文摘

子宫积脓是公认的疾病和死亡的主要原因之一,婊子,和大肠杆菌这种疾病的主要病原体。在这项研究中,70年大肠杆菌隔离的子宫角、嘴和直肠bitch(婊子)遭受疾病和43大肠杆菌隔离从临床健康bitch(婊子)的直肠检查uropathogenic毒性基因的存在和对抗菌药物的敏感性。子宫角和嘴的DNA样本的分离与子宫积脓bitch(婊子)是由代表相比,埃里克,BOX-PCR。从犬子宫积脓毒性基因频率在隔离中发现如下:95.7%鱼翅,27.1%的国际空间站,25.7%的他,18.5%的iuc,17.1%的独特销售主张。主要阻力决定了头孢菌素、氨苄青霉素和萘啶酸之间的隔离从所有网站检查。多药耐药性被发现∼50%的子宫积脓隔离。使用一些从子宫分离基因型的方法,脓,唾液一样的婊子被证明有相同的DNA样本是令人担忧的理由之一是因为家庭宠物和人类之间的密切关系。

1。介绍

子宫积脓(慢性子宫炎子宫积累脓)是最常见的疾病之一,bitch(婊子)(1]。这是一个潜在的威胁生命的条件主要是在中年岁bitch(婊子)。这种疾病通常发生在发情周期的黄体期,它与激素变化和细菌感染1]。临床症状取决于疾病的阶段,但常见的症状是阴道分泌物、烦渴、多尿症,食欲不振,无精打采。最安全的治疗子宫积脓是外科卵巢子宫切除术(立即清除感染源),也可以防止复发(2,3]。

有时链球菌物种,克雷伯氏菌物种,葡萄球菌物种,巴斯德菌物种,普罗透斯物种,假单胞菌物种与子宫积脓感染(4),但大肠杆菌从子宫内容孤立在大多数(82 - 100%)的临床病例子宫积脓,参与子宫积脓和菌株表现出极大的相似性大肠杆菌隔离从尿路感染(UTI),可能是因为这两种临床表现出现细菌感染和提升主持人的阴道或肠道菌群4]。它已经表明,尿路上皮细胞和子宫内膜的有亲和力大肠杆菌当敏化,高水平的孕酮(5,6]。Uropathogenic大肠杆菌(UPEC)不同于共生的肠道大肠杆菌由于专业的存在毒力因素(VF)如依从性和铁吸收系统和细胞毒素uropathogenic特定蛋白质(独特销售主张)[7,8]。

狗代表潜在的抗菌素耐药性传播来源由于抗菌药物的广泛使用在这些动物及其与人类密切接触(9]。几项研究已经表明可能的耐药生物交流和/或他们的人类和他们的宠物之间抗性基因9,10]。已经有一些研究对抗菌素的耐药性细菌中分离出的母犬子宫子宫积脓(11- - - - - -13]。

子宫积脓是婊子的主要疾病之一,它代表了一种对公众健康的潜在风险由于阴道分泌物可以感染到人类和大多数的来源大肠杆菌菌株分离子宫和泌尿系子宫积脓的bitch(婊子)是相似的4]。本研究的主要目的是评估抗菌素耐药性和毒力基因的存在大肠杆菌隔离从不同的站点获得bitch(婊子)患有子宫积脓和发现之间的相似性得到隔离。

2。材料和方法

2.1。收集的样本子宫积脓和健康的婊子

28在私人诊所临床确诊子宫积脓Ituverava市圣保罗州,研究了从3月到2012年8月。诊断是根据临床症状,通常都被看成是证实了放射学和/或超声。外科卵巢子宫切除术之后执行。切除子宫后,用无菌技术和无菌可废弃的注射器和针头,5毫升样品都是从每一个子宫角。同时无菌棉签收集口(唾液)和直肠(粪便)。在同一时间在同一诊所无菌棉签收集从直肠(粪便)6临床健康的婊子,几乎相同的平均年龄。粪便菌株获得健康对照组被用来检测潜在uropathogenic在子宫积脓毒性因素隔离进行比较。

