文摘

霍乱弧菌霍乱、腹泻病的病原体,在水生环境中生存。细菌已经开发了一种生存策略里面成长和生存Acanthamoeba castellanii。它已被证明霍乱弧菌表达的外膜蛋白毒性因素发挥作用的坚持宿主细胞相互作用。这项研究调查了角色的外膜蛋白(OmpA)和外膜囊泡(omv)的生存霍乱弧菌独自一人,在其相互作用答:castellanii。结果表明,一个OmpA突变体的霍乱弧菌存活时间比野生型霍乱弧菌当单独培养。共培养与答:castellanii增强和菌株的生存OmpA蛋白质表现出对附件没有影响,吞没,生存在变形虫。然而,共培养的OmpA突变体的霍乱弧菌减少的可行性答:castellanii这个发布omv比野生型菌株霍乱弧菌。令人惊讶的是,治疗变形虫细胞的omv孤立OmpA变异显著减少可行的变形虫细胞计数。总之,结果可能会强调监管规则OmpA在生存的霍乱弧菌和omv的这种细菌的毒力因素对真核生物的环境。

1。背景

霍乱弧菌是一个弧形,杆状,革兰氏阴性细菌导致严重的腹泻疾病霍乱。其自然生态系统包括水生环境特有的位置。两个主要的毒性的因素霍乱弧菌霍乱毒素(CT)和一个肠道殖民因素称为毒素coregulated纤毛(TCP)。最近的研究表明,霍乱弧菌开发了一种生存策略成长和生存在独立生存的变形虫Acanthamoeba castellanii(1- - - - - -3]。

霍乱弧菌响应环境变化通过改变蛋白质组成的外膜(OM)。这OM由蛋白质和脂多糖(LPS) [4,5]。然而,它已经发现,OmpA霍乱弧菌股47.8%相似的大肠杆菌。OmpA是一个β桶蛋白膜和中高度保守的革兰氏阴性细菌(6]。是表达了非常高的水平,是在转录后的严格监管的水平。它可以作为一个adhesin和侵袭素,参与生物膜的形成,作为免疫目标和evasin,和几个噬菌体作为受体(7,8]。它已被证明大肠杆菌利用OmpA粘附希拉上皮细胞和Caco-2结肠上皮细胞(9]。

omv是由大多数革兰氏阴性细菌,包括弧菌物种(10]。囊泡含有外膜蛋白、脂多糖和磷脂,当他们被释放从表面,囊泡诱骗一些潜在的周质。他们可以提供毒素和其他毒性因素主机在相对较高的浓度,而不需要细菌和目标人体细胞之间的密切联系,并被认为是一个关键因素影响炎症反应在宿主细菌病原体(11- - - - - -16]。

omv释放由革兰氏阴性细菌作为一种新颖的应激反应(14,17),而外膜蛋白(Omp)扮演了重要的角色在坚持在小肠粘膜膜和可能的保护性抗原(14]。因此本研究的目的是检查OmpA的作用和影响,omv的生存霍乱弧菌孤独及其相互作用答:castellanii。

2。材料和方法

2.1。微生物培养基、生长条件

在这项研究中使用的菌株是野生型的霍乱弧菌应变A1552 O1 El Tor稻叶型(18),其OmpA突变体的内部在坐标系删除OmpA围、博士提供的基因,请默奥大学。已经证明OmpA突变体细菌无法产生OmpA蛋白,与野生型菌株(7]。Acanthamoeba castellanii从美国获得类型文化集合(写明ATCC 30234),马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国。

霍乱弧菌菌株在Luria-Bertani储存冷冻(磅)中有15%甘油−80°C。两菌株生长在一夜之间在37°C在磅磅之后盘子和肉汤,用颤抖的吸光度_600年0.6。答:castellanii生长不摇晃在30°C的最终浓度10⁶写明ATCC介质编号为712 /毫升。

2.2。共培养

共培养的分析是基于一个方法之前1]。Axenically变形虫种植水平维持在30°C到最后2×10的浓度⁶细胞/毫升写明ATCC介质(如上所述)。共培养的霍乱弧菌与答:castellanii被孵化NUNC组织培养瓶(75厘米吗²)从VWR购买国际(瑞典斯德哥尔摩)。每个瓶包含50毫升写明ATCC 712包含介质答:castellanii在一个2×10的浓度⁵细胞/毫升和特定的霍乱弧菌物种的浓度2×10⁶细胞/毫升。控制烧瓶内含有细菌或变形虫只准备以同样的方式和相同的初始浓度coculture烧瓶。水瓶都是准备一式三份和孵化30°C。定期采集标本和镀血琼脂平板上的生长和存活霍乱弧菌。

