文摘

火腿日圆橙(柑橘nobilis皱眉头)是高价值的商业越南的水果。盛开的水果生产和农业区域,这种特色作物正面临一些严重疾病的威胁;因此需要寻找新的有效biocontrollers现有防止过度使用肥料和植物保护的化学物质。植物内生放线菌的伟大的科学兴趣由于其高的潜力在农业和医药研究中的应用。在这个工作中,植物内生放线菌分离得到一种原生橙色参选Quang东北山区省份。49间隔离,隔离TQR12-4强烈抑制病原体进行测试炭疽菌truncatum,地丝菌属candidum,尖孢镰刀菌,f . udum。这个隔离了相对高生物质产量在不同的基质上,例如,羧甲基纤维素,淀粉、蛋白质、甲壳素,在广泛的温度从15到45°C和pH值从4到10。16 s rDNA基因的序列分析表明,TQR12-4共享99%的相似性链霉菌属prasinopilosus;然而,它略不同于后者孢子形态,因此被命名为链霉菌属TQR12-4 sp。一种耐热性的抗真菌物质nonpeptide自然产生的链霉菌属sp。TQR12-4麦克风镰刀菌素udum100年μ克/毫升和400年μg / mL各自提取分数和。

1。介绍

火腿日圆橙树自1890年代以来驯化Muong少数民族山区省火腿日元区参选Quang东北越南。这个物种产生最有营养和经济价值的水果与当前种植面积4900公顷,产量约43000吨,2015年为当地种植者带来可观的经济效益。像其他柑橘类物种,火腿日圆橙色植物受到橘树根枯病等多种疾病,绿化,柑橘溃疡引起的各种植物病原体导致降低农作物的产量和品质。应用合成化肥和其他化学物质来控制疾病不仅非常有效,而且也危害消费者和环境。因此,寻找有效的疾病biocontrollers从其他生物体,特别是微生物,减少农药投入是必要的。

内生菌的微生物被定义为在活体植物组织(根、树枝和树叶)不会造成明显损害寄主植物和植物组织可以从表面消毒隔离或从植物中提取1]。根据Kandpal et al。(2012),他们可以在几乎所有的植物物种研究日期和被认可的重要发展的寄主植物通过microbe-host互动(2]。而内生菌接收来自寄主植物的营养物质(主要是碳水化合物),后者获得的化合物或内生菌产生的次生代谢产物和抗生素提高植物生长和获得免受病原体3- - - - - -7]。

在研究内生菌,链霉菌属孤立的物种从一个植物物种的多样性,是一群特别的感兴趣,因为他们的能力产生抗生素以及其他生物活性次生代谢产物(1,8- - - - - -16]。约23000生物活性次生代谢产物在植物内生微生物,发现大约有10000种物质是植物内生放线菌生产的7600种物质被发现链霉菌属属(17,18]。

目前,只有数量有限的报道在柑橘类植物内生菌的存在。根据Araujo et al。(2002),Physoderma citri是第一个植物内生真菌中发现健康吗素类。之后,许多细菌包括成员无色菌,不动杆菌,产碱杆菌属,节细菌属,芽孢杆菌,洋葱,枸橼酸杆菌属,棒状杆菌属,肠杆菌属,假单胞菌从柠檬根木质部[孤立19]。最近,Douanla-Meli et al。(2013)报道了其他柑橘类植物内生真菌的分离20.]。Shutsrirung et al。(2013)研究了植物内生放线菌的多样性在普通话生长在泰国和生长调节物质的生产(21]。Kandpal et al。(2012)感兴趣的植物内生放线菌抗菌活性柑橘aurantifolia生长在印度不同地区(2]。

在越南,研究植物内生微生物处于早期阶段。然而,寻找新的物质植物内生微生物是画一个伟大的关注。在这项研究中,是否内寄生的火腿日圆橙从根孤立,树枝和树叶。生物学特性、鉴定和物质生产最活跃的隔离TQR12-4广泛调查。结果表明,对四种植物病原真菌TQR12-4表现出非常强烈的活动,炭疽菌truncatum,地丝菌属candidum,尖孢镰刀菌,镰刀菌素udum,两个革兰氏阳性细菌,枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌。

2。材料和方法

2.1。材料

根、树枝和树叶样本收集到七岁的橘子树生长在山区的两个村落,Deo-Ang Hoc-Trai,火腿日元区,参选广省。测试(指标)微生物用于这项研究包括炭疽菌truncatumVSVD 14(引起炭疽病的柑橘类水果),地丝菌属candidumVSVD 1(酸腐烂的柑橘类水果和蔬菜),尖孢镰刀菌FO 5(萎凋病),镰刀菌素udumVSVD 4(愿意)枯草芽孢杆菌写明ATCC 6633收到文化的土壤微生物实验室,机构的生物学,赵舒越南科学技术学院,金黄色葡萄球菌写明ATCC 25922和铜绿假单胞菌写明ATCC 10145从研究所获得的药品质量控制。引物扩增的16 s rDNA从英杰公司购买(香港)。