样品在冷冻条件下被运到实验室。后1小时内收集所有标本接种到血琼脂(Oxoid)和MacConkey琼脂(Oxoid) 37°C 24 h。孤立的微生物被确定(15和分类根据克里格和霍尔特16]。所有菌株都储存在−20°C。只有大肠杆菌隔离进行了研究在目前的工作。从原始MacConkey板块至少五个殖民地从每个网站收集的母犬子宫积脓和至少10殖民地的粪便临床健康bitch(婊子)是随机选择的,亚文化MacConkey琼脂,提交给生化测试确认E。杆菌隔离(17]。

2.2。抗菌药物敏感性的大肠杆菌隔离

抗菌药物敏感性测试执行使用磁盘扩散法作为推荐的临床和实验室标准协会(18),总共12商业制备抗菌敏感性光盘(Laborclin、巴拉那河、巴西)有以下抗菌药物和使用浓度:阿米卡星(30μg),氨苄青霉素(10μg),头孢菌素(30μg)、头孢西丁(30μg),头孢曲松(30μg)、环丙沙星(5μg)、庆大霉素(10μ萘啶酸(30克)μ呋喃妥英(300克)μ诺氟沙星(30克)μ四环素(30克)μg)和妥布霉素(10μg)。大肠杆菌写明ATCC 25922和写明ATCC 35218参考菌株被用作控制。

2.3。毒力基因PCR的检测

大肠杆菌菌株生长在Luria Bertani肉汤(LB-Oxoid)一夜之间37°C (16 h)。细菌是从1.5毫升肉汤,颗粒状悬浮于200年μL无菌蒸馏水,煮10分钟的100°C。离心后的溶解产物,一个150μL样本的上层清液储存在-20°C DNA作为模板股票(19]。PCR检测化验人民行动党GII(编码人民行动党GII adhesin P菌毛),鱼翅H(1型菌毛),他F (α溶血素),iucD (aerobactin),独特销售主张(uropathogenic特定蛋白质),国际空间站(增加血清生存)上执行大肠杆菌隔离使用底漆对建立[8,14]。预测放大产品的尺寸和具体的退火温度在表1。

PCR扩增使用细菌的DNA提取作为模板进行了总量的20.0μ4.0 L,包含μL DNA上层清液,0.8μ每个引物的L(40毫米),0.4μL(2毫米)的四个deoxynucleotides三磷酸腺苷(核苷酸),3.6μL 10 x PCR缓冲(100毫米Tris-HCl (pH值8.8),MgCl 15毫米₂500毫米氯化钾,特里同x - 100) 1%, 0.2μL Taq DNA聚合酶(Fermentas)。放大过程中由最初的变性在94°C的5分钟埃普多夫Mastercycle梯度thermocycler,紧随其后的是25变性周期在94°C,持续30秒,在特定的温度下退火45秒,在72°C扩展1分钟,最后在72°C扩展步骤7分钟。

5毫升的缓冲溶液(0.25%溴酚蓝50%甘油)被添加到每个反应混合物和10μ分析了L的最终解决方案在2%琼脂糖凝胶电泳(Amersham淀粉微球生物科技)40分钟的三羟甲基氨基甲烷醋酸缓冲液使用Gibco BRL水平凝胶电泳装置。扩增子与溴化乙锭染色(1.5μg / mL) 15分钟和凝胶拍摄。大小的扩增子相比,测定1 Kb DNA梯(Fermentas)上运行相同的凝胶。大肠杆菌菌株FVL2, FVL8, FVL16博士提供的科学博士雷特,由,坎皮纳斯,和应变发射极耦合逻辑命令博士提供的13256年J。米,将进医学院学习Veterinaire de L '大学蒙特利尔FCAV,兽医病理学部门。他们作为毒性基因控制。

2.4。基因型的方法

基因组DNA是孤立的大肠杆菌隔离使用向导基因组DNA净化设备(Promega),遵循制造商的指示。遗传多样性是评估使用REP-PCR底漆:Rep1R-I(5′三世协调小组协调小组ICA TCI GGC 3′)和Rep2-I(5′协调小组ICT答的是到岸价GCC TAC-3′), ERIC-PCR引物:ERIC 1 r (5′ATG TAA GCT有条件现金援助GGG得到柠檬酸C 3′)和埃里克·2(5′亚美大陆煤层气有限公司TAA GTG行动GGG GTG AGC G 3′),和盒子A1R引物(5′CTA CGG CAA GGC广汽GCT广汽G 3′) (20.- - - - - -22]。

