文摘
尽管酒糟是浪费的使用有助于补充土壤养分和提高甘蔗作物的质量,众所周知,酒糟残留改变自然土壤中细菌的多样性。酒糟的实际影响应用细菌类群的选择并不理解,因为没有研究直接解决这一现象。16 s rRNA基因克隆序列的分析从四个土壤类型显示,土壤种植甘蔗和受精酒糟有很高的细菌相比其他生物群落的多样性,在Acidobacteria第二个最丰富的门。尽管细菌群落的组成和结构的四个环境中显著差异(Libshuff测试),森林土壤和土壤种植甘蔗没有酒糟肥料相似,因为他们分享至少28辣子鸡Rhizobiales有关,这是重要的代理商参与固氮。辣子鸡属于放线菌目经常被发现在土壤中,酒糟应用,表明这些团体更青睐这种类型的土地管理。
1。介绍
土壤细菌多样性研究与甘蔗种植(糖spp)表明,这些微生物的大部分是未知的1- - - - - -3]。土壤中细菌种类的重要性的研究是基于方法根据种植,因为这些微生物可以提供新的生物资源商业菌剂的生产。研究中使用的细菌提供洞察化合物的生产机制,增加甘蔗产量,如含铁细胞,indolic组件,生物固氮作用,无机磷酸盐溶解(3]。超出了他们的重要性在农艺应用程序中,促进植物生长的细菌(PGPB)可以减轻污染的生态系统的健康当用于污染的生物修复网站(4]。
农业有机废弃物的再利用促进自然资源的保护,帮助在其他矿物元素(碳回收和循环利用5,6]。基于具体建议,再利用这些废物可以提高土壤质量和减少对化肥的依赖,被认为是危险的7]。尽管其重要性补充土壤养分,酒糟可以如果使用不当产生严重的环境影响8因为过度积累的营养会导致污染(4]。酒糟的异质性成分禁忌使用它作为有机肥料的原因很多,最常见的是硝酸钾的浸出,污染地下水7,9]。尽管与酒糟受精的影响土壤的物理化学性质研究了很长一段时间(7- - - - - -9),对其对细菌群落的影响。
这样的研究一直是特异性的,因为间接技术评估当地的微生物群,如呼吸运动计量法通常使用(10]。众所周知,酒糟的使用,与其他农业废弃物的应用程序相比,有利于改善土壤的生物质量因为总细菌的增加人口,特别是放线菌(组7]。
分子技术的使用基于16 s rRNA (16 s rRNA)基因克隆库允许的一种间接评估细菌社区,作曲的细菌群落土壤受到不同农业管理实践,以及对不同细菌群体的组成和多样性的影响(1,2,11]。考虑到土壤中细菌数量的主要部分不能由传统栽培技术(5,12),扮演着重要的角色在不同生态系统的维护2,13- - - - - -15],这些微生物是土壤质量的生物指标(7]。
本研究旨在确定土壤中细菌群落的甘蔗栽培并受不同管理实践使用的分析从16 s rRNA克隆基因的部分序列库。
2。材料和方法
2.1。描述当地的实验和土壤样本
所有样品都是在重复收集0-20厘米深度(393毫升)。点是随机选择中心点的每一个感兴趣的领域:(1)土壤的甘蔗栽培与酒糟有机肥料(SPV);(2)非均匀土壤中含有主酒糟通道(SMC);(3)土壤之前燃烧甘蔗种植和收获(SPS),和(4)次生林土壤(SFS)。
土壤采样的SPV, SMC, SFS执行2010年2月在Itaquere农场(内地的圣保罗,巴西)新星欧罗巴的城市。RB965911(4°切削阶段)被种植在SPV(502米高度,21°49′41,07年′′年代和48°36′11日46′′O)。酒糟是应用于土壤和自2008年以来收获完全机械化,直到取样的时间。SMC(480米高度,21°49 35′,17′′年代和48°36′41岁,06′′O)没有被用于运输酒糟大约15天,因为收割完了。主频道开口是在土壤和酿酒厂生产的用于运输液体酒糟毗邻甘蔗面积在人工重力流。土壤灌溉了酒糟通过电动泵从主频道。由于不断变化的酒糟SMC运输时,不同种植区域土壤颗粒积累和形成的混合物不同土壤的有机废物酒糟和农作物残留物。SFS(海拔475米,21°48′32,77′′年代和48°36′23日68′′O)是位于甘蔗种植区域附近,因为它在一个较低的高度,SFS受人为扰动作物管理,主要是由于雨水携带的土壤和养分的积累。SPS采样2013年1月在保罗D 'alho农场(Bebedouro城市)。这个区域位于580米的高度(20°55′59,90′′年代和48°25′49岁,36′′),种植甘蔗收割燃烧后手动处理甘蔗。