2.2。植物内生放线菌的分离

描述的植物样本surface-sterilized Shutsrirung et al。(2013)21]。然后,样本均质在臼约2 - 5毫升无菌水。液体收集和传播包含2.0 g / L的筛选培养基K₂HPO₄,0.02 g / L CaCO₃,2.0 g / L KNO₃,0.01 g / L FeSO₄h·7₂啊,2.0 g / L氯化钠,0.05 g / L MgSO₄·H₂啊,1.0 g / L腐殖酸,10毫升0.2 N氢氧化钠,和18.0 g / L琼脂,pH值7.0。为了防止细菌和真菌的生长,制霉菌素和萘啶酸添加到媒介的最终浓度100 mg / L和10 mg / L,分别。接种板块在孵化28°C。选择典型的放射菌类殖民地从15天连续60天内,和纯化裸奔在ISP中包含10 # 2 g / L葡萄糖,5 g / L肉汁,4 g / L麦芽提取物,和18 g / L琼脂,pH值7.0。

2.3。形态和文化特征

形态和文化特征的分离进行了研究根据国际协议的链霉菌属项目(ISP) (22- - - - - -24]。孢子在扫描电子显微镜下检查FESEM S4800。

定性评价酶活性是由板试验方法。羧甲基纤维素、甲壳素燕麦拼木聚糖,酪蛋白,和淀粉是用来检测各自的酶:纤维素酶,几丁质酶,木聚糖酶,蛋白酶和淀粉酶25]。表现出一种酶的活性是一个明确的区域(降解底物)在殖民地。淀粉酶和木聚糖酶的检测,观察板块被淹没之前碘和刚果红的解决方案,分别。

适宜生长的温度和pH值和盐度公差确定隔离的ISP中# 2。实验进行了不同温度下从15到50°C, pH值从3到9,氯化钠浓度从3到7%。结果记录后14天。

2.4。DNA提取和16 s rRNA基因扩增

种植隔离的执行根据石川(2000)(26]。组织提取基因组DNA分离使用NucleoSpin®工具(Macherey-Nagel、德国)根据制造商的指示。16 s rRNA基因放大使用引物27 f (5′-TAACACATGCAAGTCGAACG-3′)和1492 r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) (27和基因组DNA。PCR的热循环被Shutsrirung et al。(2013)21]。隔离的16 s rDNA核苷酸序列与相关的已知序列从基因库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST获得参考序列。6.6系统分析是由CLC DNA工作台。

2.5。筛查抗菌活性

使用琼脂扩散法筛选了。三个测试细菌,枯草芽孢杆菌写明ATCC 6633,金黄色葡萄球菌ATCC25922,铜绿假单胞菌ATCC10145, LB培养基中分别增长了24小时。一个100μL彻底测试细菌文化传播的每个三磅琼脂板上。琼脂块(5毫米)放线菌分离之前增长了7天在ISP中由软木钻孔机# 2被削减和放置在磅板测试细菌接种。隔夜孵化后37°C,抑制增长评估通过测量直径的琼脂块周围的光环。

2.6。筛查抗真菌活性

这个试验是由琼脂扩散或coculture方法所描述的内部et al。(2011)28),做了一些调整。最初,测试真菌生长在汉森琼脂为10天。分生孢子的悬架准备在生理盐水的密度10⁶CFU /毫升。每个汉森琼脂板与100年传播μ分生孢子的悬挂的L。六个琼脂插头(5毫米)从每个盘子,取而代之的是六放射菌类插头,每个包含一个隔离殖民地曾在ISP中# 2。3天后结果记录。

另外,测试真菌和放线菌分离被平行接种在汉森琼脂裸奔3厘米的距离彼此(coculture)。板块在28°C和孵化抑制菌丝的生长测量后7天。

2.7。原油的温度和pH值稳定抗真菌物质

选择隔离TQR12-4的抗真菌物质生产介质AH4包含10 g / L葡萄糖,10 g / L大豆粉,5 g / L氯化钠,1 g / L CaCO₃,pH值7所示。培养持续120小时28°C。从整个提取的原油抗真菌物质文化与乙酸乙酯(28]。在真空蒸发的溶剂后,原油物质溶解在5%甲醇热和pH稳定性评价使用琼脂扩散试验对测试真菌,病圃,f . udum,g . candidum。

