文摘

海藻糖已被证明保护细菌细胞从环境压力。其吸收和osmoprotective效应perfringens梭状芽胞杆菌研究了通过比较野生型c . perfringens写明ATCC 13124与氟喹诺酮类(氟哌酸)耐药突变。在定义的化学介质,海藻糖和蔗糖支持野生型的增长而不是突变。基因微阵列数据和存在表明假定的磷酸化和运输的蔗糖和海藻糖(通过phosphoenolpyruvate-dependent磷酸转移酶系统,分)和一些监管基因表达下调的基因突变。野生型的公差比盐和低pH值的突变;海藻糖和蔗糖的osmotolerance进一步加强野生型氯化钠。表达trehalose-specific fluoroquinolone-resistant突变体分低。保护c . perfringens因此从环境压力与占用海藻糖的能力。

1。介绍

perfringens梭状芽胞杆菌,革兰氏阳性,孢子形成的厌氧细菌,产生不同的毒素。尽管病原体,它属于正常的人类和动物胃肠道微生物群,存在于土壤、污水、食品(1]。其无处不在的分布表明,c . perfringens可以克服环境压力才能生存。形成孢子允许c . perfringens应对恶劣的环境条件(2]。双组分信号转导系统,VirR梵,使c . perfringens感知环境变化和调节基因的转录表达适当的响应(3]。

此外,细菌可能积累保护化合物,如osmolytes,防止细菌在压力条件下的损害庇护大分子和细胞膜从一个有害的环境4- - - - - -9]。这些osmolytes双糖海藻糖和蔗糖,保护细胞免受环境压力(5,6,10- - - - - -15]。增加细胞内海藻糖一直在报道细菌与生理盐水治疗后(12,16]。1毫米海藻糖已被证明保护细菌免受0.5 M氯化钠(14]。尽管蔗糖的保护作用已被证明在l形的形成c . perfringens(17),海藻糖在保护的作用c . perfringens从环境压力是不知道。大肠杆菌和其他一些细菌为海藻糖酶生物合成(4,12,13,18- - - - - -20.),但没有公认的海藻糖合成基因的基因组中发现的c . perfringens已测序。

梭状芽胞杆菌,像其他细菌,糖可以运输到细胞通过phosphoenolpyruvate-dependent糖磷酸转移酶系统(PTS),传输和磷酸化底物(21- - - - - -23]。基于结构相似的酶分IIBC亚基糖运输基因,一个假定的运输和海藻糖代谢的基因通过分已被确认c . perfringens(2,24]。三个基因(treB,treC,和tr)已被标注为参与海藻糖运输、新陈代谢,调节(2,24]。在其他细菌,treB基因产品到提出运输海藻糖为细胞海藻糖- 6 -磷酸,然后通过水解treC基因产物 , 到-phosphotrehalase (trehalose-6-phosphate水解酶),产生葡萄糖- 6 -磷酸和葡萄糖(18,25]。在枯草芽孢杆菌,两个tr和碳降解物阻遏(CCR)调节海藻糖的运输和代谢(26]。没有trehalose-specific EIIA中基因的基因的序列中找到c . perfringens13124年的基因库。然而,缺少EIIA EIIA域提供的功能可能是另一个分,已经证明在海藻糖的情况下分枯草芽孢杆菌(27]。

在食品和胃肠道,c . perfringens可能接触到海藻糖合成了其他生物(9),也可能是接触抗菌药物用于治疗感染(28,29日]。暴露在抗菌药物可能导致耐药菌株的发展与变化,影响其代谢活动(30.- - - - - -32]。我们展示了fluoroquinolone-resistant株毒株特异性变化c . perfringens生成在实验室(28,32- - - - - -34]。在实验室gatifloxacin-resistant突变体c . perfringens写明ATCC 1312435),不同基因的表达和生产的毒素已经改变了(28]。在这项研究中,我们调查了其他变化的突变体通过比较突变体和野生型的增长c . perfringens在各种条件下,海藻糖的作用在保护环境方面的压力。我们发现基因指定为treB和treC功能参与海藻糖利用率和他们的表达及其作用,保护细胞免受环境压力在一个fluoroquinolone-resistant突变体已被改变。