一个PCR混合物是用于所有放大:20(反应体积μL)、缓冲1 x(100毫米Tris-HCl pH值8.8;500毫米氯化钾;0.8% (v / v)诺乃清洁剂P40);2毫米MgCl₂;0.2毫米核苷酸;1.5 U Taq;5ρ摩尔每个引物;60 ng基因组DNA;直到20.0和双重蒸馏水μl . PCR程序包括以下步骤:4分钟在94°C, 35周期在94°C 1分钟,1分钟40°C REP-PCR, ERIC-PCR 50°C;BOX-PCR 55°C, 1,在72°C 5分钟,10分钟的最后一步72°C。PCR后,产品是加载在1%琼脂糖凝胶和拍摄使用凝胶DOC XR photodocumentation系统(Bio-Rad)。扩增子大小测定相比之下100 pb DNA梯(表达载体)。

执行代表,埃里克和盒子指纹分析,一个二进制矩阵加上1和0,代表存在和没有乐队,分别在一个距离矩阵转换软件4.0版本PAUP b10(系统发育分析使用吝啬)(23]。菌株的系统树图可视化利用UPGMA(未加权的两组方法使用算术平均)分组使用软件超级4.0(分子进化遗传学分析)(24]。相同的软件被用来评估之间的遗传距离隔离。

3所示。结果

共有84个样本收集的三个站点(子宫角(脓),嘴(唾液)和直肠(粪便))从28 bitch(婊子)诊断子宫积脓手术后卵巢子宫切除术。观察细菌生长在57个样本(67.8%)。大肠杆菌从子宫分离样品在9 bitch(婊子)(32.1%),其中6 bitch(婊子)显示增长从至少两个不同的集合网站(其中一个是总是从子宫角)。从这些选择与子宫积脓70 6 bitch(婊子)大肠杆菌隔离被找到(25从子宫,26日从唾液,从粪便和19)(表2)和用于PCR分析检测毒性基因的存在(表3)。使用大肠杆菌隔离在不同站点收集相同的动物可以比较DNA分离株之间的相似性。尽管所有的大肠杆菌隔离与子宫积脓bitch(婊子)起源于只有6个婊子,这是相同数量的动物检查Hagman和库恩(4]。也允许一个比较,43岁大肠杆菌隔离的粪便6临床健康bitch(婊子)进行了分析;结果总结在表3。六十七隔离(95.7%)是积极的鱼翅隔离,13例(18.5%)阳性iuc,18隔离(25.7%)呈阳性他12隔离(17.7%)呈阳性usp,和19个分离株(27.1%)呈阳性国际空间站犬子宫蓄脓隔离。所有的样品分析是积极的papG二世。的70个样品,2(2.8%)不存在积极的VF基因分析。

VF基因中大肠杆菌隔离来自bitch(婊子)与子宫积脓(脓、唾液和粪便)和健康的(粪便)(表3)。VF基因的数量/隔离表所示4。大部分的隔离只携带1 VF基因没有任何类型的患病率在不同站点的样本集合。

12种抗菌药物的敏感性大肠杆菌隔离从犬子宫积脓表所示5。从子宫中隔离观察脓最高电阻对头孢菌素(68.0%),其次是氨苄西林(56.0%)和萘啶酸(56.0%),在唾液中分离出的最高频率是四环素(84.6%)、氨苄西林(84.6%),和萘啶酸(84.6%)和粪便中分离是呋喃妥英(78.9%)、头孢菌素(68.4%),和四环素(63.1%)。为了更好地理解的抗菌药物的敏感性大肠杆菌同桌的菌株从母犬子宫积脓和临床健康的婊子,一个表是使用八个抗菌药物广泛应用于巴西兽医诊所。在同一表提出了一个分布的耐药表型的数量大肠杆菌隔离(表6)。

氨苄青霉素除外,其他抗菌药物表现出更高的耐药表型患病率大肠杆菌隔离从犬子宫蓄脓比健康的狗。多药耐药性(MDR)特征阻力三个或更多抗菌药物中被发现大肠杆菌隔离从粪便的婊子,子宫积脓和健康的,但它是更大的子宫积脓(10/19 - 52.5%)比健康的(8/43 - 18.5%)(表6)。

