文摘

整合子基因元素之一参与收购的抗生素耐药性。本研究的目的是调查在同桌的整合子的存在大肠杆菌(大肠杆菌)菌株,分离猪在不同阶段的生产系统和从环境中阿根廷农场。五个母猪产后和五个随机选择的小猪从每个垃圾被直肠拭子取样。他们在第21天,70天再次取样。环境样品从农场也获得。大肠杆菌包含任何整合子类或两者的结合整合子是由聚合酶链反应检测到100%的母猪和小猪在生产的不同阶段:68.1%;产圈阶段,断奶60%,增长/完成85.8%,显示增加生产系统。从环境样品的78.4%大肠杆菌含有类整合子被检测到。我们得出结论,农场动物和环境可以作为储层的潜在传播耐药细菌通过移动基因整合子元素,对生产产生重大影响的食用动物,可以达到人通过食物链,构成对公共卫生问题。

1。介绍

在过去的几年,抗菌药物的使用明显增加,在人类和兽医(1]。主要问题与不加选择地使用抗菌药物治疗感染病原菌的耐药菌株的发展。这个问题主要关心的是人类和动物的健康,主要是因为它会导致治疗失败的一个更大的风险标准的感染管理(2- - - - - -4]。几位全球使用的抗菌素作为生长促进剂,metaphylactic,预防和治疗药物。有越来越多的证据表明,抗菌剂用于动物饲料产生强大的选择压力,刺激肠道细菌抗生素耐药性的发展(1,5,6]。抗菌药物的存在允许在不致病的细菌耐药性基因的选择,可以横向传播,随着时间的推移,不同种类的致病微生物或人畜共患(7- - - - - -9]。水平基因转移似乎抗药基因的快速扩散的主要原因在多种细菌的多样性(10]。

超出了损失和水平基因转移,收购功能模块的重要细菌快速发展的过程中电阻(11,12]。整合子是一个遗传元素参与的抗生素耐药性的收购;他们有能力捕捉、集成和动员抗生素耐药基因盒(13]。整合子缺乏具体的动员机制,但它们与插入序列,转座子和/或质粒。整合子的功能安排由印锑基因,编码的整合酶催化的具体切除和集成基因磁带,一个特定的重组attI和一个启动子(14]。主要有两个组整合子:组我,也称为移动整合子,抗生素耐药性相关的磁带,和组II或superintegrons,与第一批不同,出现在染色体水平上,与抗生素耐药性与少数例外。组我,我们的重点是,依次分为五类:第1类整合子,二班,3班,第4类和类5基于编码序列的整合。尽管只有前三个历史上参与multiresistance表型的传播,所有五类与病人相关因素(15]。众所周知,整合酶的存在可能表明有能力招募抗生素耐药性的菌株基因(16]。

动物胃肠道细菌的主要储层和传播网站,也是一个特殊的环境,遗传信息交换(8,17- - - - - -20.]。因此,监测共生的微生物区系,如大肠杆菌(大肠杆菌)菌株,是一个很好的指示器阻力模式在一个人口,他们经常发现和容易获得电阻(21]。

考虑所曾解释说,目前的研究的目的是调查在同桌的整合子的存在和频率大肠杆菌菌株,分离猪在不同阶段的生产系统和从环境中阿根廷农场。

2。材料和方法

2.1。管理农业和动物

样本取自商业农场在布宜诺斯艾利斯的一个省,阿根廷,2012年3月和6月之间。农场集中组织总监禁,在生产中有400女性。主要设施有妊娠、分娩、断奶和增长/完成(肥胖),地理上分开在同一个农场。妊娠设施由矩形棚两排房子每个母猪单独的笼子里,为了有一个严格控制的播种时间的授精转移到产小猪区域(大约110天)。产小猪安装包含一组与坑的房间。每个房间由一组铁产小猪箱母猪在哪里住四天出生之前,仍垃圾,直到断奶。当垃圾达到70天,35公斤的重量转移到肥胖或终止区,该设备由大矩形外壳能够保持0.7米²/动物。每个封装分为房间,每个房间在于数量可变的笔的大小取决于组。笔是由混凝土之间的分区。10到30之间通常组大小不同的猪。猪和员工从一个建筑转移到另一个通过孤立的从外部交通走廊。

目前研究五个母猪相同基因的线。选择是基于以下生产标准:每每年播种,2.4出生每每年播种> 22猪断奶,> 27猪出生活着每年每播种。

抗生素使用是限制所声称的生产商详细采访。开始feed-based抗生素是不习惯,或者只有四环素的浓度开始被用于疾病暴发期间短时间内。另一方面,注射抗生素(磷霉素、tiamulin和阿莫西林)不习惯除了短暂控制典型疾病暴发(每年不到15天)。

2.2。样品收集

五个母猪被随机选择和粪便收集通过直肠拭子在3 h产后。拭子也获得5个随机选择的小猪从每个测试播种在同一天。小猪从每个垃圾采样选择再一次第21天,70天。这些年龄对应阶段的猪被安置在产小猪箱(F),断奶(G),和增长/完成单位(G / F),分别。拭子被运送到斯图尔特媒介。收集水样(30毫升)的产小猪笔,断奶和增长/完成坑,治疗,和废物处理泻湖。水抽样样本的并行执行猪,参加常规清洁和排空坑的农场,和根据指南手册设立的基本分析世界卫生组织饮用水的质量(2004)。所有样品都是在实验室立即冷藏运输和加工。在表1动物的总数获得详细测试和样品。