2。材料和方法

2.1。增长的压力

perfringens梭状芽胞杆菌写明ATCC 13124(野生型)及其fluoroquinolone-resistant突变 拥有一个稳定的双突变gyrA(35),被用于实验。突变是发达与接触10µ克/毫升氟哌酸(35]。突变的易感性不同的氟喹诺酮类原料药,包括氟哌酸、多样的128倍(35]。抗性发展影响不同基因的表达(28]。细菌生长在一个厌氧手套箱(腼腆的实验室产品,Inc .) 85%的N2,10%的公司2,5%的H2在脑心浸液(BHI)中所有实验,除非另有说明。

2.2。分析经济增长在不同糖在基本培养基,嗨

基本培养基,在磷酸缓冲,包括19个氨基酸、尿嘧啶、腺嘌呤、维生素(生物素、钙D-pantothenate、核黄素、维生素b6),和盐36]。化学定义媒体,有或没有糖,filter-sterilized。为试验菌株代谢葡萄糖的能力,果糖、半乳糖、蔗糖、海藻糖,最终浓度为1%的糖添加到基本培养基。基本培养基无糖用于控制。媒体分发到一式三份井在96 -微量滴定板,与洗细胞接种在一夜之间文化的野生型和突变体,并在37°C在厌氧条件下孵化。增长是衡量spectrophotometrically (Biotek仪器)24小时后600海里。

海藻糖对经济增长的影响也检查脑心浸液(BHI)中。热消毒BHI有或没有海藻糖浓度(5%)被放置在一式三份井的微量滴定板和接种突变体和野生型。盘子在孵化后增长了37°C在厌氧条件下24小时。

2.3。PCR分析

的顺序c . perfringens写明ATCC 13124年从基因库(加入CP000246)被用来设计引物扩增的基因参与碳水化合物的新陈代谢。基因的引物设计放大海藻糖利用率,treB, treC,tr这些基因的上游和下游侧翼序列和一些监管基因(表1);DNA星软件被用来设计引物。根据前面描述的方法(DNA提取35]。100年μl聚合酶链反应混合物包含模板DNA, 2毫米的核苷酸,0.5μM的正向和反向引物和2.5单位的Taq罗氏或应用生物系统公司。的MyCycler thermocycler Bio-Rad被用来放大的基因。在95°C初始变性后2分钟,基因被放大在30个周期使用以下参数:15秒95°C, 52°C(或另一个合适的引物的退火温度)为30秒,72°C 90秒,最后扩展为5分钟72°C。PCR产物纯化从琼脂糖凝胶并使用ABI测序生物系统音序器和双脱氧终结者。

表1
设计引物扩增的海藻糖在操纵子基因c . perfringens随着上游地区。
2.4。RNA的准备

总RNA与野生型和突变体的文化28]。短暂,细胞被离心收获(15000×g, 10分钟,4°C),与10毫米三洗1毫米EDTA (pH值8.0),和悬浮在缓冲区包含1毫克/毫升的溶菌酶(σ)和2% SDS。RNA蜜蜂(Gentaur,布鲁塞尔,比利时)被添加到混合,然后用氯仿提取RNA。RNA在顶层用异丙醇沉淀,将其放置−70°C的混合了30分钟。离心后,耗尽了颗粒和75%乙醇洗两次和溶解在diethylpyrocarbonate——(DEPC)治疗DNase我之前处理过的水(Ambion,圣克拉拉,CA)。试剂盒RNeasy列被用来进一步净化RNA根据制造商的指示。

