文摘
螃蟹的细菌学的质量从三个不同的红树林(Itaoca,六月,Piedade)从里约热内卢,巴西,使用传统和分子方法研究。结果显示高总大肠菌肉和肝胰腺样本。PCR分析确定25大肠杆菌殖民地的Itaoca Piedade,六月样本,检测产肠毒素的13个殖民地和9 enteroaggregative殖民地。分别为12、11和21弧菌parahaemolyticus菌株被发现Itaoca Piedade,六月样本。两个霍乱弧菌菌株在Piedade检测样品。的大肠杆菌菌株孤立在目前研究显示耐庆大霉素。大肠杆菌从Piedade样本显示,33%菌株耐氯霉素和几种抗菌药物的菌株也显示multiresistance 3月指数从0.12到0.31不等。弧菌从Piedade菌株,Itaoca,六月显示,86%,78%,和85%的阻力,分别对氨苄青霉素。孤立的弧菌菌株显示multiresistance几种抗菌药物,3月指数从0.12到0.25不等。这些生物的存在在蟹肉是微生物污染的迹象,这可能对消费者构成健康风险当不熟。
1。介绍
巴西ca。8500公里的海岸线和第二个地球上最大的红树林面积(1]。这些红树林遭受广泛的沿海地区城市化和工业化,而且,这些年来,广泛的生态系统已经消失,结束他们的许多重要的功能,比如缓冲对海岸侵蚀,保留一些污染物,渔业领域(2]。
螃蟹十足类动物的甲壳类动物富含钠、钾、磷和大量的铁、锌、铜和锰。他们还存在高浓度的维生素A、C、B6、硫胺素、核黄素和在世界上的一些地区被认为是一种美食(3]。沿着巴西海岸,螃蟹河口地区最重要的自然资源之一,可以强烈地剥削没有达成过度捕捞的阈值,这主要是因为女性的挑选方法可以识别个体,不同的大小与男性相比,和回他们的释放到环境中4]。
在大型和各种各样的红树林产品在巴西北部和东北部河口,红树林蟹,Ucides cordatus,是最收获,最高的商业和生活重要性沿海人口的农村家庭(5]。环境质量,以及产品的收集和处理方式,可能会影响微生物的数量和多样性存在表面的海鲜和渔业产品,这可能会导致增加微生物污染(6]。
旁边的关注有关人类排泄物污染的食物从海洋生态系统,从1960年代末开始各种来自河口和海洋水域的土著细菌也被认为是潜在的人类病原体。它们可以集中在贝类,展示人类健康风险(7]。的主要问题是关于几个种类弧菌,如弧菌parahaemolyticus。最近的研究还发现了贝类的来源霍乱弧菌,创伤弧菌和其他弧菌物种在人类感染的情况下(8]。这些人类病原体可以在低温下生存和发展,海洋生态系统的特点。
弧菌s是革兰氏阴性细菌,主要是与河口和沿海海洋环境有关。许多物种在人类肠道或extraintestinal感染相关。所有弧菌年代Na的绝对要求+经济增长虽然有些,比如霍乱弧菌,只需要微量。只有一小部分的弧菌年代属于物种在人类潜在的致病性,其中,只有一小部分可能具有致病性的特质,使他们开拓并导致人体发病(9]。
海洋弧菌年代自然污染双壳类软体动物已经被证明很难移除比粪便细菌指标,通过净化等大肠杆菌(10]。因此,这样的处理方法可能不提供必要的公共卫生保护水平显著水平的致病性弧菌年代中收获的产品。