2.3。隔离大肠杆菌菌株

粪便样品和10毫升的水是生长在20和100毫升的磅肉汤,分别为24小时37°C,用颤抖的。然后10μL是镀在MacConkey琼脂和孵化18 h在37°C。从每个盘子,疑似病例大肠杆菌每板隔离(5 - 7)被随机选择和培养在0.8毫升的磅24 h在37°C,用颤抖的DNA提取。在表2从动物获得,隔离(a)和(b)所示的环境。

DNA模板被孵化10孤立μL 500年的细菌培养μL无菌再蒸馏的H₂在100°C O 10分钟。

2.4。的识别大肠杆菌菌株聚合酶链反应

大肠杆菌基因普遍压力蛋白(uspA)是用来证实大肠杆菌(22]。毒力基因stx1,stx2,stx2e,运算单元,lt,sta,机顶盒verotoxigenic的特征大肠杆菌(VTEC),致肠病的大肠杆菌(EPEC)和产肠毒素的大肠杆菌(ETEC),分别被PCR检测。只有负面压力对这些基因已经被认为是共生的,包括在这项研究[23]。

2.5。整合子PCR的检测

基因编码整合酶1 (Int1)和整合酶2 (Int2)检测识别整合子的存在类1或2班,分别根据•et al。24与修改)。短暂的热循环条件修改预培养10分钟(95°C),紧随其后的是30周期的变性1分钟(94°C),退火温度57°C和1分钟55°C (Int1和Int 2、职责),和扩展10分钟(72°C)。

2.6。统计分析

变量整合子的存在与否进行了分析使用PROC GENMOD SAS程序9.2 (SAS研究所Inc .,卡里、数控、美国)。比值比(或)估计对比(CLI:置信区间间隔)。

3所示。结果

3.1。整合子的存在大肠杆菌从母猪中恢复过来

大肠杆菌包含任何整合子类或两者的结合整合子的PCR检测5母猪(100%,表进行测试1)。从80年开始大肠杆菌隔离,33.8%是1类整合子阳性(ECi1 +), 47.5%是二班整合子阳性(ECi2 +),而18.8%的都是积极的整合子(ECi1 + 2 +)(图1)。

3.2。整合子的存在大肠杆菌从小猪在生产的不同阶段中恢复过来

在作物生长/完成阶段,包含ECi1 +的小猪和ECi2 +比例最高(91.7%和75%,分别地。)被发现(表2)。我们观察到显著增加的小猪窝藏ECi1 +他们搬到不同的生产阶段(),而有显著减少仔猪窝藏ECi2 +断奶阶段()(图2)。

314年的小猪,大肠杆菌隔离。大肠杆菌小猪的孤立显示以下的任何类整合子的百分比在不同的生产阶段:产圈阶段68.1%,断奶60%,增长85.8% /完成显示增加生产系统(表2)。此外,大肠杆菌ECi1 +显著增加从第一阶段的生产,主要在增长/完成()。相反,ECi2 +更频繁的在产圈(44.8%)显著降低断奶期间(8.2%,)。因此,我们观察到,在断奶或增长/完成大约有5倍的机会找到株ECi1 + (CLI95% = -9.55和2.65CLI95% = 2.66 - -8.96)和更少的机会找到Eci2 +,比产圈阶段(CLI95%: -0.26和0.05CLI95%: 0.31 - -0.91)。菌株窝藏ECi1 + 2 +检测产小猪笔(6%)和增长/完成(5.3%)(图3)。值得注意的是,母猪都至少有一个小猪的ECi +被隔离。

3.3。检测环境中整合子的农场

因为同桌的大肠杆菌隔离从母猪和仔猪获得包含整合子中,这种基因的存在元素水样本中不同的地方养猪场的调查。51分离得到不同环境样品。七十-百分之八的大肠杆菌含有类整合子被检测到。我们观察到在环境样品相比有更高比例的ECi1 + ECi2 +(39.2%和29.4%,分别地。),而低比例都整合子阳性(9.8%)。生产矿井、ECi1 +的存在(61.1%)相比是更频繁ECi2 +(16.7%)或两者的结合整合子(5.6%)。比例最高的ECi2 +和ECi1 + 2 +是记录在水样本处理室(37.5%和12.5%,分别地。)和泻湖(35.3%和11.8%,分别地。)(图4)。