2.5。中存在的比较相对基因表达野生型和突变菌株

执行中存在使用SYBR®绿色™qPCR SuperMix普遍两步中存在工具包(英杰公司)根据制造商的指示,使用表格中列出的引物2。引物对16 s rRNA被用作控制。在第一步中存在,RNA的互补脱氧核糖核酸合成使用上标™三世第一链合成SuperMix(表达载体)组件的工具和25 ng /μl的RNA,与没有RT酶反应混合物。互补脱氧核糖核酸是冷却和混合大肠杆菌核糖核酸酶H,提供的工具包,孵化20分钟在37°C。互补脱氧核糖核酸是稀释和放大中存在的第二个步骤,使用SYBR®绿色™qPCR SuperMix组件的工具。从Bio-Rad C1000热循环仪CFX96实时系统是用于合成用以下参数:50°C 2分钟,95°C 8.5分钟,40 95°C的周期为30秒15秒和60°C。仪器是测量编程融化曲线在65 - 95°C(1°/ 5秒)。Ct(循环阈值)的基因决定。基因表达的褶皱变化计算中每一个基因的突变体和野生型28]。的 T方法被用来计算mRNA表达的相对水平,根据thermocycler应用指南(28]。

表2
比较野生型基因转录的c . perfringens写明ATCC 13124和氟哌酸耐药突变 qRT - 。
2.6。氯化钠对细菌生长的影响存在和缺乏海藻糖

氯化钠浓度为0 - 2%添加了一式三份井的96孔微量滴定板包含嗨,有或没有海藻糖(0.5%)。井被接种野生型和突变体。发现海藻糖的影响在保护细胞的生理盐水,野生型生长的动力学c . perfringens写明ATCC 13124的1%葡萄糖,蔗糖、海藻糖和组合的1%葡萄糖+ 1%海藻糖和1%葡萄糖+ 1%蔗糖被测量。0.5毫升整除的最小媒体补充糖注射隔夜的文化c . perfringens写明ATCC 13124年的0%,0.5%,1%,和2%氯化钠48-well微量滴定板。井满心0.9毫升无菌矿物油文化厌氧。板块被安置在协同Max分光光度计(Biotek工具)和动力学模块的基因5软件(Biotek仪器)是衡量一个程序600年每30分钟37°C。使用Microsoft Excel的动力学分析。

2.7。亚硝酸钠对经济增长的影响存在和缺乏海藻糖

纳米2浓度为0 - 0.8%添加了一式三份井96 -微量滴定板包含BHI和没有0.5%海藻糖。井被接种野生型和突变体和厌氧孵化37°C。增长是监控用分光光度计在600海里。

2.8。pH值对野生型和突变体的生长存在和缺乏海藻糖

嗨介质,其pH值范围在4.8 -10年,准备和分发一井两个96 -微量滴定板。在其中的一个盘子,海藻糖(0.5%)被添加到井中。板块注射一夜之间文化的野生型和突变体和孵化厌氧在37°C。增长是衡量spectrophotometrically 24小时后在600海里。

3所示。结果

3.1。的增长c . perfringens在不同的糖在基本培养基,嗨

发现如果有突变体和野生型之间的差异在不同糖代谢,细菌生长在最小和富媒体含有多种糖。写明ATCC 13124增长野生型定义基本培养基含有葡萄糖、蔗糖、海藻糖、果糖、半乳糖(图1)。突变 增长低于野生型在葡萄糖、果糖和半乳糖,不长在海藻糖和蔗糖(图1)。


图1
野生型的增长c . perfringens写明ATCC 13124和突变 在基本培养基和不同的糖。误差=标准差。

嗨中补充糖,两株(图2)。添加不同浓度的海藻糖BHI导致增加野生型的增长,但只有1.25%海藻糖。添加海藻糖的BHI文化变异 没有对经济增长的影响(图2)。氟哌酸阻力影响各种基因的表达,减少健身的 耐药突变体与野生型相比(28,32]。因此,耐药突变体增长低于野生型,在BHI介质和支持经济增长的基本培养基和糖。


图2
不同浓度的海藻糖对野生型的增长c . perfringens写明ATCC 13124(黑条)和突变 (交叉线棒)在脑心浸液(BHI)。
3.2。序列分析和海藻糖运输和代谢相关基因的表达和调控基因