大肠杆菌是一个共生的微生物的利基是哺乳动物结肠的粘膜层。它是最丰富的人类肠道微生物区系的兼性厌氧菌(11]。此外,大肠杆菌广泛分布在肠道的温血动物(12]。大肠杆菌通常是不致病的,虽然不同的菌株可能导致胃肠道疾病,尿,或中枢神经系统13]。目前,六个类别的diarrheagenic大肠杆菌已经承认:产肠毒素的吗大肠杆菌(ETEC) [14),致肠病的大肠杆菌(EPEC) [15),enteroinvasive大肠杆菌(EIEC) [16),肠出血性大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌、志贺产毒大肠杆菌或STEC)17,18),enteroaggregativeE。杆菌(EAEC或EAggEc) (19],广泛地附着大肠杆菌(DAEC) [20.]。尽管不是很常见,diarrheagenic的隔离大肠杆菌从海鲜已经被报道。在巴西,Ayulo et al。(1994)21]孤立只有一个应变STEC的贝类和预防措施给证据,特别是在收获和采后的任何性质的主要重视避免污染。
检测病原菌的海鲜是必要的,以确保消费者安全产品,可持续鱼和贝类生长活动。分子诊断方法在过去的几年里经历了显著的发展,现在成为有用的和可靠的方法允许病原体的快速探测和识别。分子检测、识别和枚举弧菌种虫害在很大程度上是基于PCR扩增核酸纯化后的样品。虽然更敏感、更耗时,DNA或寡核苷酸probe-based杂交方法检测提出了弧菌种虫害的食品(22]。
,存在潜在的病原分离(弧菌和大肠杆菌菌株)Ucides cordatus螃蟹的瓜纳巴拉湾,里约热内卢,巴西,据报道,使用传统生化鉴定和分子(PCR)方法。抗生素敏感性的隔离也被评估。
2。材料和方法
2.1。研究区域
红树林为本研究选择位于Itaoca(贡萨洛)Piedade(法师),和六月(法师),在瓜纳巴拉湾,里约热内卢,巴西,这对营销是甲壳纲动物的收集更强烈。
2.2。样品收集
三十活蟹(Ucides cordatus)收集2012年3月至2014年6月在每个红树林研究。这些样本分析大学在环境微生物学实验室的里约热内卢州(里约州立)。螃蟹是洗去除多余的沉积物和其他杂质出现在他们的身体。内脏和肉被无菌钳和手术刀,放在无菌培养皿中。25克的每个样本与缓冲蛋白胨水225毫升、混合和悬浮液转移到均质器包(跨学科,圣名,法国)和耦合到一个三角胸衣®400循环器(西沃德,沃辛,西萨塞克斯郡,英国)在260 rpm 1分钟(23]。悬浮液serial-diluted从10−6到100和100年μL(每个稀释转移到特定的培养基配方。
2.3。蟹的微生物分析样本
测试用于的决心大肠杆菌和弧菌种虫害建立在食品微生物检验的方法。提供的参考菌株作为控制Oswaldo Cruz基金会,巴西里约热内卢。
2.3.1。粪便大肠杆菌群分析
25克的组织都沉浸在225毫升的乳糖肉汤(Himedia®,孟买,印度)48小时35°C。随后,10−1到10−4与9毫升生理盐水稀释进行十二烷基硫酸盐后接种的肉汤(Himedia,孟买,印度)35°C 24 h。一个100μL整除的积极管十二烷基硫酸盐肉汤(Himedia,孟买,印度)转移到一个相应的管包含3毫升的EC肉汤(Himedia,孟买,印度)与5杜伦管24小时与一系列的稀释和复制水浴44.5°C (23)确定或然数(最可能数)大肠杆菌细菌计数。
2.3.2。大肠杆菌检测
一个100μL整除被撤管包含3毫升的积极EC肉汤(默克®,达姆施塔特,德国)和转移到琼脂板含EMB(默克公司,达姆施塔特,德国)。盘子被孵化24小时37°C。的假定大肠杆菌种虫害殖民地提交生化测试:SIM (Sulfide-Indole-Motility) (BioBras®,米纳斯吉拉斯,巴西)、柠檬酸(柠檬酸Simmons) (Difco®,火花,马里兰州,美国),和先生/副总裁汤(甲基红/ Voges-Proskauer)(默克公司,达姆施塔特,德国)24]。