原油物质的溶液处理的温度在28岁,40岁,50岁,60岁,70年,80年和100年在30°C,六十,90,120分钟为每个温度。

天然抗真菌物质的pH值调整值3,4,5,6,7,8,9,保持在28°C为60分钟。

2.8。恢复和生物测定的抗真菌物质

120小时的抗真菌物质提取水下文化用乙酸乙酯作为溶剂。溶剂在真空蒸发,和固体粗物质溶解在甲醇对硅胶柱分离使用梯度洗脱的CH₂Cl₂/ CH₃哦(50/1-1/1,v / v)。抗真菌活性恢复分数是检验f . udum使用磁盘扩散法。干分数再溶解在甲醇10毫克/毫升的浓度。无菌绘画纸滤纸磁盘(5毫米)加载,每50μL(0.5毫克)的一小部分的解决方案,而控制只含有甲醇。加载磁盘是在室温下晾干。汉森琼脂板注射试验真菌如上所述。三执行测试,3盘,每个装有一个分数,和一个控制放在一个盘子。抑制区域的直径测量孵化2天后在28°C。

2.9。确定最低抑制浓度

分数的最低抑制浓度(MIC)和决心根据Narayana et al。(2007) (29日和安德鲁斯(2001)30.),做了一些调整。多菌灵,商业杀真菌剂化验在平行比较。测试的真菌,f . udumVSVD 4,汉森琼脂培养基上生长了10天;然后分生孢子收集和悬浮在生理盐水的密度10⁶CFU /毫升。

分数和和多菌灵首先溶解在5%的甲醇溶液,然后与汉森肉汤稀释浓度为0.84÷200μ1.68 g / mL,÷400μ3.125 g / mL,÷100μ分别g / mL。

在试管中,等于100卷μ分生孢子的悬架和或或多菌灵是混合在一起。控制管只包含汉森肉汤和分生孢子的暂停f . udum。管是耗氧孵化72小时25°C。MIC值记录没有可见真菌生长的最低浓度。

3所示。结果与讨论

3.1。植物内生放线菌的分离

49内生植物放线菌分离从火腿日元橙色植物样品。,18隔离(36.7%)显示抗菌活性生物体进行测试。尤其是5隔离抑制增长6 - 7测试生物,和7隔离抑制3到4测试生物体。隔离TQR12-4表现出最高的活动对4测试致病性真菌,炭疽菌truncatum,地丝菌属candidum,尖孢镰刀菌,镰刀菌素udum。这个孤立的文化汤抑制革兰氏阳性的增长金黄色葡萄球菌写明ATCC 25922和枯草芽孢杆菌写明ATCC 6633但是没有抑制革兰氏阴性铜绿假单胞菌写明ATCC 25932(表1和图1)。

3.2。TQR12-4隔离的生物学特性

表面是粉状的,卷曲的殖民地。天线和衬底菌丝灰色浅棕色或淡黄色到褐色黄媒体ISP2 ISP3, ISP4 ISP5, ISP7。可溶性黄色素在媒体ISP2和ISP3观察。其螺旋孢子链从几美元到大约30孔光滑孢子/链(图2)。

在文化、隔离TQR12-4可以生长在温度15 4÷÷45°C和pH值10。然而,最有利的温度是28°C和pH值为6.0÷7.0。耐盐碱的3%氯化钠。孤立的降解几丁质、蛋白质、淀粉、愈创木酚,羧甲基纤维素,和同化碳源:葡萄糖,D-xylose, D-mannitol,果糖,D-cellulose。显示星期增长L-arabinose、D-sucrose D-rhamnose D-raffinose没有增长。

获得的16 s rDNA核苷酸序列(1361个基点)注册的国家生物技术信息中心(NCBI)基因库数据库下加入KX257804数量。这是与相对序列可以在基因库NCBI数据库使用防爆工具。它共享相似的序列(99%)高链霉菌属例如,sp。链霉菌属prasinopilosusN2 (KR703669)和链霉菌属hawaiiensisNBRC12784 (AB184143)(图3)。尽管有如此高的相似性链霉菌属prasinopilosus,还有它们之间的细微差别,孢子形态。因此,我们的分离被任命为链霉菌属TQR12-4 sp。

3.3。温度和pH值稳定的抗真菌物质

粗提物的抗真菌药物链霉菌属sp。TQR12-4显示活动对所有三个测试真菌广泛的pH值从3 - 9所示。最合适的pH值6÷7;否则,活动略有下降对酸性或碱性博士与最高的活动在pH值为7.0,在极端的pH值3和9小时处理后,分别活动降低了36和26%(数据5和6)。