4所示。讨论

抗生素通常用来控制牲畜疾病,预防和促进经济增长。这些做法可以选择抗生素耐药生物体在动物的胃肠道,特别是在开始使用时的水平(25]。抗生素耐药性的细菌可以通过各种移动遗传元素,如质粒、转座子、整合子(8,9]。我们已经表明,同桌的大肠杆菌孤立从母猪在阿根廷的一个农场存在的基因整合酶1和/或2表明菌株能够招募有抗生素抗性基因(16]。共生细菌耐药性的出现,全球食品动物已经被广泛的研究。高患病率的共生体大肠杆菌耐抗生素菌株在猪是惊人的26- - - - - -28),由于潜在的阻力因素转移到其他细菌,包括人类病原体。马修et al。29日]表明,相同的整合子被发现在两个不同种类的细菌,大肠杆菌和沙门氏菌,从一个养猪场,表明这两个生物体之间发生水平转移。此外,一些作者表明,高的比例大肠杆菌菌株从食品动物如牛、猪和家禽包含整合子(19,30.- - - - - -32]。整合子的事实出现在接合质粒、转座子,这促进了接合,解释其广泛分布(33]。

我们还演示了在同桌的整合子的存在大肠杆菌小猪比12 h的年龄更小的压力表明的重要性在出生时的耐药菌株传播垃圾。此外,我们注意到,菌株的百分比大肠杆菌某种类型的整合子阳性增加在生产系统的不同阶段。军火商和莫雷诺34)观察到的比例很高大肠杆菌隔离包含整合子阳性的前8周内生活,减少21周。Andraud et al。35]个体间发现耐药菌株的传播是一个养猪场的关键使持久性。此外,大多数的研究不考虑动物的年龄。我们的数据表明,年龄是一个重要因素影响的存在一些类整合子的猪。必须牢记,在断奶,液体或/和半流体的饮食变得干燥食品。小猪是暴露在抗生素使用的食物,在一些国家,随着经济增长促进(36- - - - - -38]。整合子的不同的类中,最常见的描述和相关抗生素耐药性革兰氏阴性细菌类整合子1,迄今已超过100种不同的盒式阻力安排通知(16,39- - - - - -41]。我们发现1类整合子成为主流的后期猪生产,而二班在母猪更频繁和产仔箱阶段,可能反映了母亲的细菌负荷的变化在周。Literak et al。42)观察到母猪包含更高比例的大肠杆菌整合子二班积极类1相比农场,常用的抗生素。军火商和莫雷诺34)表明,尚未断奶的小猪有更高比例的大肠杆菌整合子二班和一班。这是逆转种植者小猪(约56天),与我们的结果一致,小猪的70天。Machado et al。43)发现了一个更高比例的第1类整合子与二班大肠杆菌从健康的成年的猪隔离。与我们的结果相反,坎贝尔et al。44猪生产]发现组间显著差异。年长的动物较低比例的细菌类整合子阳性1组相比,年轻的动物。其他作者也表明一个普遍的1类整合子在肠杆菌科家庭成员从家畜、宠物和野生动物(45]。因此,开发、持久性和抗药细菌的传播越来越多的担忧,因为他们可以妥协的感染控制减少受感染动物的治疗方案。这可能导致疾病传播的整体提升,发病率,死亡率,有时动物生产行业的经济损失(46,47]。正如我们提到的,整合子基因元素之间,造成了多重耐药性革兰氏阴性细菌的发展。我们发现高百分比的耐多药抗药性菌株从猪。在抗生素敏感性测试,观察电阻的比例最高,四环素tiamulin enrofloxacin。阻力增加两个以上抗生素在后期的生产(数据没有显示)。

持久耐药菌株的个体在一个农场可能涉及传播环境。好,池塘系统通常用于管理一个农场产生的粪便。这引起极大关注,抗药性细菌很容易迁移到土壤、地下水和地表水渗漏从肥料泻湖和肥料的应用程序(48,49]。我们已经表明,产小猪笔,完成仔猪断奶和增长/坑,处理室,和废物处理泻湖,有很高比例的ECi + Eci1 +的百分比更高于Eci2 +和Eci1 + 2 +。Byrne-Bailey et al。50)表现出更高的患病率1类整合子阳性细菌在土壤处理猪粪浆与整合子二班,10个月后仍然很高。然而,我们观察到不同的类整合子根据样本的地方。在坑内生产房间猪,1类整合子主导,而整合子二班主要见于处理室。在水样本处理泻湖,污水水和残余污染物处理,整合子的百分比一班和二班积极压力是相同的。其他作者发现了一个流行的整合子类1和2在屠宰场废水处理厂的30.7%和4.5%,分别为(51]。这些类整合子的存在或频率的变化,在环境和动物,可能是由于不同政策的使用和/或滥用抗生素的使用在不同生产农场。Literak等。(42猪生产两个农场]调查与不同抗生素的使用政策。他们找到了一个隔离的整合子的患病率更高大肠杆菌从猪的农场,几种抗生素的使用是常见的,而一个农场管理抗生素只异常。这表明抗生素选择压力的重要作用。我们必须澄清,还没有调查隔离的多样性,这是可能的,一些隔离属于同一克隆研究。

因此,我们得出结论,农场动物和环境可以作为潜在的抗药细菌的传播水库通过移动基因整合子元素,参与抗生素耐药性和对生产产生重大影响的食用动物,可以达到人通过食物链,构成对公共卫生问题。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作受到了国家2010 - 2012年(PIP),皮克特人2010 - 1655年,中投,SECAT来自阿根廷。