2.3.3。弧菌spp。检测
25克的蟹肉和内脏都沉浸在225毫升的乳糖肉汤(Himedia,孟买,印度)48小时35°C和转移到1毫升管包含BHI(心脏大脑灌注)(Himedia,孟买,印度)的1%和3%氯化钠和孵化24小时在37°C。一个100μL整除被转移到盘子包含tcb琼脂(Himedia,孟买,印度),孵化24 h在37°C。的假定弧菌种虫害殖民地提交生化特性测试:氧化酶试验,Oxidation-Fermentation(的)(Difco、火花、马里兰、美国),肌醇(美国马里兰州Difco,火花),和O129 (Celon-Lab®, Madhapur,海得拉巴,印度)(25]。
2.4。分子分析
2.4.1。DNA提取
DNA制备进行了热冲击方法收获的殖民地。殖民地种植3毫升的BHI肉汤后24小时在37°C。一毫升的媒介被转移到无菌埃普多夫管和离心10分钟12000 g。浮在表面的丢弃,颗粒在400年resuspendedμL纯无菌水。均质化后,上层清液煮10分钟,在冰上冷却5分钟,然后收集并用于PCR分析(26]。
2.4.2。PCR扩增的大肠杆菌毒力基因
使用多路JMS1 PCR进行,LT,寡核苷酸VirA,实验性自身免疫性脑脊髓炎和PCR-uniplex AggRks和EAST1寡核苷酸(表1)。25的反应包含最后一卷μL包含5μL模板DNA,缓冲(10倍),MgCl 10毫米核苷酸,25毫米22 U Taq(表达载体技术®,圣保罗,巴西),每个引物和10毫米(表达载体技术,圣保罗,巴西)。反应的条件是94°C 5分钟,30 1分钟的周期在94°C,在58°C, 1分钟2分钟在72°C,和最后一个周期10分钟72°C的反应。PCR扩增子可视化在2%琼脂糖凝胶沾3μL(溴化乙锭(0.5 mg毫升−1)、可视化在紫外线透照器(Uvitec®,剑桥,英国),和photodocumented“宝丽来”(佳能®,圣保罗,巴西)。
2.4.3。PCR扩增的弧菌sp。基因
执行的反应是使用多路复用寡核苷酸在最后的20倍μl .混合物包含2 U Taq(表达载体技术,圣保罗,巴西),10毫米核苷酸,MgCl缓冲区(10倍),25毫米23μL模板DNA, 10毫米引物(sodB, sodB flaE, hsp,和16 s)(表2)[28]。反应的条件在93°C 5分钟后跟35周期92°C的40年代,57°C, 1分钟和72°C 1.5分钟和最后一个周期在72°C 7分钟,所有的反应。PCR扩增子可视化在2%琼脂糖凝胶沾3μL(溴化乙锭(0.5 mg毫升−1),显示在紫外线透照器(Uvitec,剑桥,英国),和photodocumented“宝丽来”(佳能、圣保罗,巴西)。
2.5。抗生素敏感性试验
微生物的接种浓度相当于0.5麦克法兰单位(Probac®,德班,南非)到穆勒辛顿琼脂板(美国马里兰州Difco,火花)。抗生素光盘放置在盘子和孵化一夜之间在37°C。抑菌圈解释根据临床实验室标准M100-S22指南(29日),原名国家临床实验室标准委员会。接受测试的抗生素氯霉素(30μ四环素(30克)μg)、庆大霉素(10克)、阿米卡星(30μ甲氧苄氨嘧啶g),妥布霉素(10克),(1.25/23.75μg),头孢菌素(30μg),氨苄青霉素(10克)、头孢他啶(30μg)、头孢噻肟(30μg)、头孢吡肟(30μaztreonam(30克)μg)、头孢西丁(30μg), imipenem(10克),ampicillin-sulbactam (10μ十国集团μg)和环丙沙星(5克)。质量控制,大肠杆菌写明ATCC 25922和大肠杆菌写明ATCC 35218在相同条件下进行测试。
