文摘

弯曲杆菌concisus是一个口腔细菌,与肠道疾病相关。c . concisus曾被描述为一种细菌需要H₂纯度的浓缩铀microaerobic发展创造条件。H的水平₂口腔是极低的,这表明c . concisus不太可能有microaerobic增长。在这项研究中,厌氧的增长c . concisus被调查。57个口语的发展c . concisus菌株和6肠c . concisus菌株在各种大气条件包括厌氧条件下有无H₂是检查。大气条件使用商用煤气化生成系统。c . concisus假定的毒性蛋白被确定使用质谱分析。在厌氧条件下,92%的口腔c . concisus菌株(52/57)和所有六个肠道菌株生长的H₂和H的存在₂大大增加c . concisus增长。口服c . concisus菌株被发现来表达一些假定的毒性蛋白,这些蛋白的表达水平没有影响H₂。H的水平₂似乎影响的最优发展c . concisus。这项研究提供了有用的信息理解的自然殖民站点和致病性c . concisus。

1。介绍

弯曲杆菌concisus是一种革兰氏阴性细菌普遍存在于人类的口腔(1,2]。在一些人,c . concisus可能在肠道和被发现与炎症性肠病(IBD)由于其患病率明显高于在IBD患者的肠道与控制(3- - - - - -6]。炎症性肠病是一种慢性炎症性疾病的胃肠道(GIT),原因不明。克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是两个主要临床类型的炎症性肠病(7]。除了炎症性肠病,c . concisus也常常与腹泻粪便样本,暗示可能参与腹泻病(8- - - - - -10]。

在文献中,它被描述c . concisus需要H₂纯度的浓缩铀microaerobic生长条件(11,12]。在实验室的查看c . concisus富含5 - 10% H microaerobic条件₂已使用(2,9,12,13]。主要的殖民的c . concisus是人类口腔1,2]。H的水平₂在人类口腔是极低的14]。在这种情况下,不太可能c . concisus能够在人类口腔microaerobically生长。在以前的研究中,c . concisus从牙龈牙菌斑和唾液,孤立的位置发现了大量的厌氧菌,暗示c . concisus更有可能使用一个厌氧生长在人类口腔(1,2,15]。

到目前为止,还没有研究,系统的研究的发展c . concisus在厌氧条件下。此外,没有任何信息关于H的影响₂在c . concisus在厌氧条件下生长。这些问题在当前的研究调查。此外,我们研究了口服的假定的毒性蛋白的表达c . concisus在厌氧条件下应变增长。

2。材料和方法

2.1。c . concisus菌株用于这项研究

总共有63c . concisus病毒在这项研究中,检查包括57口服c . concisus菌株和6肠病毒。57岁的口头c . concisus菌株,从CD患者19株,UC患者的14株,从健康个体和24株。的六个肠c . concisus菌株,五株被隔绝IBD患者包括两个菌株分离肠活检患者的加州大学,两个菌株与UC患者的粪便样本,和一个应变与肠活检的患者CD。口服或肠c . concisus菌株被孤立在我们先前的研究[1,3,6]。c . concisus13826株,分离带血的腹泻患者粪便样本,从美国购买类型文化收藏。

2.2。检查c . concisus在各种大气条件下生长

63以上的增长c . concisus下面的大气条件下菌株被检查。

2.2.1。厌氧条件没有H₂(Anaero^H2−)

条件是使用AN25A生成气体发生系统按照制造商的指示(Oxoid、汉普郡、英国)。

2.2.2。厌氧条件包含9%的H₂(Anaero^{H2 +})

条件是使用BR38B生成气体发生系统,放入3.5 L jar在催化剂的作用下,根据制造商的指示(Oxoid)。

2.2.3。Microaerobic条件没有H₂(微^H2−)

一个使用两个不同的气体发生系统生成条件,根据制造商的指示(Oxoid)。第一个BR56A煤气化系统(),放入3.5 L jar的催化剂。第二个CN25A煤气化系统(),放入2.5 L jar。

2.2.4。原先的隔离状态

的c . concisus菌株用于本研究孤立在我们先前的研究[1,3,6]。大气条件用于隔离c . concisus株临床样品在我们先前的研究是地方BR56A煤气化系统的2.5 L jar催化剂,这是一个修改制造商的指令。在这项研究中,我们称这种大气条件与原始隔离条件()。

每个63c . concisus菌株飞跑到三匹马血琼脂为每个大气条件(HBA)板块。HBA盘子准备使用血琼脂基地2号补充6% (v / v) heat-inactivated去纤维蛋白的马血和10μ克/毫升的万古霉素(Oxoid)。孵化后在37°C下,,,,条件下,分别为48小时,板的外观检查殖民地立体显微镜下。所有生长的形态c . concisus压力是使用相差显微镜检查。