2.3。隔离外膜囊泡和估算的蛋白质浓度

omv被超速离心法分离,如前所述16]。霍乱弧菌菌株在肉汤培养生长对数期后期。肉汤文化被离心机在8000 g(30分钟,4°C) ja - 25.50转子(贝克曼仪器公司)。过滤(0.22μm;微孔)上层清液离心机在85000 g (2 h, 4°C)在70年的Ti转子(贝克曼仪器公司)收集omv。颗粒与PBS洗两次,悬浮在PBS的总量500μL,用作omv准备。中的总蛋白浓度OM囊泡测量由布拉德福德spectrophotometrically化验(Bio-Rad)。

外膜囊泡的效果的可行性答:castellanii孵化了50μ包含10 L变形虫细胞悬液⁶cell / 50毫升μ从每个菌株L OM泡准备或50μL个基点的控制。一式三份实验和变形虫的可行性检查2小时后活菌计数利用红霉素B染色(写明ATCC)。

2.4。细菌粘附

Cocultures的霍乱弧菌A1552和OmpA突变株与答:castellanii75年孵化厘米吗²细胞培养瓶含有50毫升写明ATCC介质编号为712的初始浓度10⁵细胞的答:castellanii/毫升和10⁶每一个细胞霍乱弧菌应变/毫升。烧瓶孵化没有摇晃后30°C和样本撤回1 h,以确定细菌坚持变形虫细胞的百分比。这样做是变形虫粘细菌的数量除以总数变形虫有或没有粘细菌和乘以100。

2.5。细菌吸收、生长和细胞内生存

的能力答:castellanii拿起霍乱弧菌A1552菌株的影响OmpA突变菌株的吸收和细胞内增长检查通过比较野生型A1552和交互OmpA变形虫的突变。

Cocultures每个菌株答:castellanii孵化在75毫升细胞培养瓶含有50毫升写明ATCC中等号码712的初始浓度10⁵细胞的答:castellanii/毫升和10⁶每个菌株的细胞/毫升。烧瓶孵化没有摇晃在30°C 2 h。每个细胞悬液离心10分钟在300 g Labofuge GL离心机(VWR国际)和洗6次在PBS去除nonadhered细胞外霍乱弧菌。丸resuspended在1毫升PBS和孵化500毫克/毫升庆大霉素在室温下1 h。样品被稀释在9毫升PBS和离心10分钟300 g。每个小球resuspended写明ATCC介质体积50毫升的75厘米²培养瓶分析吸收、细胞内生长和生存的霍乱弧菌菌株。1毫升部分从每个瓶在300 g离心10分钟,每粒稀释双重的0.1%钠脱氧胆酸盐permeabilize变形虫细胞。一系列的10倍稀释的样本10¹到10¹⁰准备在血琼脂平板和传播。一夜之间,所有的盘子被孵化在37°C,和可行的数量进行吞噬细菌。reculture烧瓶内孵化没有摇晃在30°C到调查的细胞内生长和存活霍乱弧菌使用庆大霉素试验菌株和可行的计算15天。

3所示。结果

3.1。依从性、吸收和胞内增长

估计的依从性霍乱弧菌野生型和OmpA突变株变形虫细胞,每个菌株坚持的百分比答:castellanii决心和发现和,分别。野生型和之间的依从性差OmpA突变体的霍乱弧菌没有统计学意义(t以及,)。

估计吞噬细菌的生长和存活庆大霉素治疗和再栽培后,细胞内细菌的数量估计是可行的。活菌计数的实验野生型OmpA突变体的霍乱弧菌是细胞/毫升分别为cell /毫升(图1)。细胞内的野生型和可行的计数OmpA突变体的霍乱弧菌2个小时后细胞/毫升分别cell /毫升,24小时后细胞/毫升分别为cell /毫升(图1)。野生型的吸收和细胞内增长OmpA突变体霍乱弧菌没有显著差异(t以及,)。

