文摘

Canarium odontophyllum(有限公司)进行筛选。被认为是最受欢迎的植物物种之一在沙捞越,马来西亚,由于其营养和药理的好处。本研究旨在评估粗甲醇和丙酮提取物的药效学相互作用从公司离开苯唑西林结合,万古霉素,linezolid,分别对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌写明ATCC 33591年初步研究报告了其潜在antistaphylococcal活动。肉汤采用微量测定表明,甲醇和丙酮提取物杀菌和最低抑制浓度(MIC)为312.5μ和156.25克/毫升μg / mL和最低杀菌浓度(MBC) 625μ和312.5克/毫升μ分别g / mL。部分抑制浓度(FIC)指数获得通过的棋盘稀释测定甲醇extract-oxacillin,丙酮extract-oxacillin, extract-linezolid甲醇和丙酮extract-linezolid组合表现出合作(FIC指数≤0.5)。甲醇extract-oxacillin组合的协同作用是time-kill分析验证了杀菌效果观察到1/8×麦克风的化合物的浓度为9.6 h苯唑西林而孤独。因此,这些研究结果推测,提取发挥他们anti-MRSA万古霉素的作用机制相似,提供证据证明的叶子c . odontophyllum有潜力成为发展成antistaphylococcal代理。

1。介绍

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌社区的一个主要原因,流行,流行院内感染(1]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染引起的一系列疾病,从皮肤和伤口感染肺炎和血液感染可引起败血症和死亡。病原体构成了巨大的威胁,因为它已经开始显示阻力对革兰氏阳性细菌抗生素治疗的最后一行(2- - - - - -5与vancomycin-resistant]金黄色葡萄球菌(6)和linezolid-resistant金黄色葡萄球菌全球报告(LRSA)株(7]。天然产品,特别是植物,一直是一个伟大的医学用途的生物化合物来源(8]。植物和生物活性的次生代谢产物提供了多样化的储层组件作为潜在的治疗药物,包括抗菌素(9]。这些化合物保护植物免受微生物自然存在、昆虫、植物和食草动物以及给他们的气味和颜料。研究表明,世界各地的许多药用植物物种可以提供替代各种细菌感染(10]。Canarium odontophyllum进行筛选。,locally known as “dabai,” is a very popular fruit in Sarawak, largely consumed by the locals during its season. It is native to the tropical rainforest of Borneo and is reported as one of the underutilised fruits of Sarawak. The CO fruit is rich in unsaturated fatty acids and contains sixteen types of phenolic compounds as well as exhibiting great potential as antioxidant [11- - - - - -13]。初步筛选[14,15)有限公司叶的甲醇和丙酮提取物显示抗菌活性金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

天然产品本身可能是有毒的微生物或resistance-modifying代理微生物如clavulinic酸、安灭菌beta-lactamase抑制剂。实验研究药物和天然化合物的组合效应可能导致发现的一种新型治疗代理和阻碍发展的微生物对抗生素产生耐药性。现有的药物和天然产物之间的相互作用可能产生不同的机制对相同的微生物菌株的行动。协同效应的phytocompounds用抗生素因此导致较小的所需剂量的抗生素治疗(16,17]。合作被定义为相互作用的类型,结合两种不同的化合物产生更大的活动比化合物。冷漠意味着没有额外产生的组合效果,无论是积极的还是消极的,是没有不同的化合物。添加剂的相互作用被视为一个轻微的改善活动,好像要么化合物的浓度增加。对抗,另一方面,表明结合导致恶化的影响相比,要么独自化合物(18- - - - - -20.]。

金黄色葡萄球菌尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相对普遍,通常是抵抗许多化疗药物包括万古霉素,因此治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的基础(7]。因此,采购选择抗菌药物是至关重要的,目前,是一个全球性的挑战。天然产物及其衍生物一直是最重要的新线索来源到开发新药品代理。因此,本研究旨在评估甲醇和丙酮提取物的anti-MRSA活动公司叶子结合三个选择抗菌药物,即新青二、万古霉素和linezolid。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌药物敏感性向有限公司叶萃取精华通过汤采用微量分析方法。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