根据Koeppen气候分类、新星欧罗巴和Bebedouro位于圣保罗州西北有温暖的天气,热带雨林气候,干燥的冬季,寒冷的几个月(Aw)。Nova欧罗巴城市每年平均温度29.3°C和1341。4毫米的降水,Bebedouro温度31.0°C和1333。8毫米的降水。
取样后,四种土壤的一部分被转发到实验室分析土壤(Faculdade de Ciencias Agrarias e Veterinarias de Jaboticabal / SP, UNESP,巴西)获得物理化学参数。土壤属性如表所示1。
2.2。DNA提取、PCR、克隆
从每个土壤样本获得的总DNA为土壤®使用一个旋转工具(MP生物医学),根据制造商的指示。16 s rRNA基因部分放大(可变区域1和2)Y1和Y2引物(16),产生聚合酶链反应(PCR)产品约300个基点。PCR反应混合物由20 - 50 ng /μ5.0 L的DNA, pmol /μ每个引物的L, MgCl核苷酸的0.2毫米,3.0毫米2、缓冲1 x和2.5 UTaqDNA聚合酶(路德维希研究)。thermocycler模型ptc - 100™可编程温度控制器(MJ研究,Inc .)使用95°C的热剖面2分钟,35周期45 95°C的年代,65°C 45 s和72°C 1分钟,30年代结束5分钟的72°C。PCR反应后,产品纯化向导®SV凝胶和PCR清理系统(Promega)和PCR克隆CloneJET™使用克隆工具(Fermentas)按照制造商的指示。
殖民地与无菌培养皿收集木制牙签和组织成96 - ELISA板包含100μL与氨苄西林(50 Luria-Bertani介质μg / mL)。经过一夜之间发展克隆的37°C,每个库的一个副本被接种提取质粒DNA (17),100年μL 40%的甘油(v / v)添加到原始库存储在−80°C。
2.3。排序和分类评价
16 s rRNA基因的扩增子使用日元测序引物。DNA序列得到ABI棱镜大染料终结者周期sequencing-ready反应工具包(应用生物系统公司)使用ABI 3100(珀金埃尔默)毛细管音序器,遵循制造商的指示。序列用于分析那些质量Phrep≥20 [18]。搜索嵌合序列进行破解的软件(19)和分类识别的门,类,顺序,家庭,和属的分类器软件使用置信区间的80年,85年,91年,92年,95% (11),分别。序列,取得了95%的信心分类器被用来寻找类似的序列MegaBlast (16 s rRNA细菌和古菌的基因)(20.)从国家生物技术信息中心(NCBI)或SeqMatch核糖体数据库项目(RDP II) (21]。这些搜索2016年3月进行。
2.4。建筑的分类系统树
16 s rRNA基因的序列提交基因库在加入以下数字:SPV (KJ749164-KJ749443), SMC (KJ749444-KJ749650), SPS (KJ748893-KJ749163), SFS (KJ748700-KJ748892)。四个生态系统的序列(SPV、SMC、SPS和SFS) (MegaBlast或SeqMatch)被用来构建系统发育树。数据库序列最相似的序列克隆这项研究被用来比较从基因库中复苏后的种系发生树/国家生物技术信息中心(NCBI)。对齐进行基于ClustalW方法(22)上可用BioEdit 7.2.3 [23]。距离矩阵计算的序列比对程序使用一揽子计划Dnadist PHYLIP v3.6 [24)使用的核苷酸替换矩阵朱克斯和康托尔(25修正)的突变。大型6.06 [26],neighbor-joining方法[27),引导1000复制和一个可选的成对删除,用于建设的系统发育树。
2.5。多样性的评估、图书馆的比较和统计分析
