文摘
侵袭性念珠菌病的发病率增加了在过去的几十年里。虽然白色念珠菌仍然是迄今为止遇到的最常见的物种,近年来转向非白假丝酵母物种如假丝酵母tropicalis而著称。在这个研究中我们决定125年的毒力因子和抗真菌敏感性概要文件c . tropicalis孤立的从各种临床标本。生物膜的形成是在53个(42.4%)隔离。凝固酶生产中指出18(14.4%)隔离。磷脂酶酶是由主要致命的因素c . tropicalis隔离。总共39生物膜形成隔离显示磷脂酶的活动。蛋白酶活动证明了65(52%)隔离。共有38(30.4%)隔离显示溶血性活动。最大的隔离证明耐氟康唑。氟康唑耐药更为普遍c . tropicalis从血培养分离。抗真菌在隔离电阻更拥有生产磷脂酶和生物膜的能力。c . tropicalis表现出很大程度的变化不仅在其致病性,而且在他们的抗真菌敏感性概要文件。毒性属性的识别特定于每个物种及其相互关系将帮助感染的发病机制的理解。
1。介绍
在过去的三十年里,假丝酵母物种已经成为一个重要的原因相关的卫生保健和机会性感染1]。增加使用静脉留置针、全静脉营养、广谱抗生素,和细胞毒性化疗和免疫功能低下的患者的人口的增加造成了这些感染的增加(2]。
表达毒性萌发管等因素形成的,丰富的,表型转换,向触性,生物膜的形成和水解酶的生产导致念珠菌病的发病机理1]。念珠菌病的临床频谱范围从黏膜与皮肤的生长传播感染像candidemia3]。尽管大多数是由于感染白念珠菌,转向治疗耐药非白假丝酵母(NAC)物种是近年来明显4,5]。出现NAC种虫害的问题变得更为严重,因为不同种类的NAC表现出不同程度的耐药性,内在或收购或两者,常用的抗真菌药物。
c . tropicalis是一种最常见的NAC种虫害隔绝不同临床类型的念珠菌病6]。在印度,c . tropicalis有关的卫生保健是最常见的导致candidemia [7]。隔离的增加c . tropicalis从不同临床类型的念珠菌病的关注,因为它能够快速开发耐氟康唑(8]。
在假丝酵母spp,表达毒性因素可能取决于感染的物种的地理起源、类型的感染,感染的网站和舞台,主持人的反应。这些毒力因素的知识将是一个重要的工具来理解念珠菌病的发病机理和除了将有助于探索新的抗真菌药物靶点改善治疗方案。回顾可用的文献揭示了缺乏信息的流行病学、发病机理、毒性因子,抗真菌敏感性的模式c . tropicalis。因此本研究采取了一个旨在研究毒性因子和抗真菌敏感性的c . tropicalis孤立的从各种临床标本。
2。材料和方法
目前的研究是在美国进行的微生物,Pravara农村医学院和医院的医学科学研究所,Loni,马哈拉施特拉邦,博士论文的一部分。协议的研究机构伦理委员会批准的(登记号PIMS /博士/ RC / 2013/24)。
总共有125c . tropicalis孤立的从各种临床样本包括在这项研究中。c . tropicalis确定了Hichrome HiCandida识别工具和菌落颜色吗假丝酵母琼脂(Himedia实验室pvt Ltd .,孟买,印度)。
毒力因子研究exoenzymatic活动(凝固酶,磷脂酶和蛋白酶),生物膜的形成,溶血素的生产。
2.1。凝固酶活动
凝固酶生产c . tropicalis被检测到的方法Yigit et al。9]。大约0.1毫升的一夜的文化c . tropicalis无菌接种到一个包含500管吗μL兔血浆。管子在35°C和孵化后观察血栓形成2,4,6,24小时。
凝块的存在,不能resuspended温柔的振动表示积极的凝固酶试验。金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923和美国epidermidis写明ATCC 14990人作为积极的和消极的控制,分别。
2.2。磷脂酶的生产
的磷脂酶活动c . tropicalis被检测到的方法Samaranayake et al。10]。约5μ包含10 L标准培养液的测试压力8假丝酵母细胞/毫升无菌接种到蛋黄琼脂。板是在室温下晾干,然后孵化在37°C 48 h。面前的板块进行降水区域周围的殖民地。降水区域的存在表明磷脂酶酶的表达。白念珠菌写明ATCC 10231年作为积极的控制。
磷脂酶指数(Pz)被定义为殖民地的直径比的总直径殖民地+沉淀区。Pz值1表示没有磷脂酶活性;Pz < 1表明磷脂酶生产的隔离。Pz值越低,磷脂酶活性越高(11]。减少实验误差,分析了每个隔离在重复三次。
2.3。蛋白酶活性
蛋白酶的活性c . tropicalis隔离被描述的方法筛选Staib [12]。这是测量的牛血清白蛋白(BSA)退化。大约10μL标准培养液(106假丝酵母细胞/毫升)无菌接种1% BSA板。板培养5天在37°C。白念珠菌写明ATCC 10231年作为积极的控制。