2.3。定量的比较c . concisus生长在Anaero^H2−和Anaero^{H2 +}条件

为了进一步定量比较的增长c . concisus下和条件下,集落形成单位(CFU) 12c . concisus菌株生长在这两种情况下确定。这12个菌株包括从CD患者口服6株,三个口头菌株从加州大学,两个口腔健康对照菌株,和一个从UC患者肠病毒。这12个菌株被随机选择的63株用于实验部分2。2。

c . concisus首次培养菌株在HBA板块条件在37°C 48小时。收集细菌细胞和洗一次磷酸缓冲盐(PBS)。每个品种的细菌颗粒resuspended PBS和OD_600年调整到0.05,这是用作进一步评估最初的培养液的增长c . concisus下和条件。

初始接种体悬挂(50μL)每c . concisus菌株接种到6 HBA板使用无菌l型玻璃棒。三个盘子孵化条件和剩下的三个板块下孵化在37°C条件48小时。

每一个细菌细胞c . concisus从3个盘子收集的应变下孵化条件和三个板块下孵化条件分别汇集,(1毫升的PBS用于收集细菌细胞从每个板)。从每个池c . concisus暂停,连续稀释(1:10 1:10⁸)准备。每个稀释(5μL)接种到HBA盘子一式三份。板块进一步孵化48小时37°C条件来确定CFU数字。

2.4。检查c . concisus生长在厌氧和Microaerobic条件在不同浓度的H₂

P3UCO-S1应变是用于实验。P3UCO-S1应变口服应变之前隔绝UC患者(6,16]。在先前的研究分析六个管家基因,我们表明,六个P3UCO-S1应变的看家基因相同的相同的应变与肠活检病人(P3UCB-S1)表明这口服c . concisus压力能够在肠道。有鉴于此,我们决定使用P3UCO-S1应变在这个研究的一部分。

P3UCO-S1应变在HBA首次培养板在37°C条件48小时。这后,收集细菌细胞和悬浮在PBS和OD_600年调整到0.05。细菌悬液(30μL)接种到18 HBA盘子。板是在厌氧条件下或microaerobic条件下孵化包含各种条件的H₂(3个盘子在每个条件)。厌氧和microaerobic条件生成使用气体发生系统AN25A和煤气化系统CN25A,分别(Oxoid)。氢气是辅以包括0.021 g、0.042 g,或0.083 g的硼氢化钠和10毫升的H₂O在一个容器放置在一个2.5 L jar,分别产生2.5%,5.0%,和10.0%的H₂,分别。H₂NaBH气体产生的化学反应₄+ 4 h₂O = 4 h₂+ NaB(哦)₄。

经过一段时间的48小时孵化的37°C,c . concisus收集细菌细胞从每个盘子用1毫升的PBS。三个板块每个条件下培养池和八个连续稀释(1:10 1:10⁸)准备。每个八稀释(5μL)接种到HBA板块四个复制。板块进一步孵化48小时37°C条件来确定CFU数字。

2.5。假定的毒性口头表达的蛋白质c . concisus菌株培养下Anaero^H2−和Anaero^{H2 +}条件

表达的蛋白质c . concisus培养下和使用质谱分析条件进行了分析。c . concisus应变P6CDO-S1被用在这个实验。P6CDO-S1口服病毒以前隔绝CD患者的唾液。我们以前的研究表明,口服c . concisus应变是基因接近c . concisus应变分离的肠活检患者CD [6]。因此,我们决定这是否口头调查c . concisus应变表示假定的毒性蛋白质,这些蛋白质是否表达了不同应变下种植和条件。

简单地说,c . concisusP6CDO-S1菌株生长在HBA盘子48小时和条件,分别。c . concisus细菌与PBS收集和清洗,然后19μg全细胞蛋白质12% sds - page分离(如前所述16]。每个样本的凝胶巷切成10片。为胶液蛋白胰蛋白酶消化了。提取的多肽分离和液相色谱的分析了MS / MS如前所述[16,17]。

吉祥物守护程序(矩阵科学、伦敦、英国)是用于细菌蛋白质识别与NCBI数据库。光谱项相同的蛋白质表达的P6CDO-S1下和条件比较使用Scaffold-3软件(美国或蛋白质组软件)18]。实验进行重复,重复两次。