找出如果缺乏能力的突变体生长的海藻糖是因为突变带注释的海藻糖运输基因或相关分调节基因,这些基因被放大PCR和测序。使用的引物扩增的基因的海藻糖运输操纵子放大同样大小的碎片treB,treC,tr在DNA突变体和野生型。放大的基因的序列treB分,trehalose-specific IIBC组件;treCtrehalose-6-phosphate水解酶;tr这些基因的转录监管机构;和侧翼地区相同的突变体和野生型但有一个例外:一个G的突变368年T在treB导致与Trp 123年低浓缩铀的替换。

其他已知的PTS和全球监管基因c . perfringens也被测序。HPr激酶和磷酸化酶的序列(HPrK CPF_1261),副产物控制蛋白质(CcpA CPF_2863)和σ因子70 (σ70年CPF_0539)参与PTS-related监管职能相同的野生型和突变体。全球监管基因的序列vrr,调节多种基因c . perfringens也是相同的野生型和突变体。然而,分调节基因(CPF_0069),编码转录antiterminator,只有一个突变导致低浓缩铀90 Ser的转换。

3.3。比较基因转录的海藻糖运输和监管的基因

发现如果有差异表达的基因在野生型和突变体,海藻糖运输微阵列数据和基因转录的结果,以存在,这些基因的两个菌株进行比较。微阵列分析数据(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/arrays/A-MEXP-2008/显示变化的一系列基因的转录变异 相对于野生型(28]。表达下调基因之一treB和treC参与的海藻糖运输和代谢。执行中存在的实验,比较几个基因的表达野生型和突变体,证实了微阵列数据的差别,对这些基因的表达treB和treC在突变体 。转录的基因编码的IIBC组件假定的蔗糖分也表达下调(表2)。此外,全球调节基因的表达vrr(CPF_1204)和PTS-associated antiterminator (CPF_0069)基因突变也大大减少 。CPF_0069位于上游的假定的分N-acetylglucosamine-specific EIIA EIIBC操纵子;这些基因的表达也表达下调。

3.4。增长的突变体和野生型氯化钠

发现如果有氯化钠宽容的突变体和野生型之间的差异以及海藻糖是否保护c . perfringens从高盐浓度的影响,菌株生长有不同浓度的氯化钠,有或没有海藻糖。在嗨介质,突变体的生长 不到的野生型(图3)。添加0.25%氯化钠并不影响大幅增长的压力,但与野生型写明ATCC 13124突变 添加0.5%生理盐水不能生长。嗨介质,除了蛋白质的成分,包含生理盐水和其他钠盐。它比最小粘性介质和实际在这个媒介的盐浓度高于0.5%。添加海藻糖增加了宽容的野生型氯化钠的宽容但不影响变异(图3)。


图3
野生型的增长c . perfringens写明ATCC 13124和突变 不同浓度的氯化钠在没有和海藻糖的存在。黑条(野生型没有海藻糖),灰色酒吧(突变体没有海藻糖),虚线酒吧与海藻糖(野生型),和白色的酒吧与海藻糖(变异)。OD测量24小时后的厌氧孵化37°C。

确认海藻糖保护c . perfringens氯化钠,写明ATCC 13124增长动力学基本培养基中葡萄糖、蔗糖、海藻糖测定,分别组合,在0,0.5,1和2%氯化钠(图4)。野生型的增长率是相同的所有糖没有和0.5%氯化钠(图的存在4)。在1%氯化钠,包含葡萄糖的增长率在文化与文化的增长相比降低了海藻糖或蔗糖42%和38%,分别。文化包含海藻糖的增长率最高,表明海藻糖osmoprotective效果;蔗糖也是osmoprotective但程度不一样。海藻糖的osmoprotective效果也比蔗糖文化包含2%的氯化钠,,后一个扩展的迟滞期8 h,细菌生长在文化包含海藻糖或蔗糖。海藻糖的结合与葡萄糖或蔗糖不支持野生型的增长在2%氯化钠。葡萄糖可能有高压影响防护海藻糖和蔗糖的吸收。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图4
野生型的增长率c . perfringens写明ATCC 13124与不同浓度的氯化钠的存在和缺乏基本培养基中海藻糖和蔗糖。没有氯化钠(a), 0.5%氯化钠(b), 1%氯化钠(c),和2%氯化钠(d), G =葡萄糖,T =海藻糖,S =蔗糖、GS =葡萄糖+蔗糖,葡萄糖和GT = +海藻糖。
3.5。亚硝酸钠对野生型和突变体的影响,有或没有海藻糖