3.2。生长和存活的野生型OmpA突变体霍乱弧菌培养独自

可行的野生型和计数OmpA突变体霍乱弧菌培养的缺失答:castellanii显示10⁶两倍增加后1天。令人惊讶的是,野生型菌株仅存活了三天,虽然OmpA突变体的霍乱弧菌存活超过2周,活菌计数的细胞/毫升一天15(图2)。野生型和存活率OmpA突变体的霍乱弧菌明显不同(t以及,)。

3.3。生长和存活的野生型OmpA突变体霍乱弧菌Cocultivated与答:castellanii

可行的野生型和计数OmpA突变体霍乱弧菌cocultivated与答:castellanii显示10³倍增加紧张的一天后。令人惊讶的是,野生型和OmpA突变体霍乱弧菌存活超过2周,但可行的数量是不同的(细胞/毫升细胞/毫升15天,resp)(图3)。

的存在答:castellanii加强野生型和生存和发展OmpA突变的污渍霍乱弧菌(图3)的价格相比缺乏答:castellanii(图2)。cocultivated野生型和增长OmpA突变株的霍乱弧菌不同显著(t以及,)的增长OmpA突变是高于野生型菌株(图3)。

3.4。生长和存活的答:castellanii单独或与野生型和CocultivatedOmpA突变株的霍乱弧菌

可行的数量答:castellanii孤独和cocultivated与野生型霍乱弧菌从细胞/毫升和细胞/毫升,15天后分别。相比之下,可行的数量答:castellaniicocultivated与OmpA突变体霍乱弧菌减少从细胞/毫升cell /毫升后15天(图4)。

共培养的变形虫霍乱弧菌菌株表明的增长率答:castellanii在野生型或OmpA突变体霍乱弧菌明显不同(t以及,和、职责)。然而,增长率之间的区别答:castellaniicocultivated与野生型或OmpA突变体的霍乱弧菌是不那么重要()。

3.5。生产的外膜囊泡霍乱弧菌omv的压力和影响答:castellanii生存能力

omv是从野生型和孤立的OmpA突变株中描述的部分2。两个菌株的囊泡释放的数量是通过测量蛋白质含量相比,它被发现μ野生型和g / mLμg / mLOmpA突变株(图5)。这种差异在蛋白质浓度显著(t以及,)。

治疗细菌的变形虫囊泡显示omv降低变形虫细胞的可行性后2小时的潜伏期。这样的活菌数答:castellanii孵化的omv野生型霍乱弧菌omv的OmpA突变株,PBS,细胞/毫升,细胞/毫升,这占了79%,74%,和100%的可行性,分别(图6)。的活细胞数显著降低与PBS的变形虫omv对待治疗OmpA突变体霍乱弧菌(t以及,的降低不显著),但从野生型变形虫omv对待霍乱弧菌(t以及,)。然而,这种差异在阿米巴生存能力可能是由于的能力OmpA突变体的霍乱弧菌产生更多的omv,证明这里的歌曲等。7]。

4所示。讨论

霍乱弧菌利用一些生存策略在水生环境中,如生物膜的形成,从平滑切换到有皱纹的菌落形态类型,和协会独立生存的变形虫(19]。研究表明,霍乱弧菌增强了协会的增长答:castellanii(1- - - - - -3)和微生物都被发现在同一水样从霍乱流行地区20.]。本研究调查的角色OmpA蛋白质和外膜小泡释放霍乱弧菌在生存和真核宿主细菌的相互作用答:castellanii。

结果表明,在缺乏答:castellanii,OmpA突变体霍乱弧菌存活了更长的时间比野生型(> 15天)霍乱弧菌(3天)。在这种情况下,所有CFU从野生型的损失霍乱弧菌培养在这丰富的变形虫中没有观察不仅本文还以前等其他细菌土拉杆菌内(21),痢疾,和美国sonnei(22]。

弗朗西斯氏菌属和志贺氏杆菌物种是兼性胞内变形虫细胞内细菌繁殖和剩余可培养的实验期间相比,细菌没有成为noncultivable的变形虫。此外,细胞外细菌的相互作用铜绿假单胞菌与答:castellanii显示,生长和存活的铜绿假单胞菌是相同的在实验期间是否变形虫在场或缺席23]。然而,霍乱弧菌O1,霍乱弧菌O139,诉mimicus失去了所有CFU野生栽培缺席的变形虫从培养的第4天22,24- - - - - -26),这是证明霍乱弧菌死亡,没有进入可行但nonculturable (VBNC)状态后的损失从野生型(CFU25]。问题是如何OmpA突变体的霍乱弧菌存活时间比野生型菌株。