质谱在生物分析质谱进行设施,澳大利亚的新南威尔士大学。

2.6。统计分析

未配对以及用于比较菌落数。确切概率法用于分析的增长率c . concisus菌株与IBD患者隔离和控制。GraphPad棱镜5软件被用于统计分析(CA)圣地亚哥。值< 0.05被认为是一个重要的区别。

3所示。结果

3.1。的增长c . concisus菌株在不同大气条件

57的口腔检查,52株(91%)增长条件。的口语c . concisus菌株从CD和UC患者隔离,积极的增长率条件是84%(16/19)和86%(12/14),分别,这在统计学上没有不同于口头的积极增长速度c . concisus株(100%,24/24)与健康对照组()(表1)。所有口头c . concisus压力下成长条件(表1)。

所有六个肠c . concisus菌株生长在两和条件。

的殖民地c . concisus菌株、口腔和肠道菌株生长条件比下出现小得多条件。的形态c . concisus下和条件不相衬显微镜下不同。

没有一个c . concisus菌株生长microaerobic条件下没有H₂;下没有观察到在盘子里培养细菌菌落和条件。所有菌株生长在条件。

3.2。定量的比较c . concisus生长在Anaero^H2−和Anaero^{H2 +}条件

进一步的发展进行比较c . concisus压力下和条件下,12的菌落c . concisus菌株生长这两个大气条件下测定。所有菌株都大大增加在增长条件相比条件。12的菌落数c . concisus压力下条件明显高于各自的压力下条件()(表2)。

3.3。的增长c . concisus在厌氧和Microaerobic条件含有不同浓度的H₂

P3UCO-S1应变被用作代表压力评估的发展c . concisus在厌氧和microaerobic条件含有不同浓度的H₂。在厌氧条件下,P3UCO-S1菌株的菌落培养的2.5%,5%和10%₂是()×10⁹/毫升()×10⁹/毫升,()×10⁹/毫升,分别。CFU H数量的5%₂的菌落数明显高于2.5%和10% H₂(包括)。CFU H数量的10%₂和2.5% H₂没有显著差异()(图1)。

在microaerobic条件下,P3UCO-S1菌株培养的菌落数的2.5%,5%和10%₂是()×10⁶/毫升()×10⁷/毫升,()×10⁸/毫升,分别。CFU数量2.5%的H₂明显低于5%和10% H的CFU数字吗₂(和、职责)。CFU数量5%的H₂的菌落数明显低于10% H₂()(图1)。

3.4。假定的毒性蛋白表达的c . concisusP6CDO-S1应变Anaero下培养^H2−和Anaero^{H2 +}条件

蛋白质表达的菌株P6CDO-S1下和条件进行质谱分析。许多公认的毒性蛋白质如fibronectin-binding蛋白质、外膜蛋白(Omp),蛋白酶htpx, S-layer-RTX蛋白质,血凝素/ hemolysin-related蛋白质,CjaC, EvpB家庭类型VI分泌蛋白质被确定。这些假定的毒性蛋白的表达水平,表明光谱计数,并没有统计上的不同c . concisus应变P6CDO-S1生长和条件(表3)。

4所示。讨论

在这项研究中,增长的c . concisus菌株在不同大气条件下进行。这是先前描述的c . concisus是一种细菌,这种细菌需要H₂纯度的浓缩铀microaerobic增长和一些条件c . concisus压力可能会在厌氧条件下如果延胡索酸酯、甲酸存在文化板块(2,11,12]。在这项研究中,我们发现,在厌氧条件下大部分的口语c . concisus株(91%,52/57)长在HBA板不含甲酸或延胡索酸酯的H₂,这表明口服c . concisus是一种厌氧细菌,H₂煤气、甲酸和延胡索酸酯口腔厌氧生长的基本要求c . concisus菌株。没有一个57口服c . concisus菌株生长microaerobic条件下没有H₂,这表明microaerobic增长c . concisus需要的存在₂,这与先前的发现是一致的(9,11]。

在厌氧条件下,氢的存在₂大大增加的增长c . concisus群体大小的增加,证明了宏观上观察和增加相同应变下培养的菌落数和条件(表2)。这些结果表明,在厌氧条件下c . concisus有不同的代谢途径产生能源对经济增长和氧化H₂是一个通路产生高能快速增长。H的溶解度₂气体在H₂O是极低;因此液体培养方法不适合评估H的影响₂气体在c . concisus增长(19]。有鉴于此,在这项研究中,CFU的数量c . concisus菌株使用平板培养法测定。