α多样性是通过分析所有克隆的序列(SPV、SMC、SPS和SFS)其次是建造一个稀疏曲线和获得丰富的指数,均匀度,香农(),(1,考虑到3%的进化距离差异相似性(或97%)。也被用来估计γ多样性的样本。细菌的结构之间的显著差异社区被Libshuff表示测试(β多样性)使用Cramer-von米塞斯标准()。获得的价值与Bonferroni调整修正。所有数据得到mothur v.1.33.3 [28]。UniFrac [29日]分析被用来比较每个库使用一个标准化的克隆与100种排列,重叠集群环境选项,和体贴的选择算法,考虑的相对丰度辣子鸡。
3所示。结果
3.1。系统组识别在各种环境中
总共有951 16 s rRNA基因的部分序列嵌合序列的(免费),其中280为恢复从甘蔗的土壤栽培和受精酒糟(SPV), 271年甘蔗的序列从土壤栽培(SPS), 207年从主酒糟通道(SMC),和193年次生林(SFS)的序列。所有的16 s rRNA基因序列扩增子结合,用于后续分析。RDP II的分类学分类中显示11个不同系统组:SPV 11门,SPS七门,SMC五门,SFS有四个门(表2)。变形菌门中最丰富的门四个土壤类型和更频繁的SPS(63%)和SFS(60%),在Alphaproteobacteria发生频率在50%以上。几个相对序列(少于5%)Betaproteobacteria被确定。Gammaproteobacteria只发现在SPS和SMC, Deltaproteobacteria只有在SPV和SFS。
放线菌和Acidobacteria第二个和第三个最丰富的类群,SPS和SFS报道在其他研究30.]。不同于其他土壤中观察到,第二个最丰富的门在SPV Acidobacteria(28%),其次是放线菌分类的6%从属关系。Acidobacteria和放线菌显示相同的丰度在SMC (13 - 14%);和壁厚菌门(7%)门的第三高的频率。虽然不是所有共享的环境,少门也确定在四个环境中,如Planctomycetes Nitrospirae,拟杆菌门,Chloroflexi, Armatimonadetes, TM7 (“Saccharibacteria”)(表2)。一些克隆(17%)没有与可用的序列相似度超过80% RDP II;出于这个原因,这一组被分配到未知的细菌。SPS的生态系统有更少的附属序列为非保密细菌(5%),而SMC环境显示大量的辣子鸡组(25%)(表2)。
辣子鸡与秩序的高频Rhizobiales (Alphaproteobacteria)被发现,这是一群细菌通常存在于土壤发挥重要作用在生物固氮11]。顺序Rhizobiales有不同频率的四个生物群落,确定109年在SPS辣子鸡,73年在SFS辣子鸡,39个辣子鸡SPV, SMC和19个辣子鸡。所有环境显示更高的分类(分类),尽管大多数相似的序列无教养的细菌从土壤中16 s rRNA基因的分析(数据中恢复过来1和2)。
土壤,集群的形成与细分1 - 6、11、13、16 Acidobacteria物种RDP II(分类器和SeqMatch)被观察到。类似于订单Rhizobiales Gp3和Gp4子组Acidobacteria似乎更敏感的相对频率;作为SPV代表22-32辣子鸡附属于这一组物种,SPS, SFS, SMC(图2 - 4物种1)。
3.2。细菌的多样性社区环境
环境多样性指数得到用辣子鸡进化距离≤0.03。所有的多样性和丰富度指数(表4),由稀疏曲线的斜率(数据未显示),显示以下趋势的物种:SPV > SPS > SFS > SMC。尽管SFS的稀疏曲线和SPS似乎表明类似的概要,SPS被认为是一个环境与中间根据香农获得的值和辛普森多样性和丰富性估计超1(丰富的可接受的辣子鸡少)。越多样化环境根据SMC生物群落多样性指数(表4)。因为稀疏曲线没有高原和斜率高环境(数据未显示),很明显,许多新分类群仍然可以发现在任何一个生态系统,证实了辣子鸡(观察到的数量)和价值观得到估计量超1(表4)。
3.3。大量的辣子鸡的影响细菌群落的结构