孵化后,进一步通过添加20%三氯乙酸和蛋白酶活性抑制板amidoblack沾1.25%。菌落周围区域的蛋白水解作用不能沾amidoblack表明蛋白酶活性。
蛋白酶指数(Prz)测量的菌落的直径的比值无污点的区域。Prz值1表示没有蛋白酶活动;Prz < 1表示蛋白酶表达的隔离。Prz值越低,越高蛋白酶活性(11]。减少实验误差,分析了每个隔离在重复三次。
2.4。溶血素生产
溶血性的活动c . tropicalis在羊血播出Sabouraud葡萄糖琼脂板通过描述的方法Manns et al。13]。大约10μL标准培养液(108假丝酵母细胞/毫升)无菌接种到培养基上。文化板块在37°C孵化48 h。白念珠菌写明ATCC 90028是用作控制压力。酿脓链球菌(Lancefield A组)和链球菌sanguis被用作β和α溶血,积极控制。
在殖民地的溶血的存在表明溶血素的生产。溶血性活动(赫兹)的直径的比值计算的殖民地的半透明带溶血(毫米)。
2.5。生物膜的形成
的能力c . tropicalis隔离,形成生物膜被管评估方法所描述的Yigit et al。9]。殖民地的c . tropicalis从Sabouraud葡萄糖琼脂接种在盐水和孵化一夜之间在37°C。0.5毫升的生理盐水悬架被添加进螺钉封顶锥形聚苯乙烯管包含5毫升Sabouraud葡萄糖肉汤补充葡萄糖(最终的浓度8%)。管是在35°C的环境没有搅拌48 h。
在孵化的肉汤管使用巴斯德吸管轻轻吸气。管道用蒸馏水洗两次,红色染料沾2%。10分钟后的染色提供了。管道与蒸馏水冲洗以去除多余的染色。
可见电影附着在墙上和底部的管表明生物膜的形成。环形成的液体界面不是视为一个迹象生物膜的生产(11]。葡萄球菌epidermidis写明ATCC 35984和白念珠菌写明ATCC 10231人作为积极的和消极的控制,分别。
2.6。抗真菌敏感性测试
的抗真菌敏感性测试c . tropicalis执行隔离使用Hicomb最低抑制浓度(MIC)测试(Himedia实验室pvt Ltd .,孟买,印度)。抗真菌药物测试是两性霉素B(范围0.002 -32μ0.016 g),氟康唑(范围-256μ0.002 g),伊曲康唑(范围-32μ0.002 g),酮康唑(范围-32μg)。
剂是由接种3 - 4的殖民地c . tropicalis隔离在盐水测试。悬挂的浊度与0.5麦克法兰标准。暂停接种在琼脂板包含RPMI 1640补充葡萄糖2%草坪使用镶棉拭子培养法。制造商的指示是坚持在整个测试。抗真菌条无菌放置在媒体的帮助下钳和盘子在35°C孵化24 - 48 h。白念珠菌写明ATCC 90028和c . parapsilosis写明ATCC 22019被用于质量控制。
抗真菌敏感性测试的结果被解释为敏感,存在剂量依赖的相关性(DDS)和耐药。解释标准推荐的唑类是那些临床实验室标准协会(CLSI) [14,15]。由于缺乏对两性霉素B的定义断点任意值的基础上,研究其他人员使用(11,16]。
3所示。结果
图1显示了临床标本明智的分布c . tropicalis。大多数隔离尿液样本获得(38.4%),其次是阴道拭子(28.8%)。留置导尿管等,使用抗生素,老年患者和糖尿病相关的风险因素被发现c . tropicalis尿路感染。怀孕,未受控制的糖尿病,并使用低剂量的氮杂茂维修方案是诱发因素c . tropicalis外阴阴道炎。艾滋病毒是口咽念珠菌病的主要诱发因素(OPC)。ICU停留,全肠外营养(TPN),之前接触氟康唑,糖尿病candidemia的主要危险因素。
毒性产生的因素c . tropicalis隔离表所示1。生物膜的形成是在53个(42.4%)隔离。c . tropicalis孤立的从尿液和血液样本演示高生物膜生产能力。凝固酶生产中指出18(14.4%)隔离。其中,只有2隔离显示凝固酶表达4 h内孵化。凝固酶生产更多的血液分离。磷脂酶酶是由主要致命的因素c . tropicalis隔离。c . tropicalis从阴道拭子和血培养分离显示最大磷脂酶的活动。总共39生物膜形成隔离显示磷脂酶的活动。蛋白酶活动证明了65(52%)隔离。蛋白酶产量高c . tropicalis孤立的从阴道拭子和口咽拭子。共有38(30.4%)隔离显示溶血性活动。所有隔离了类型的溶血。
抗真菌敏感性的c . tropicalis隔离表所示2。最大限度的隔离了耐氟康唑(71.2%),其次是酮康唑(68%)。氟康唑耐药更常见的隔离来自candidemia, OPC和酵母菌病。两性霉素B电阻被认为在22个隔离。这是常见的c . tropicalis从血培养分离和口咽拭子。抗真菌在隔离电阻更拥有生产磷脂酶和生物膜的能力。
杂项样本包括福利的导管技巧,耳朵拭子,气管内管,胸膜液体。