对菌株确认为弧菌spp,执行的测试是根据标准文档M45-A2 [29日),用于抗生素相同的磁盘大肠杆菌英国汉普郡(Oxoid®),除了妥布霉素(10克)和aztreonam (30μg),外加左氧氟沙星(5克)、氧氟沙星(5克)。
抑制晕测量的帮助下一个毫米的统治者。
3所示。结果
3.1。粪便大肠杆菌群
高浓度的粪大肠杆菌群(6.2×102和7.2×102NMP g−1)被发现在肉类和肝胰腺Itaoca红树林样品,分别。Piedade样本和六月红树林显示浓度为2.4×102和3.2×102NMP g−1分别在肉类样品,和2.5×102和3.5×102NMP g−1在肝胰腺样本,分别。耐热的大肠杆菌中没有观察到显著差异值在肉类和肝胰腺红树林之间的样品()。
3.2。大肠杆菌检测
多重PCR鉴定了4毒性基因(eaeA,stx1,lt,virA(图)的单一反应1)。
46个大肠杆菌殖民地孤立的蟹样本不同红树林(21从肉类和25个殖民地从肝胰腺)经生化测试。生化特性后,分子测试(PCR)透露,25(54.3%)呈阳性研究毒性基因,9展示eastA(36%)、13展示lt(52%)和3呈现stx(12%)。没有殖民地呈现virA,eaeA,圣,gg基因检测(表3)。
14大肠杆菌从Itaoca菌株分离,毒性基因的存在,2呈现stx1(肝胰腺),7展示lt在肝胰腺在肉类和3(4),和5呈现eastA肝胰腺中的肉和1中(4)。从六月八株抽样检查中检测出红树林,4株显示的地方lt毒力基因在肝胰腺肉和2(2)和4株显示东毒力基因在肝胰腺肉和2 (2)。13株的样本被检测出Piedade红树林通过生化测试,但只有一个显示的存在stx1毒力基因(肉),而2显示的存在lt毒力基因(肝胰腺)。
3.3。弧菌spp。检测
六月红树林样品显示发病率最高的孤立弧菌(46),其次是Piedade(40)和Itaoca (33)。一百一十九年弧菌90年菌株经PCR样本(肉:68,肝胰腺:51)。本研究确定了5种不同的基因,一个用于弧菌种虫害种类和物种(图42)。类似的研究是由格兰et al。(2010)30.使用多重PCR(识别)gyrB和pntA基因)来区分诉parahaemolyticus,霍乱弧菌,创伤弧菌和其他弧菌种虫害的鱼。
在研究弧菌属,61.3%(73/119)的样本检测只用16 s弧菌科家族的基因。致病菌株霍乱弧菌和诉parahaemolyticus被发现的频率为1.7%(02/119)和37%(44/119),分别为(表吗4)。霍乱弧菌只有螃蟹样本中发现Piedade红树林。发病率最高的诉parahaemolyticus观察样品的六月红树林(21),其次是Itaoca(12)和Piedade (11)。
没有诉mimicus和创伤弧菌在目前的研究中发现(表吗4)。
3.4。抗菌药物敏感性试验
电阻的结果显示在表中5。26大肠杆菌菌株显示一些电阻测试抗菌素,高阻力指数。大肠杆菌菌株分离Itaoca样本显示高阻(63%)对庆大霉素(CN)和妥布霉素(TOB)。
大肠杆菌菌株在Piedade Itaoca,六月显示耐庆大霉素(66%、63%和22%,分别地。)。的大肠杆菌隔离的Piedade样本显示,33%抗氯霉素(C),只有Piedade红树林的菌株中发现螃蟹显示阻力(16%),氨苄青霉素(AMP)。不耐阿莫西林+克拉维酸(AMC),左氧氟沙星(LEV)、头孢西丁(CTX)、氧氟沙星(OFX)和环丙沙星(CIP)被观察到。
