒性和特异性对家庭蚊科(7- - - - - -9]。

发现和描述以来Goldberg和玛格10),发言显示非凡的有效性在杀死蚊子,相比之下其对人类和其他哺乳动物无害,水生脊椎动物、无脊椎动物和植物。由于这些特点,商业准备这些细菌已被选定为蚊虫控制程序(11- - - - - -14]。Dulmage et al。15)是最重要的先驱技术实施的发展发言作为生物防治剂。他们建立了多元化的方法来大规模生产,产品配方和标准化。从这些过程,数百发酵提取的文化属于这种微生物,以他们的杀虫双翅类的活动,捐赠了1989年由美国农业部研究小组。从那时起,这些提取物已经被保存在新莱昂州大学(UANL)国际昆虫病原细菌的集合。特别重要在这个集合是20发酵提取物,我们决定利用这个研究来证明他们的能力杀死蚊子在实验室条件下通过他们的剩余活动。

2。材料和方法

2.1。发言菌株

发言发酵提取物的集合Dulmage et al。15]恢复了lactose-acetone共同沉淀从1978年到1983年期间被选择。在此期间,在黑暗中提取被存储在干燥空间专门为这个目的 °C在无菌和密封的瓶子。二十四到的样本的高清hd - 500和25 - 567在显微镜下观察用一个简单的Coomassie蓝染色确定污染(图的缺失1)。然后他们被激活在培养皿和孵化BD Bioxon营养琼脂72小时来展示他们的可行性,随后,样本显示的可行性选择。

2.2。蚊子

第三和第四龄的幼虫埃及伊蚊用于这些实验得到的饲养的昆虫生物技术学院的生物学研究所UANL。这蚊子永久殖民地是在无菌条件下保持在28到30°C和60 - 80%相对湿度和光/暗周期12 h。在这些条件下,周期从鸡蛋到成人是在三到四个星期完成。幼虫每天与presterilized细碎的喂食狗粮(血统的品牌)。蛹被移除的日常控制蚊子的年龄和放置在一个容器引入笼子里为48 h成年蚊子的出现。使用不同大小的笼子里根据蚊子种群的大小,这是美联储每日用10%葡萄糖溶液浸泡在棉签和每3天血源10分钟。产卵的雌性是刺激与ovitrap组成的水容器覆盖着褐色的纸。收集鸡蛋被转移到托盘繁衍周期以这样一种方式,幼虫在所有可用的实验中使用。

2.3。标准制剂

作为一个积极的控制(死亡率100%),主要标准是准备从VectoBac®3000泌尿道感染/毫克(化合价的生物科学公司正是因为,IL)浓度为0.05 ppm。这是放置在与营养琼脂培养皿。肉汤被转移到营养肉汤和孵化30°C 150 rpm的12个小时,直到一个光密度大于1 (2×10⁸CFU /毫升),用分光光度计测量的波长540 nm,。1毫升一式三份的整除加入500毫升和100毫升的厄伦美厄烧瓶发言介质(未发表的实验介质)来验证提取的效力。蒸馏水是用作负控制(图1)。

2.4。生物分析

世界卫生组织指南实验室生物细菌杀幼虫剂随访(16]。悬浮液的发酵提取准备在厄伦美厄烧瓶内的2000 ppm。稀释而后获得最终浓度的1000年,100年,10日,1,0.1,和0.01,分别。用透明塑料杯250毫升容量150毫升每船和25幼虫的第二或第三阶段添加(图1)。计算LD₅₀发酵提取的三名2%,50%,98%的人准备的。积极的控制进行复制的主要标准。结果列表根据剂量,考虑活和死蚊子的数量每治疗4复制一式三份在24小时内完成。计算LD₅₀线性回归应用使用R统计软件包,201517]。生物进行至少三次,结果的有效性评估主要从VectoBac提取获得。

3所示。结果

49岁的发言发酵从集合中提取,只有20仍然包含孢子蛋白质晶体;因此,只有这些是用于生物分析。死去的幼虫被数每6小时在24小时内(表1)。在这种情况下,幼虫死亡包括计算死亡率。大多数的这些发言提取了一些有毒的活动对蚊子的幼虫在较高浓度下,但他们的活动减少稀释增加(表1)。因此,在1000 ppm, 18提取设法杀死幼虫在某种程度上;事实上,10提取物100%有效。这个趋势观察到100 ppm,只有从应变3299无法杀死所有测试昆虫,但在提取10 ppm只有5维护这个力量。观察到一个有趣的事实是提取的3260株。即使在浓度为1和0.1,保持其有毒活动改变杀死所有的幼虫。然而,在更高的稀释(0.01 ppm),提取无法维持其剩余活动(图2)。值得注意的是,有毒的活动的商业产品,VectoBac,从它产生的实验室制备(VA)是维持在最低浓度在我们的实验条件下,菌株3260和3501一起还显示一致的能力杀死蚊子的幼虫在最低浓度。因此,LD₅₀和LD_98年是和 ; 和 ;和和 ppm VectoBac, 3260年和3501年分别(图3)。