处理在不同的温度下表现出相对较高的原油物质的热稳定性。假设28°C的抗真菌活性为100%,孵化120分钟在60和100°C导致其降低77%和60%,分别。因为高相似度在所有三个测试真菌反应,只有数据病圃提出了在图4。

在这项研究中,Prapagdee et al .(2008),文化的滤液链霉菌属hygroscopicus治疗在100°C 45分钟然后测试刺盘孢属、炭疽和菌核rolfsii。研究结果表明,抗真菌活性指数文化主要是分配给热不稳定的蛋白质如胞外水解酶,而静止的活动文化表现出了更稳定的另一个性质的化合物(31日]。卡瓦略和Van Der沙(2016)报道,植物内生放线菌的离心机文化肉汤R18(6)可能会接触到80°C 30分钟而不失去抗菌活性。然而,提取并没有站在100°C,作为其活动3分钟后开始下降,完全失去了30分钟后。作者建议存在物质的分子中肽键(32]。因为我们的应变产生的物质链霉菌属sp。TQR12-4与乙酸乙酯提取,然后接受治疗100°C 120分钟,但仍保留60%的活动,这可能是nonpeptide性质的。

3.4。生物测定的抗真菌物质

原油抗真菌物质在硅胶柱分离给五个分数贴上来。恢复的干重量分数是300,45岁,36岁,78年,分别和46个毫克。

所有五个分数的生物测定是由扩散法显示分数,,没有抑制真菌生长测试。与此同时,分数和给了明确的抑制区17日和15毫米直径,分别(图7)。中等收入国家对f . udum的分数和和多菌灵在100、400和50μ分别g / mL。

某一物质的抗菌活性取决于strain-producer和微生物测试。在一项由金正日et al .(2013),抗真菌niphimycin链霉菌属sp。KP6107抑制属的菌株链格孢属,曲霉属真菌,刺盘孢属,尾孢属,柱孢属,镰刀菌素,丝核菌麦克风的8÷64μ克/毫升(33]。与营养菌丝化验,中等收入国家的生物活性化合物,3-phenylpropionic酸(3-PPA)链霉菌属albidoflavus阿奴6277黄曲霉,答:尼日尔,尖孢镰刀菌,f . udum,青霉菌citrinum,白色念珠菌10÷100吗μ克/毫升(29日]。孢子的f . udum多菌灵的麦克风,3-PPA tricyclazole 50, 100和500μ分别g / mL。我们的物质,产生的链霉菌属对sp。TQR12-4,显示出类似的活动f . udum,也就是100年的麦克风μg / mL,麦克风50多菌灵的μ克/毫升。然而,必须进行进一步的研究来理解这种物质的化学性质和更多的属性。

正如上面提到的,据报道,植物内生放线菌生长起着重要的作用,生理、和健康的寄主植物通过其代谢活性和抗菌等机制,利基市场竞争,诱导宿主系统阻力。然而,植物内生微生物和宿主之间的关系仍然不够解释道。

Taechowisan et al。(2005)34)研究抗真菌物质由内寄生的生产链霉菌属aureofaciensCMUAc130孤立从根组织的生姜。物质被确定为5,7-dimethoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin, 7-dimethoxy-4-phenylcoumarin,抑制植物病原真菌炭疽菌musae和尖孢镰刀菌。有趣的是,作者总结的5 7-dimethoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin可以提取的植物从姜科的成员,而不是反过来主机链霉菌产生这种物质。在我们看来,这一事实可能会建议研究发现某些抗菌化合物在植物的起源。

4所示。结论

一个链霉菌TQR12-4隔绝火腿日圆橙色越南东北部的专业显示强烈的活动对2革兰氏阳性细菌,枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌4植物病原真菌,c . truncatum,g . candidum,病圃,f . udum。生物和分类特点和16 s rDNA基因的序列分析表明,该隔离属于属链霉菌属。股99%相似链霉菌属prasinopilosus但有细微差别,孢子形态,因此被命名为链霉菌属TQR12-4 sp。这个应变相对稳定的原油抗菌物质在大范围的pH值(3 - 9)和温度(40 - 100°C)。在硅胶分离了五个分数,其中两个(和)抑制增长f . udum在100年和400年的麦克风μ分别g / mL。研究这种物质的性质表明其显著的优势通过微生物发酵生产和应用在农业实践。为了实现这些目标,需要进一步的研究来理解这种物质的化学性质和更多的抗菌谱和生产。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由通过VAST.DLT越南科学技术学院。12/15-16项目。基因技术的国家重点实验室,生物技术研究所,为本研究提供了设施。