在26日耐大肠杆菌菌株,12是对两种或两种以上的抗生素(表6)。这种模式主要是由于滥用抗生素,可能会对人类健康造成严重的影响31日,32]。的大肠杆菌菌株显示multiresistance几种抗菌药物,3月指数从0.12到0.31,而3株显示3月指标从0.12到0.25和3株3月0.18(表的索引6)。26的阻力大肠杆菌菌株分布如下:12株耐庆大霉素和妥布霉素,4对阿米卡星,头孢菌素,3耐环丙沙星,四环素、头孢他啶、头孢西丁、一株抗氨苄青霉素。
当119年弧菌菌株进行了分析只有72隔离(60.5%)显示阻力的一些测试抗菌素,与更高的利率在那些远离螃蟹Piedade样本(29),其次是Itaoca(23)和六月(20)(表5)。的弧菌菌株从Piedade Itaoca,六月显示抗氨苄青霉素(86%、78%和85%,分别地。)。从六月显示,5%菌株耐阿莫西林+克拉维酸(AMC),氨苄西林/ sulbactam(山姆),和氯霉素(C)。Piedade菌株显示抗左氧氟沙星(LEV)和环丙沙星(CIP)。不耐头孢西丁(CTX)、头孢他啶(CAZ)、妥布霉素(TOB)和四环素(TE)观察。
弧菌菌株分离出螃蟹显示multiresistance几种抗菌药物,提供3月指数从0.12到0.25;24株3月指数为0.12(表6);5株显示3月指数为0.18;和两个菌株显示3月指数为0.25 3月索引。
72株的阻力分布如下:60株耐氨苄青霉素,14是对阿米卡星(AK), 10人耐头孢菌素(KF), 8是耐头孢西丁(CTX), 5是耐庆大霉素(CN)、3耐环丙沙星(CIP),和1株耐阿莫西林+克拉维(AMC),氨苄青霉素+ sulbactam(山姆),左氧氟沙星(LEV)、氧氟沙星(OFX)和氯霉素(C)。
4所示。讨论
上述耐热的大肠菌目前的研究中发现的最大容许极限(最大公差5×101NMP g−1大肠杆菌群在45°C)在双壳类软体动物,蟹肉,和类似的样品,根据巴西法律卫生警惕机构(通讯社的记者Nacional de Vigilancia疗养地(ANVISA)) (33]。也发现了类似的结果对Uca蟹肉在3种不同的微生物质量点普拉亚做无缝化,位于福塔雷萨,CE,巴西、耐热的大肠杆菌群被发现从1100到3.0 NMP g−190年分析蟹(34]。根据德利马Grisi Gorlach-Lira (2010) (35),这组细菌的存在相关联的倾销粪便的环境。瓜纳巴拉湾接收废水没有处理日常和水库已成为细菌,进而引起了这个地区的鱼类和其他生物的污染(36]。
的表达大肠杆菌毒力基因是一个公共卫生风险,因为这些基因特征的存在毒素能引起疾病。大肠杆菌细胞胃肠炎的主要病原体相关的食品在人类起源,引发腹泻、出血性结肠炎,溶血性尿毒症37]。然而,一些研究报道人类感染大肠杆菌由于蟹消费是可用的38]。尽管的缺席virA,运算单元,圣,gg基因在目前的研究中,确认大肠杆菌菌株表明最近的排泄物污染螃蟹,这表明主要关心这类食品的准备是必需的。