的Unifrac重叠集群环境的分析清楚地表明,SPS和SFS分享一些共同的类群比较四个环境(图3)。10共享辣子鸡被mothur相似(97%)在这些环境中,几乎是Alphaproteobacteria独有的关系,尤其是Rhizobiales(表3和5)。在后一种测试,SMC和SPV似乎含有细菌社区不同于那些SFS和SPS。尽管SFS和SPS似乎相对类似(图3分子方差),Libshuff测试(日期未显示)表明显著差异()。在该测试中,四个细菌社区从土壤中恢复过来的方向和证明了序列从每个图书馆在每种类型的环境有很大的不同。
4所示。讨论
4.1。系统组中确定土壤的区别
变形菌门,一群的形态、生理和代谢变化31日),已发现土壤中最丰富的集团(30.]和扮演重要的角色在全球碳、氮、铁、硫循环(5,6,32]。这个细菌群体经常被报道在土壤种植甘蔗使用cultivation-dependent技术(3)也通过cultivation-independent分子技术(1,2]。尽管许多proteobacterial菌株被孤立和特点,分析了基于16 s rRNA从环境克隆和基因序列通过焦磷酸测序获得表示,许多成员仍未知,,因此,他们的特定的角色在不同生态系统(海洋沉积物、土壤、厌氧降解的有机成分,等等)也未知的(5]。
在我们的研究中,我们发现,变形菌门的频率和放线菌门和他们的类变量取决于土壤管理的类型。SPV是环境显示变形菌门的最低频率与SPS和SFS(表2)。这些数据表明,变形菌门提出了受损的丰度在土壤酒糟应用程序(SPV)相比,在燃烧管理(SPS),尽管应用酒糟作为甘蔗作物必需营养素的来源。除了SMC,变形菌门的类序列符合那些在大多数土壤中细菌多样性的研究报告(11]。这些现象很重要,因为我们需要文档尽可能多的信息关于酒糟的影响土壤微生物群,一旦这些证据支持开发新的研究和更可持续的农业技术的提高比可用。因此,一个能促进农作物产量的增加和改善甘蔗产业所产生的副产品。
我们也观察到,在四个环境中,与克隆相关序列分配到α-、β-、γ-和Deltaproteobacteria(表2),它强调有遗传资源开发潜力巨大和未知的生物,它们可以通过分子技术的使用。特别是,α-、β-和Gammaproteobacteria包含diazotrophic生物体的能力与植物根系[建立关联2]。至于其他甘蔗土壤1,2少),SPV和SMC克隆隶属于Alphaproteobacteria,丰富得多的SPS和SFS辣子鸡。
Rhizobiales (Alphaproteobacteria)与脱氮过程(检测技术,nirK,nosZ基因克隆)在土壤33)是确定在所有生物群落分析非常丰富,但一些辣子鸡、主要是共享的SPS SFS(表3)。在森林土壤与氮转化为农业和受精,丰富的组织属于此订单减少。由于这群细菌对土壤质量的重视,结合rhizobial菌剂和固氮植物建议提高固氮和恢复生态系统遭受干扰相关的培养(34]。在我们的分析中,引入酒糟SPV和SMC辣子鸡、SPS相比SFS的数量减少;然而,SPV Rhizobiales表现出相当大的频率,保证土壤的质量与氮循环的发展是非常重要的在这个地区种植甘蔗。Acidobacteria增加了丰度相对于其他细菌类群在酸性土壤(14]。尽管SPS比其他土壤pH值较低,Acidobacteria被发现是最常见的第三门SPS和仅次于SPV(表2)。这表明,除了降低pH值、复杂的酒糟组件(有机质含量高、甘油、矿物质,等等)可以作为积极的选择性因素支持增加物种的丰富性Acidobacteria门与其他环境(图1)[7]。和其他土壤的pH值大约4.9 (35- - - - - -37),SPV有较高相关物种的丰富性细分3(32辣子鸡)和4(22辣子鸡)Acidobacteria(图1),可能被降低pH值与酒糟。
门的成员放线菌中发现的有机物质是重要的分解者农业土壤和森林(11因为其成员的能力产生纤维素酶,半纤维素酶,几丁质酶、葡聚糖酶,淀粉酶,能分解植物细胞壁(15]。相比其他更丰富的类群,放线菌由几个物种;其成员有很高的表型多样性,包括无教养的好氧异养生物(30.]。