大肠杆菌菌株不同站点的bitch(婊子)与子宫积脓被代表了,埃里克,BOX-PCR为了评估他们的遗传变异性和歧视他们根据他们的主机。隔离选择要分析是由于相似的毒性基因编码和抗菌素耐药性模式表现出的菌株在每个婊子从不同的网站。获得的结果显示一个伟大的遗传多样性在不同动物的隔离,但细菌从同一动物隔绝唾液或在某些情况下子宫脓显示伟大的相似性。隔离被分组在系统树图根据他们获得的动物(图1)。最大的遗传多样性被发现在隔离的婊子3号(遗传距离:0.300)相比与婊子2号(遗传距离:0.244)和4(遗传距离:0.033)。埃里克和BOX-PCR表现出相同的结果。的大肠杆菌隔离从健康狗狗的粪便没有分析了代表,埃里克,或者BOX-PCR由于小的机会展示任何相关样本bitch(婊子)与子宫积脓。

4所示。讨论

子宫积脓是一种潜在威胁生命的条件主要是在中年bitch(婊子)岁,特点是在子宫腔脓的积累。高达24.0%的完整bitch(婊子)的影响在10岁之前(25]。据信在犬子宫积脓,子宫感染的细菌通过提升阴道通过子宫颈(2,26]。

Uropathogenic大肠杆菌(UPEC)是最常见的病原体分离与子宫积脓犬子宫7,8,11]。的能力大肠杆菌遵守特定抗原站点在子宫内膜刺激孕激素解释患病率越高大肠杆菌在子宫积脓1,6]。

细菌膜对粘膜感染的第一步,通常通过丰富,结合glycoconjugate粘膜表面的受体(6,27]。的鱼翅可以检测到100%的H adhesin基因大肠杆菌子宫积脓隔离bitch(婊子)的聚合酶链反应(7),已被证实能促进绑定UPEC犬子宫内膜(6];在现在研究这个基因被发现大约100%的隔离,不仅从子宫中脓,而且那些从唾液和粪便犬子宫积脓以及粪便的健康bitch(婊子)(表3)。

其他uropathogenic毒性因素(UVF)来解释也很重要E。杆菌子宫积脓的发病机理。的人民行动党G基因已经被报道在狗8,11,28,29日]。这个分子有三种变体(类I, II, III)。我主要是粪便中发现隔离等位基因,在肾盂肾炎隔离等位基因II, III等位基因在急性膀胱炎隔离(30.,31日]。人民行动党GII通常是与肾盂肾炎和观察到22.0%的菌株分离犬泌尿道感染(29日];然而,这种基因中没有检测到泌尿道感染隔离报告Siqueira et al。8),但作者报道的5.8%人民行动党从子宫积脓GII基因之间的隔离。因此,的存在人民行动党GII在大肠杆菌隔离来自子宫样品可能支持这一事实肾盂肾炎是子宫积脓的最严重的并发症之一;所以,搜索是很重要的人民行动党GII基因。在这项研究中人民行动党GII没有被发现在所有隔离检查从不同的网站。

除了人民行动党犬类菌株包含其他virulence-associated人类ExPEC菌株的基因特征。α溶血素是一种成孔毒素,不仅会溶解红细胞(30.),但也白细胞、内皮和肾上皮细胞(32]。据报道在很多大肠杆菌隔离从犬子宫积脓,52.0%7),34.4% (11),34.6% (8),而据报道在少数大肠杆菌隔离从粪便25.0% (7)和12.7% (8]。在目前的研究中他基因被发现在相反的分布,16.0%在子宫积脓(脓)隔离,和47.3%粪便分离从相同的婊子。然而,当焦点的患病率他基因之间的大肠杆菌隔离从健康bitch(婊子)的粪便,16.2%的频率接近他人报道(7,8]总是比较孤立于子宫积脓(子宫脓)粪便的隔离健康bitch(婊子)。