在人类中,H₂主要是由厌氧细菌在冒号(20.,21]。H₂肠道中生成处理的H₂消费产甲烷菌等细菌硫酸盐还原菌和产乙酸菌(22]。一些H₂扩散到血液和H₂可以测量呼吸测试(23]。饮食因素和个体的肠道菌群的组成影响肠道H₂生产和消费(24- - - - - -26]。的天然宿主c . concisus是人类和主要的殖民网站是人类口腔1,2]。分泌H的浓度₂口腔是极低的。氢的基础水平在健康个体通常小于10 ppm,因此H₂水平的不到0.001% (1 ppm = 0.0001%) (14]。除了厌氧细菌在肠道,口腔厌氧细菌也可能产生H₂发酵的碳水化合物残留食物。然而,H₂由口腔厌氧菌非常低。Mastropaolo和里斯表明,固体食物后,H₂由口腔厌氧菌25 ppm(0.0025%),这一水平仅保留73分钟27]。考虑到这一点,c . concisus殖民口腔不太可能不断可用H₂的增长。发现在这项研究中,口服c . concisus菌株能够增长没有H的存在₂在厌氧条件下有助于解释为什么c . concisus能够在人类的口腔。

尽管H₂急剧增加的增长c . concisus小肠是占主导地位的H₂生产在人类中,有趣的是c . concisus已经选择了口腔,而不是肠道环境,其自然殖民的网站。这表明,在健康个体中有一些因素抑制胃肠道c . concisus肠道殖民。很有可能这样的抑制因素是IBD患者低或缺乏,导致肠道的患病率越高c . concisus在这些病人。这些因素可能是产甲烷细菌之一,占主导地位的H₂消费在人类肠道细菌产生甲烷。有可能是肠道内的产甲烷细菌与竞争c . concisus使用H₂。

麦凯等人的研究考察氢和甲烷排泄IBD患者和控制显示甲烷排泄的患病率是13%患者在UC患者CD和15%,这明显低于健康对照组(54%)(28]。这个观察支持通过一项研究Pimentel et al .,这显示,97%的IBD患者(75/78),主要是腹泻疾病,分泌H₂只有和甲烷(29日]。这些结果表明,有一个低水平的产甲烷细菌IBD患者。事实上,斯坎兰等人进行的一项研究发现肠道产甲烷细菌的低流行率IBD患者与健康对照组相比,和其他疾病组(30.]。产甲烷细菌发挥主导作用处理肠H₂在人类31日]。缺乏足够的IBD患者肠道产甲烷细菌可能会生成一个肠道环境,允许c . concisus使用H₂快速增长。

我们先前表明,一些口语c . concisus菌株能够在肠道和有可能引起肠道疾病16,32]。在这项研究中,我们发现P6CDO-S1应变,口服c . concisus应变隔离患者CD,表达了许多公认的毒性蛋白。这些蛋白质以前报道为其他细菌的毒力(32- - - - - -39]。然而,他们的角色c . concisus毒性有待特征。如果确实这些假定的蛋白质发挥作用c . concisus毒性,发现在这项研究中,这些蛋白的表达水平仍类似P6CDO-S1应变是在厌氧条件下培养时,没有H₂表明,H的影响₂在c . concisus毒性不大可能通过影响这些蛋白质。很可能H₂可能会影响c . concisus毒性通过增加的增长c . concisus致病的阈值。

这项研究还发现,在厌氧条件下,P3UCO-S1菌株,从UC患者口服应变隔离,有明显高于CFU的5% H₂2.5%相比,H₂和10% H₂。microaerobic条件下,这一毒株有明显高于CFU存在10%的H₂2.5%和5%相比,H₂。看来H的浓度₂细菌培养中提供最佳生长的影响c . concisus。这方面应该进一步调查研究c . concisus菌株使用系统能够提供固定的CO浓度₂N₂,和H₂临床实验室,这将提供有用的信息隔离的c . concisus从临床样本。

除了57口服c . concisus菌株,包括6个肠道菌株,五株被隔绝IBD患者进入本研究。这些肠道菌株表明厌氧生长模式,类似于口头c . concisus菌株。

总之,本研究发现口服c . concisus菌株能够在厌氧条件下生长没有H的存在₂、甲酸、延胡索酸酯和这些菌株没有生长在microaerobic条件没有H₂,这表明它们是厌氧菌。H的存在₂在厌氧条件下大大增加口语的发展c . concisus菌株。使用质谱分析,口服c . concisus应变与CD患者被发现来表达一些假定的毒性蛋白,这些蛋白的表达水平在厌氧条件下有无H₂仍然是相似的。而肠的数量c . concisus菌株包含在本研究小,这些肠道菌株和口腔c . concisus有一个类似的厌氧增长模式。这项研究提供了有用的信息理解的自然殖民站点和致病性c . concisus。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。