由于纳米2作为防腐剂用于食品,它对经济增长的影响野生型和突变体也研究了海藻糖的存在和缺失。NaNO的浓度2写明ATCC 13124,抑制野生型的增长高出两倍的突变 (图5)。海藻糖似乎没有保护应变对NaNO2野生型,但它提高了增长的存在和缺乏NaNO2(图5)。


图5
海藻糖对野生型的生长的影响c . perfringens写明ATCC 13124和突变 嗨介质在不同浓度的亚硝酸钠的存在。黑条,野生型没有海藻糖;与海藻糖点酒吧,野生型;灰色酒吧、突变没有海藻糖;白色的酒吧、突变与海藻糖。
3.6。pH值对写明ATCC 13124野生型和突变体的生长 有和没有海藻糖

自c . perfringens有可能在不同的环境条件下生存,生存的压力与不同的pH值在媒体上也比较的存在和没有海藻糖。写明ATCC 13124年增长比野生型突变体 在嗨介质pH值(4.8 - -10.2)(图进行测试6)。pH值支持突变的增长最低的是5.2,但是野生型生长在文化与pH值低至4.8,在存在和缺乏海藻糖。海藻糖提高野生型的生长在酸性中性pH值,但是它没有影响突变体的生长(图6)。


图6
海藻糖对野生型的生长的影响c . perfringens写明ATCC 13124和突变 在不同的pH值。黑条,野生型没有海藻糖;与海藻糖点酒吧,野生型;灰色酒吧、突变没有海藻糖;白色的酒吧、突变与海藻糖。

4所示。讨论

我们以前fluoroquinolone-resistant突变体的生成c . perfringens表明抗性发展影响代谢活动,生产的毒素,表达不同的基因,细菌在不同的菌株有不同的健身(28,32- - - - - -34]。在这项研究中,我们已经表明,海藻糖代谢和野生型有osmoprotective影响写明ATCC 13124但不是fluoroquinolone-resistant突变 。

突变体不能与蔗糖或海藻糖在基本培养基和基因这些碳水化合物的运输和两个监管基因,转录antiterminator CPF_0069和vrr突变,大幅下调。突变体也不宽容的酸性pH值和氯化钠。BHI介质,海藻糖刺激野生型的增长和增加其耐低pH值和高盐浓度。在基本培养基,海藻糖有osmoprotective效应,使细菌生理盐水浓度高达2%的速度增长。海藻糖因此与细菌的保护环境压力;和缺乏增长的突变 海藻糖和蔗糖在基本培养基符合糖无法运输到细胞。虽然序列treB,treC,和tr,这些基因的上游地区,其中包括σ因子σ70年都是相同的,除了突变treB导致T的转换368年G,转录的treB和treC大幅下调,表明微阵列数据和存在。令人惊讶的是,海藻糖运输调节基因tr(CPF_0543)没有明显的突变(表中表达下调2)。tr属于大型GntR家族的转录监管机构;这个家庭的成员调节不同的生物过程。

海藻糖是涉及一些细菌的保护环境压力(4,5,8,9,14我们已经表明其osmoprotective效果c . perfringens通过展示,添加海藻糖写明ATCC 13124改进的文化宽容的文化盐浓度的增加。通过比较基因的表达提出了参与运输和蔗糖代谢和海藻糖2,24)的突变不能长在蔗糖或海藻糖在基本培养基中,我们已经表明treB和treC参与海藻糖运输和代谢。在差别的原因他们的转录对这些基因的突变是未知的。