几乎同样的情况被发现有两个其他毒性基因与报告的结果相比Siqueira et al。8]。的iucD(螯合铁吸收)基因编码的酶参与的生物起源aerobactin [30.]。它被发现在Siqueira et al。8在17.3%的大肠杆菌隔离从粪便从子宫积脓和1.8%的隔离,在本研究被发现在4.0%的子宫积脓的隔离,隔离(脓)和36.8%粪便从相同的婊子。的独特销售主张(uropathogenic特定蛋白质)的基因之间的报道大肠杆菌隔离尿液和粪便的同伴动物(猫和狗)33),它应该作为细菌素。Siqueira et al。8报告了69.2%的发病率大肠杆菌从粪便分离子宫积脓和0%的隔离。在目前的研究中被发现的患病率20.0%大肠杆菌从粪便分离子宫积脓和15.7%的隔离。

总的来说结果报告陈et al。7)和Siqueira et al。8)表明,大肠杆菌隔离从子宫积脓(脓)进行一些VF基因(他一个,iucD,独特销售主张)的比例高于大肠杆菌隔离从粪便的健康bitch(婊子)作为控制。陈等人。7]证明了VF基因的一个链接大肠杆菌隔离从犬子宫积脓,大量的VF基因/隔离。在目前的工作获得的结果并不意味着这种优势的VF基因在子宫积脓隔离和孤立的网站检查,除了两个隔离一个来自子宫积脓和一个来自粪便,携带一个或两个VF基因/隔离。

增加血清生存基因(国际空间站)长期以来被公认为在ExPEC毒性作用;国际空间站已被确认为显著特点的禽流感ExPEC但不是人类ExPEC [34]。然而,最近,国际空间站基因是由Huber et al。35在一只狗应变与扩展频谱β内酰胺酶——(ESBL)生产大肠杆菌。这个基因的确切重要性并不清楚,所以它已经在所有的测试大肠杆菌菌株在目前的研究中恢复过来。它观察到一个非常相似的频率之间大肠杆菌隔离从子宫脓(12.0%)和唾液(19.2%),但一个非常不同的频率从隔离粪便(57.8%)在犬子宫积脓。目前我们没有一个解释上述的差异。

伴侣动物和人类之间的关系发生了巨大的改变在整个年,狗是与人类密切接触的越来越多。接触密切的身体接触、抚摸和舔发生在高频率的基础上目前的家庭宠物的看法实际家庭成员的风险极大增加什么抗菌素耐药细菌的传播从宠物对人类9,36),或其他基因的传播与毒力因素(34]。

抗菌素抗性的菌株大肠杆菌从子宫积脓已报告了作者(11- - - - - -13]。最高的阻力之一大肠杆菌子宫积脓隔离在这个研究是头孢菌素和氨苄青霉素同意Coggan et al。11),但高于报道结果Siqueira et al。12和井上等。13氨苄青霉素。也结果报告给环丙沙星、诺氟沙星和庆大霉素敏感同意那些报道Siqueira et al。12),Coggan et al。11井上,et al。13]。

在当前研究中首次抗菌素耐药性大肠杆菌隔离的粪便bitch(婊子)痛苦子宫积脓的阻力与隔离从健康的婊子。高阻频率的隔离中子宫积脓bitch(婊子)可以表明,bitch(婊子)与子宫积脓接触抗菌药物很长一段时间,与一个伟大的选择微生物耐药基因的数量令人担忧的理由之一由于与人类密切接触。

一个高程度的multiresistance大肠杆菌隔离是一个很好的问题,因为犬MDR大肠杆菌已被证明具有类我integron-associated抗性基因已经被确认在人类临床感染细菌分离10]。这表明犬和人类之间传播的常见的耐药机制细菌隔离(37]。

目前的研究表明,DNA样本大肠杆菌隔离从子宫积脓感染不同bitch(婊子)变化很大,因此属于不同的克隆,这一发现支持的结果和田et al。26和陈等。7]。的大肠杆菌隔离从子宫脓和唾液所示相同的动物有时难以区分这项工作,这是一个值得关注的原因由于密切的家庭宠物和人类之间的关系。研究正在进行多长时间在我们实验室验证大肠杆菌菌株在唾液是可行的,可以传播。

利益冲突

没有利益冲突有关的出版。

承认

作者感谢fap (Fundacao de帕罗Estado de Sao Paulo)对金融支持实验室。