在目前的研究中,发现OmpA突变体的霍乱弧菌产omv显著高于野生型菌株,证实先前的发现歌曲等。7]OmpA蛋白质的缺乏会导致更多的omv的生产。本研究的一个有趣的观察是,omv的重要生产可能有丰富的栽培介质和支持更长的生存与野生型相比,突变株霍乱弧菌。

调查变形虫omv的效果,答:castellanii细胞培养的悬浮omv隔绝霍乱弧菌压力。可行的统计显示减少的可行性答:castellanii在这两种情况下;这可能表明对变形虫omv的毒性作用,在与其他研究协议(7,27]。

的相互作用霍乱弧菌压力与答:castellanii包括附件的细菌变形虫细胞,吞没,在变形虫细胞内生长,和生存。吞没,细胞内生长,细胞内的野生型和生存OmpA突变体霍乱弧菌没有显著不同。在这种背景下,Abd et al。1发现胶囊和有限合伙人O-side链并不影响吞没,细胞内生长,细胞内生存霍乱弧菌O139互动时答:castellanii。

结果还表明,存在答:castellanii加强野生型和生存OmpA突变株的霍乱弧菌。这是与先前的发现,交互的协议答:castellanii与野生型霍乱弧菌突变株O139,胶囊,胶囊/有限合伙人双突变株增强这些菌株的生存1]。此外,尽管这一事实霍乱弧菌O1 El Tor具有mannose-sensitive血凝素伞霍乱弧菌O1古典不,他们增强了生存和胞内增长答:castellanii不是明显不同(2]。所有这些事实可以表明,细胞内的行为霍乱弧菌是一个新的生存策略(1,2]。

在这项研究中,的存在OmpA突变体霍乱弧菌减少的可行性答:castellanii明显比野生型霍乱弧菌做了;这可能是由于生产过剩omv的突变株。omv的霍乱弧菌已经提出促进毒性因素的交付细菌或真核细胞27]。然而,我们的研究结果表明,omv变形虫的生存能力下降,这可能表明,囊泡是一种毒性因子。

有人观察到以前OmpA水平与omv的数量呈负相关,sRNA霍乱弧菌,叫做弧菌监管RNA的OmpA(VrrA),增加omv生产速度与OmpA的损失,因为VrrA积极调节omv的差别通过对这些OmpA蛋白(7]。然而,VrrA的失活导致殖民的增加霍乱弧菌在一个婴儿鼠标殖民化验。因此,OmpA蛋白质是重要的殖民化霍乱弧菌,VrrA RNA可能被视为一个调节器调节的毒性霍乱弧菌(7]。

omv的形成被认为是与细胞膨压信封在细菌生长(28]。革兰氏阴性细菌已经开发出许多策略,使活性毒性因素进入细胞外环境,通常是宿主生物体的组织或血液中(29日]。

囊泡是指细菌与原核和真核细胞在其环境。生化分析和功能描述pathogen-derived外膜囊泡已经证明,这种分泌通路已经被病原体活性毒性因子的运输到宿主细胞(14]。然而,omv的能力与细菌细胞膜融合和宿主细胞向细胞溶质传递内容意味着这些囊泡可能被描述为细菌的“炸弹”定向细胞间运输到特定的细菌毒力因素宿主细胞和组织(14,30.- - - - - -32]。还需要进一步的调查来了解更多关于囊泡的功能及其与宿主细胞相互作用。

细,结果表明,两株单独培养时,OmpA突变体的霍乱弧菌表达更多的omv和存活时间比野生型。此外,大量的omv孤立的OmpA突变株是足够高,以减少变形虫的可行性。共培养与答:castellanii加强野生型和生存OmpA突变株的霍乱弧菌。

总之,OmpA在生存的可能有一个调节的作用霍乱弧菌因为它抑制它的生存而缺乏OmpA增强omv的释放。omv可能作为毒性因素当他们支持一个长期生存的细菌和减少变形虫互动的可行性。霍乱弧菌可能是适应更好地生存与真核生物。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者欣然承认瑞典公民应急机构(MSB)支持这个项目。