绝对绝对甲醇和丙酮分别被用来准备公司叶的甲醇和丙酮提取物。二甲亚砜(DMSO)用作linezolid稀释溶剂。氯化三苯基四唑(TTC)作为指标的新陈代谢活跃细胞最低抑制浓度(MIC)和部分抑制浓度(FIC)测试。结晶甲醇和丙酮提取物的树叶在本研究进行了测试。抗菌药物、新青二、万古霉素、linezolid用于本研究从西格玛奥德里奇(美国)。

2.2。增长、悬架和存储媒体

菌株的生长和维护在营养琼脂偏。营养琼脂板被用来培养细菌悬架前准备。Mueller-Hinton肉汤(MHB)被用来准备细菌悬液和Mueller-Hinton琼脂(尼古拉斯)是用来从肉汤培养细菌采用微量板测定最小杀菌浓度(MBC)。

2.3。植物材料

有限公司是来自沙捞越的叶子,马来西亚。所有植物部分被识别和验证萨尼先生米兰和存入马来西亚Kebangsaan大学的植物标本(UKM) Bangi,雪兰莪州,马来西亚、凭证标本UKMB 40052。整个叶中提取的用于制备。

2.4。准备提取和抗菌药物

股票的解决方案的测试材料是由溶解有限公司叶的甲醇和丙酮提取物绝对绝对甲醇和丙酮,分别到最后100毫克/毫升的浓度并为后续使用储存在4°C。苯唑西林股票的解决方案和万古霉素是由溶解在无菌蒸馏水溶解在10% DMSO最后出利奈唑酮100毫克/毫升的浓度。的工作解决方案测试提取及抗菌药物准备通过计算股票的双重的稀释因子解决方案通过微孔滤膜过滤和消毒的0.45μ孔隙大小。

2.5。制备细菌培养液

选择孤立单菌落的细菌培养,接种到MHB,孵化在37°C。MBC,麦克风的接种体大小和膜集成电路测试标准化10⁶CFU /毫升通过调整光密度细菌悬液的浊度对应光谱光度测量的吸光度的0.08到0.13在620海里。这种阅读是与0.5麦克法兰标准相当于大约10的细菌数⁸CFU /毫升其次是1:100稀释产生一种细菌浓度的10⁶CFU /毫升(21]。

2.6。麦克风和MBC的决心

公司提取和三种抗生素进行测试,以确定他们的MIC值通过肉汤基于临床实验室标准协会指南[采用方法21]Basri所适应和Khairon [22]。麦克风进行化验在96 - microtitre盘子一式三份的双重的连续稀释测试化合物从9.77μ克/毫升到5000μ提取并从0.19 g / mLμ克/毫升到2000μ抗生素的g / mL。然后添加细菌悬液的细菌浓度在每5×10⁵CFU /毫升。负控制由MHB和提取或抗生素而积极的控制是MHB和细菌悬液。盘子被孵化的37°C 18到24 h。孵化后,盘子视觉检查了细菌生长。从每个显示没有明显增长,样本亚文化在无菌Mueller-Hinton琼脂板来确定MBC值。盘子被孵化24小时37°C。包含最低浓度的好没有可见的细菌生长的化合物作为麦克风的价值。这是进一步验证添加氯化三苯四唑(TTC)井。TTC 2毫克/毫升的浓度和体积的20倍μL是添加到每个孵化20分钟。井出现粉红色与积极的控制被解释为阳性细菌生长在井无色溶液被解释为对细菌生长不利。井含有无色溶液的浓度最低的是解释为麦克风。MBC是解释为最低浓度没有明显增长琼脂亚文化。