结果有关的存在弧菌可以解释的盐度和温度研究红树林(39]。许多研究显示的存在弧菌在鱼类等水生动物(40)、虾(41),和贻贝(42),但尽管螃蟹的重要性,只有一些螃蟹污染进行了研究弧菌。然而,它发生在海洋食物是指出胃肠炎的主要原因在美国和欧洲43在巴西和智利[]和与案件有关44]。这些结果表明可能的健康风险的人消耗原始和未煮熟的海鲜。据阿拉姆et al。(2012)45),创伤弧菌和诉mimicus最常见的球菌样的可行的但不是可栽培的形式,而另一项研究证实的存在弧菌在福塔雷萨螃蟹市场,巴西,只有10个菌株鉴定到种水平:2诉防治等和8诉parahaemolyticus但不是任何创伤弧菌和诉mimicus(4]。Abd-Elghany和Sallam (2013) [46检测到10诉parahaemolyticus隔离在蟹通过分子识别在埃及和强调,可靠的分子检测方法应该被包括在常规海鲜考试,除了常规细菌学的方法。
这些药敏结果与先前的研究的数据,发现耐氨基糖甙类,内酰胺酶,青霉素是普遍的大肠杆菌隔离从动物源食品47- - - - - -49]。然而,阻力频率大肠杆菌隔离在本研究与其他研究相比,低阻力的58%和42%在肯尼亚和越南生鱼样本,分别观察(48,50]。从尼泰罗伊贻贝样品(巴西东南部海洋地区)显示,29%抵抗抗菌素(至少有一个31日],菌株分离从瓜纳巴拉湾贻贝,里约热内卢,电阻测试抗菌素(40%至85%51),表明激烈的国内和工业废水的存在。高灵敏度的比例对这些抗生素也观察到Reboucas et al。(2011)41在菌株分离贝类和与不同的革兰氏阴性细菌中发现的耐药机制。随着时间的推移,弧菌菌株接触抗生素通过环境可以通过手机获取抗菌素耐药性转移基因元素和水平基因转移(52]。因此,由于人群中r个因子的存在,耐药性通过基因调控质粒和染色体可以转让(遗传)或垂直水平(53]。在目前的研究中,氨苄青霉素抗生素显示低效率对60测试弧菌种虫害株(83.3%)。根据标准CLSI M45-A2 [54),属于物种弧菌属内在抗氨苄青霉素。这些数据被确认在另一项研究中,从169年弧菌敏感菌株分离出虾,只有3氨苄青霉素(55]。高致病性的百分比弧菌与氨苄青霉素敏感性降低表明潜在的氨苄青霉素治疗的低效率弧菌感染(56]。
很多情况下多种抗菌素耐药性已报告从贝类养殖场在活动很发达的国家,如中国(57)、韩国(58),和智利59]。据世界卫生组织统计,微生物群的变化能引起新的病原微生物的进化和发展的新的毒性因素在古代病原体,如抗菌素耐药性的发展或改变他们的生存能力在不利的环境条件60]。
5。结论
几个大肠杆菌和弧菌隔离被发现在蟹(Ucides cordatus)从不同红树林在里约热内卢,巴西。考虑到目前的立法,这些病原体的存在在蟹表明污染影响红树林污染,通过使用新的分子,从而导致海产品安全的方法。一些孤立的菌株显示微分抵抗抗菌素。hygienic-sanitary条件不合适而给出的分析样本,可以被视为一个警告市卫生监测机构,多次因为海鲜食用没有任何后续的热处理,甚至足够的热处理可以消除病原微生物,导致疾病消费者健康。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
m·c·n·卡瓦略进行的实验室研究和解释数据的监督下f . v . Araujo s g·f·雷特和e·m·德尔·阿古里亚·。m . m . Jayme和g s Arenazio收集样品和参与微生物分析。e·m·德尔·阿古里亚·编辑。所有作者阅读和批准了期末论文。
确认
作者承认金融支持慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(巴西,巴西利亚,CNPq)和Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(巴西,巴西利亚,斗篷)。