的差别除了对这些基因的转录treB和treC,存在结果证实微阵列数据表明表达的转录antiterminator CPF_0069大幅下调的突变 与野生型相比。CPF_0069编码的rna结合蛋白类似BglG-like转录antiterminators发现在其他细菌(22,37,38]。CPF_0069位于上游CPF_0070和CPF_0071,分别编码假定的花絮和IICB组件N乙酰氨基葡萄糖分。微阵列数据显示CPF_0070和CPF_071也表达下调的基因突变和最有可能受antiterminator有关。磷酸转移酶的突变因此展示了几个缺陷表现参与吸收和糖底物磷酸化。然而,CPF_0069的突变的作用,,差别或其对这些基因可能在改变其他基因的表达在耐药突变是未知的和值得进一步调查。

另一个PTS-associated控制基因的转录机制涉及到蛋白质分解产物控制(CcpA),一个主调节全球基因转录的转录因子结合反应副产物元素(cre)当readily-metabolizable碳水化合物存在39]。这种形式的调节是通过磷酸化调节蛋白质分phosphocarrier HPr的氨基酸Ser46 metabolite-activated蛋白激酶,HPrK。HPr (ser) P与CcpA形式复杂,导致DNA结合的刺激。这些蛋白质的编码区域相同的写明ATCC 13124野生型和突变体 ,不到一两个不同的转录水平HPrK (CPF_1261)和CcpA (CPF_2683)野生型和突变体(数据没有显示)。这些蛋白质的作用,如果有的话,在海藻糖运输突变是未知的。

除了监管与分相关联的基因,还有其他监管基因c . perfringens,特别是双组分转导系统(传感器/调节器)VirR /梵调节多种基因,包括监管RNA基因(vrr)和一些毒素40,41]。vrr是一个全球响应监管RNA (VR-RNA),转录是由VirR /梵通过复杂的监管网络通过VirR / VirS-VR-RNA级联,及其VR-RNA记录,而不是蛋白质,有监管活动40,41]。vrr突变是大幅下调。使用新一代测序,基因突变被发现梵的c . perfringens应变 导致引入一个终止密码子结束后蛋白质合成18种氨基酸。这种变化,先前未被发现的28),证实了PCR和测序和可能导致各种基因的转录,变化的差别,包括对这些vrr。Ohtani et al。41的差别)发现对这些基因,包括分基因(cpe1463 - 1466),毒素基因plc)(CPE0036)和一个antiterminator基因(CPE2553)vrr缺失突变体的c . perfringens应变13。虽然在他们的研究中,基因和antiterminator基因表达下调分不同于我们发现fluoroquinolone-resistant突变 的差别,它表明对这些vrr可能影响分c . perfringens。的差别的影响对这些vrr在这项研究中观察到二糖运输需要进一步调查。

添加海藻糖的文化c . perfringens写明ATCC 13124改善文化的宽容盐浓度增加。野生型的增长率相似与不同基本培养基补充糖,有或没有0.5%的氯化钠。当盐浓度增加到1%,文化包含细胞葡萄糖的增长率为0.076 h−1,远远低于经济增长率在文化包含蔗糖(0.1235 h−10.1335)或海藻糖(h−1)。在文化包含2%生理盐水,观察增长只有在文化包含海藻糖或蔗糖。这表明,蔗糖和海藻糖保护细胞免受氯化钠和海藻糖更多的保护。蔗糖保护c . perfringens在l形的形成(17),但这是第一次,海藻糖对保护的影响c . perfringens从生理盐水。

总之,研究表明,海藻糖可以保护c . perfringens从环境压力。此外,CPF_0541注释treB与海藻糖运输,其表达改变gatifloxacin-resistant突变 。

信息披露

这手稿中给出的观点不一定反映美国食品和药物管理局。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢罗伯特·d·瓦格纳博士和约翰·b·萨瑟兰回顾手稿和卡尔·e·Cerniglia博士研究的支持。