2.7。FIC指数的测定

甲醇提取和丙酮提取的综合效应的三个选择抗生素被成棋盘稀释法评估(23]的部分抑制浓度(FIC)指数的预测类型的化合物之间的相互作用,得到(24]。提取是单独测试分别结合三种抗生素96 - microtitre盘子一式三份。的浓度检测每一个组合extract-antibiotic各自的中等收入国家,其次是1/2、1/4、1/8,1/16乘以各自的中等收入国家。1:1中的extract-antibiotic组合添加比例浓度相应井已经充满了MHB。细菌悬液添加到井,这样细菌浓度5×10⁵在每个好CFU /毫升。负控制MHB extract-antibiotic组合而积极控制MHB和细菌悬液。盘子被孵化24小时37°C。最后,20μL (TTC)(2毫克/毫升)被添加到每个好,盘子又孵化了20分钟。井包含变成粉红色的解决方案与积极的控制被解释为阳性细菌生长。包含解决方案的井保持无色被解释为对细菌生长不利。试验运行在5个或5个以上之间的协议的六个复制复制估算所需的膜集成电路(25]。结合负面结果的FIC指数计算使用以下公式(26]: 哪里是麦克风的化合物结合,B是复合B相结合的麦克风,是复合一个单独的麦克风,是复合B单独的麦克风。

FIC指数为0.5或更少一直被定义为合作。FIC指数在0.5和2.0之间被定义为添加剂,在2.0和4.0之间,是冷漠。FIC指数超过4.0的定义是对抗(27]。

2.8。Time-Kill分析

extract-antibiotic组合,表明FIC指数最低的合作进一步使用time-kill化验分析。样本包含提取和抗生素的浓度相同的协同组合的准备。细菌悬液的浓度10⁸CFU / mL被加入到管,这样最后的细菌浓度是5×10⁷CFU /毫升。管被孵化在37°C。在零小时,10μL的样本是来自一个管和稀释10倍后连续稀释在正常生理盐水(0.9%氯化钠)。接下来,10μL每个稀释培养在Mueller-Hinton琼脂(尼古拉斯)板块和孵化24小时37°C。孵化后,进行细菌培养的菌落数。殖民地的数量30至300年考虑计算细菌浓度的小时。整个过程在执行4、8、12、24 h。time-mortality曲线与时间(小时)的构造设在和的细菌浓度(CFU /毫升)设在(28]。结果表示为平均值±标准平均误差(S.E.M)图。仅提取和抗生素在麦克风浓度控制而负增长控制MHB和细菌只有积极的控制。

交互是解释为协同减少≥2CFU /毫升24 h后细菌浓度相比,最活跃的单一代理。添加剂或冷漠被描述为一个< 2CFU /毫升细菌浓度变化后24小时相比,单一的组合,最活跃的化合物。对抗被定义为≥2CFU /毫升细菌浓度增加后24小时的组合相比,最活跃的单一化合物。复合会被视为杀菌了降低CFU /毫升菌落计数在潜伏期表示> 99.9%杀死29日]。

3所示。结果

甲醇和丙酮提取物的抗菌活性有限公司叶对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是评估使用汤采用的方法。浓度测试是在5000年μ和9.77克/毫升μ克/毫升。表1表明,甲醇提取物的MIC值为312.5μg / mL,麦克风的丙酮提取物156.25的两倍μ克/毫升。甲醇提取物的MBC是625μg / mL, MBC值的两倍。丙酮提取的麦克风是156.25μg / mL相当于其麦克风。

每个组合的FIC指数的计算基于麦克风值表所示1和2。四,六extract-antimicrobial剂组合表现出合作的,而其他两个组合显示可加性(表2)。甲醇extract-oxacillin组合展示了FIC指数,最低0.25,而丙酮extract-oxacillin组合给出了FIC指数为0.375。苯唑西林两组合显示减少浓度的8倍。甲醇和丙酮extract-linezolid extract-linezolid组合组合显示边界合作与FIC指数0.5 linezolid浓度的减少四倍。然而,甲醇extract-vancomycin和丙酮extract-vancomycin组合显示添加FIC指数为1.0625个。

甲醇的time-kill测定extract-oxacillin组合验证的结果棋盘采用测试了FIC指数0.25的组合。控制增长只是MHB和细菌。苯唑西林甲醇提取,独自住在他们的麦克风测试作为比较消极的控制和组合。time-kill曲线如图1。

甲醇extract-oxacillin组合的协同效应是明显的从图表。此外,显著减少> 2CFU /毫升的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在增长4 h组合与提取或抗生素。此外,结合似乎杀菌减少在9.6 h区间CFU /毫升,这既不是与提取苯唑西林或见过。然而,曲线显示,细菌浓度略有增加从12 h 24 h。