治疗	死去的幼虫
	浓度(ppm) /时间(h)
	0.01					0.1					1					10					One hundred.					1000年
	1	6	12	18	24	1	6	12	18	24	1	6	12	18	24	1	6	12	18	24	1	6	12	18	24	1	6	12	18	24

	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
2858年	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
3826年	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
3859年	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
3350年	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1	2
3549年	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	2	3	4
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3356年	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	2	4	6
3824年	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1	3	6	8
3552年	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1	2	6	10
3825年	0	0	0	0	0	0	0	0	1	3	0	0	2	4	5	0	0	2	3	6	0	1	2	5	9	0	3	5	8	12
3299年	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	2	8	14	19	23
3779年	0	0	0	0	0	0	0	0	1	1	0	0	1	4	5	0	1	3	7	11	4	11	17	21	24	8	20.	25	25	25
3353年	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1	1	2	0	2	6	9	10	0	6	15	22	25	11	23	25	25	25
3691年	0	0	0	0	0	0	0	0	3	5	0	0	1	4	13	0	4	12	19	24	2	12	22	25	25	23	25	25	25	25
3505年	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	2	4	5	8	20.	25	25	25	25	25	25	25	25
3857年	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	1	2	14	24	25	25	25	25	25	25	25	25
3756年	0	0	0	0	0	0	0	0	1	1	0	0	2	4	5	4	9	18	21	24	13	25	25	25	25	25	25	25	25	25
3696年	0	0	0	0	0	0	0	0	1	4	0	0	3	5	8	0	5	14	19	23	9	25	25	25	25	25	25	25	25	25
3501年	0	0	0	0	0	0	0	0	2	6	0	2	6	10	13	14	24	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25
3260年	0	0	1	3	3	2	8	10	10	13	16	25	25	25	25	23	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25
弗吉尼亚州	16	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25
风投	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25

表明平均四个复制三个独立的实验;表明蒸馏水。弗吉尼亚州:激活VectoBac;风险:商业VectoBac。

4所示。讨论

我们的发现证明持久性有毒发酵提取的活动发言对埃及伊蚊经过30年的存储。所有提取研究显示毒性测试最高剂量(1000 ppm)和一些提取,从菌株3260和3501年,仍然杀幼虫剂低至0.01 ppm。这些数据是令人惊讶的,因为没有研究到目前为止已报告的活动b基因毒性蛋白经过这么长时间的存储时间。另一方面,少数报告持久性字段或毒性的受控条件下显示,这些蛋白质迅速失去杀虫特性由于不同的原因。环境因素中影响毒性的持久性是温度(18),太阳辐射(19],pH值[20.),和有机物质21]。然而,其他作者表明,一些条件有利于提高持久性的可能性。例如,Saxena et al。22)表明,哭Bt玉米根分泌蛋白质保持杀灭幼虫的土壤中活动超过180天,而Tapp和Stotzky [23]报道这种有毒的能力超过234天后并入土壤。这可能是由于他们的绑定的粘土颗粒多孔矩阵。在我们的例子中,发言蛋白质晶体的测试提取了超过三十年的乳糖发酵提取的矩阵obtention期间使用。这表明这二糖的重要作用可以保持不同的毒性蛋白的活性发言这段时间后压力特别稳定。在其他种类的细菌来自同一发酵提取物(未发表的数据)的集合,其保护机制仍然是不确定的,不出现同样的效果。虽然活动的提取发言被发现很低VectoBac治疗相比,值得注意的是,大多数剩余活动保持在最高浓度测试,和两种提取物的最低浓度可以杀死蚊子的幼虫。这是一个令人鼓舞的迹象的可能性提高特殊菌株的使用和改进配方控制疾病的昆虫。

5。结论

发酵提取物苏云金杆菌var。israelensis保持残留有毒的活动埃及伊蚊幼虫后存储在 °C在上述条件超过三十年。提取3260年和3501年显示出LD₅₀分别为0.12和1.16 ppm。这项工作表明,发言蛋白质晶体可延长保质期的毒性或字段条件在特定条件下。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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