每个生态系统都有不同的来源等有机物的替代自然植被(SFS)的垃圾残骸,从其他作物作物残留物(SPV、SPS和SMC)和酒糟(SPV)。可能因为这个宽有机质输入的变化,发现放线菌门的三个最丰富的类群在这些环境中,出现在SPV丰富。我们也强调,几乎所有的辣子鸡有关放线菌菌株从四个生物群落相似通常从土壤分离,表现出许多著名的菌株(图特点2)。
在土壤中,异养细菌的人口增长是归因于酒糟的存在(10]。我们的结果同意这些预测,因为许多异养细菌群体被确定在11门中确定SPV,如变形菌门、Acidobacteria,放线菌,厚壁菌门和拟杆菌门(表2)。这些微生物被称为启动子的土壤质量控制,酒糟的潜在选择等细菌类群放线菌(7]。在SPV,放线菌(或放线菌)有一个更高的频率相关的辣子鸡Micromonosporaceae, Nocardioidaceae,分支杆菌科,Pseudonocardiaceae家庭(部分如图2),似乎更青睐在SPV比在其他三个生物群落。
4.2。丰富性和多样性的四个生物群落
与先前的研究在亚热带森林土壤14),我们的生态系统被划分高多样性。根据土壤微生物分析间接访问的酒糟(7,10],SPV有较高的细菌在这项研究中,比任何其他生物群落多样性分析显示潜在的酒糟培养大量的土壤中细菌种类(表4和图1)。森林土壤细菌类群的多样性低于农业土壤,增加相关事实或缺乏丰富的森林土壤对农业土壤中某些细菌类群(11]。由于这些原因,SFS显示不如其他三个土壤细菌物种多样性研究,除了SMC(表4),可能由于非常异构环境受到条件。
4.3。不同的细菌群落的结构
变化引起的不同类型的自然或人为干扰对农业土地和森林造成严重的细菌群落的组成变化(11]包括甘蔗转基因种植的影响和土壤中细菌菌落除草剂的应用程序(1]。Libshuff测试证明这些扰动,意义(数据没有显示)得到的四个环境之间。即使不同的细菌群落的组成,SPF和SFS共享一些细菌类群(表3),这表明虽然受到不同的管理实践,一些类群组成这些土壤中的细菌社区显示生理和代谢相似的特征(图3),如属于订单Rhizobiales辣子鸡。
为四个环境细菌社区之间的这些差异直接反映了观察到的细菌物种。特别是,变形菌门的物种最多样化和环境特殊,在显示相似与不同的细菌分离克隆重要环境生理概要文件(表5)。在SPV,Azohydromonas拉塔病(SPV212),会茁壮地生长(SPV150),Bradyrhizobium valentinum(SPV115)通常与固氮作用和巨大潜力用于生物修复重金属污染的网站(38- - - - - -40]。Acidiphilium cryptum(SMC121)中确定SMC与更多的酸性环境和具有减少铁的能力+ 3和菲+ 2,表示参与铁循环在土壤41]。SPS提出茎菌属vibrioides(SPS230)和Rhodoplanes cryptolactis(SPS052)参与碳源代谢引起的土壤中的有机物质,除了固氮和增长促进植物(42,43]。这种比较表明,在nonadded酒糟土壤(SPS),物种与各种代谢和更适应植物似乎青睐。然而,SPV和SMC土壤宏观和微量营养物质可能比其他土壤由于有机质和矿物质的财富存在于酒糟(7- - - - - -10),异常的氮和铁。出于这个原因,为了解决这些营养素的缺乏,我们推测,细菌在氮和铁的主要重要生态作用周期和他们甚至在酒糟的青睐。
5。结论
酒糟增加土壤中细菌的多样性,促进有利于物种参与氮和铁循环。物种细分3和4酒糟的Acidobacteria更丰富的土壤中应用。物种的家庭属于放线菌目更多样的土壤中酒糟已经申请了甘蔗种植比其他土壤。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
圣保罗(FAPESP)必须占州政府的支持基础和国家技术发展委员会(CNPq)提供金融支持。作者还感谢分析圣达菲S.A.样本的释放,尤其是罗德里戈先生Vezzani Franze。