甲醇提取单独的麦克风出现了轻微的增加,细菌浓度前四小时后跟一个缓慢减小到24小时。新青二,另一方面,表明细菌浓度下降前8 h,随后增加到24小时。两种化合物没有显示杀菌作用。

4所示。讨论

肉汤采用量化的方法不仅有效生物活性(30.),但同时能够直接测量麦克风(2]。此外,汤采用增加了灵敏度低数量的提取方法,提供了定性分析抑菌和bacteriocidal效果,可用于测试各种微生物,并提出可再生的结果(30.]。

抗菌素与MBC值等于或小于1稀释高于麦克风被定义为杀菌(31日,32]。的甲醇和丙酮提取物c . odontophyllum树叶都是杀菌,报道在之前的研究结果一致(15]。标准的抗生素检测显示麦克风符合每个抗菌剂的磁化率范围(33- - - - - -36]。

植物化学的筛选公司叶提取物显示水的植物成份,甲醇和丙酮提取物。甲醇和丙酮的组件是相同的,因为他们由酚类化合物、黄酮类、萜类、皂苷。这就提出了一个可能性,皂素是关键球员在甲醇和丙酮提取物的抗菌活性的叶子。皂素提取已报告发挥抗菌活性金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌与金黄色葡萄球菌是最敏感的细菌(37,38]。

四的六extract-antimicrobial剂组合显示协同交互的这四个苯唑西林甲醇extract-oxacillin组合显示8倍减少浓度。这种组合了杀菌活动rate-killing时间为9.6 h表明较小的浓度的化合物结合产生增强效应大于单独或复合。

交互的天然产物与现代药物是基于相同的药效学原则药物之间的相互作用(39]。当抗菌化合物结合在实验室条件下,他们发现相互作用在几个方面,即冷漠,添加剂,合作或对抗。

植物提取物之间合作和标准抗生素之前已经报道过了。柠檬草油、亚贡雪莲果叶提取物和茶提取物都报道产生相互对立结合beta-lactam抗生素(40- - - - - -42]。植物次生代谢物作为复合物存在原油提取并提供范围广泛的化学官能团结合活跃网站目标病原体。这些协会决定他们的抗菌活性和功效是基于组分的混合物的联合行动43,44]。

注意到一个有趣的现象是,提取产生协同效应的细胞壁抑制剂(新青二)和蛋白质合成抑制剂(linezolid)。尽管这一事实,新青二和万古霉素都是细胞壁抑制剂,提取显示合作新青二但与万古霉素可加性。协同交互的行为发生在两种化合物与目标在不同的机制45,46),同时添加时不同化合物施加相同的机制对目标的行动。因此,认为公司叶的提取证明抗菌活性通过抑制细胞壁合成的作用类似于万古霉素可以提出。一项研究证明,细胞壁抑制剂,β内酰胺,糖肤产生相互对立对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(47]。

医疗保健专业人士联合疗法用于克服抗生素耐药性的临床感染耐多药患者的利益。相同的策略可以雇佣一个细微的变化,植物次生代谢产物与现有抗菌药物结合使用来产生一个新的抗菌剂。抗菌药物的组合,展示合作,部分合作,可加性可能改善临床结果难以治疗的患者感染(48]。

5。结论

这些研究结果推测,甲醇和丙酮提取物的叶子Canarium odontophyllum苯唑西林发挥协同互动和linezolid 8倍减少甲醇提取苯唑西林的麦克风。甲醇提取苯唑西林结合表现出杀菌作用并没有观察到。此外,它可以从这个发现,假设公司叶提取物的作用机制相似,万古霉素和提供证据的提取有潜力成为发展成antistaphylococcal代理。

6。建议

进一步的调查还在继续联系这些发现与个人选民为了确定生物活性化合物的化学特性负责抗菌活性。此外,形态学和超微结构的分析使用扫描电子显微镜和透射电子显微镜建议确认确切的作用机制和效果c . odontophyllum叶提取物结合标准的抗生素。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

这个项目是由马来西亚Kebangsaan大学根据研究型大学授予代码gup - 2014 - 059。