4所示。讨论
霉菌病、特别是念珠菌病都是广泛和增加的频率。频率的增加假丝酵母在一定程度上感染与医学领域的发展相符(17]。南汽种虫害一旦被无视是不致病的,同桌的,或者污染物已成为潜在的病原体(18]。在南汽。c . tropicalis单独或与其他的物种,有牵连更频繁地在人类感染19]。
在这项研究中,c . tropicalis最常见的是与世隔绝的尿液样本。保罗et al。20.)报道c . tropicalis作为最普遍的NAC种虫害导致candiduria。在耆那教等的研究。21),c . tropicalis的主要原因是在重症监护室candiduria乳胶过敏的病人。candiduria的主要风险因素包括留置导尿管,最近使用抗生素,先进的年龄,和糖尿病。留置导尿管等促进的入口和殖民假丝酵母(22]。使用广谱抗生素有助于殖民假丝酵母通过抑制肠道的正常菌群,降低生殖道(22]。糖尿病不仅损害宿主免疫力也增加假丝酵母殖民的尿液通过促进瘀神经性膀胱功能障碍(21]。
近年来,许多研究表明由于阴道假丝的患病率增加致病菌种及NAC spp。在我们的研究中,怀孕,未受控制的糖尿病,并使用低剂量的氮杂茂维修方案的主要诱发因素c . tropicalis外阴阴道炎。广泛和不当使用的抗真菌治疗的形式自我药疗,长期维护用量和使用单剂量口服和局部唑导致根除白念珠菌和选择的NAC种虫害对常用抗真菌药物(23]。
OPC是最常见的机会性真菌病在免疫力低下的个人。在我们的研究中,艾滋病毒感染是最常见的OPC的诱发因素。OPC发生在多达90%的艾滋病毒感染者在感染过程中(24]。近年来,南汽种虫害c . tropicalis,c . glabrata和c . krusei日益恢复艾滋病患者OPC (25]。的优势c . tropicalis在南汽种虫害的病原体OPC在艾滋病毒感染者还指出在其他研究人员的研究16,25]。
Candidemia是一个重要的并发症住院重症患者(26]。NAC种虫害的隔离率增加血流感染与抗真菌敏感性逐渐转变的概要文件被记录在许多最近的研究(7]。之前,在我们的研究ICU停留,TPN接触氟康唑,和糖尿病风险因素识别与有关c . tropicaliscandidemia。氟康唑使用的增加被认为是增加的主要原因c . tropicaliscandidemia [7]。各种来自印度的不同部分的研究人员的研究报告c . tropicalis是最普遍的NAC种虫害隔绝candidemia情况下(27,28]。
对这些毒性因素关注广泛的研究白念珠菌,这被认为是最致病性属的成员(1]。然而,不少研究文章指毒性因子生产NAC spp。在目前的研究中,指出42.4%的生物膜的形成c . tropicalis隔离。假丝酵母种虫害具有形成生物膜的能力在大多数,如果不是全部,医疗设备(29日]。Singhai et al。30.)报道假丝酵母导管相关性败血症相关外围血管内导管患者的7.4%。检测生物膜形成能力假丝酵母种虫害是非常重要的,因为这些微生物不仅在医疗设备,但也导致耐药卫生保健相关感染(1]。
胞外水解酶念珠菌病的发病机制中发挥重要作用[31日]。这些酶促进适应不同类型的病原体的感染和提高生存。大部分的分泌胞外酶的研究集中在磷脂酶和天门冬氨酰蛋白酶(Sap) [32]。凝固酶生产和溶血性的活动c . tropicalis的研究最少。凝固酶结合血浆纤维蛋白原和激活的级联反应,诱发凝血的等离子体33]。在我们的研究中凝固酶产量的14.4%c . tropicalis隔离。罗德里格斯et al。33)高凝固酶活动报道c . tropicalis(82.6%)。溶血素分泌铁收购有助于更深的组织入侵紧随其后假丝酵母(34]。在目前的研究中,30.4%的c . tropicalis显示溶血性活动。鬃毛et al。35溶血性高活动报道c . tropicalis与艾滋病毒感染者。
在胞外水解酶、蛋白酶和磷脂酶扮演主要角色在宿主组织入侵,殖民,感染进展(32]。磷脂酶促进入侵宿主粘膜上皮细胞通过一个或多个酯水解联系glycerophospholipids [30.]。在我们的研究中磷脂酶表达的主要致命的因素c . tropicalis隔离。研究人员对磷脂酶活动报道相互矛盾的结果c . tropicalis。调查人员像Thangam et al。36]报道高磷脂酶的活动c . tropicalis隔离在南汽种虫害而其他像Samaranayake et al。10没有活动报告。这些不一致的观察可能是由于生理差异之间的隔离测试。本研究还演示了在生物膜形成隔离高磷脂酶活性。筛选生物膜磷脂酶生产形成隔离可以作为一个重要的参数来区分从无创性殖民者侵入性压力。
蛋白酶能够降解宿主上皮和粘膜屏障蛋白如胶原蛋白、角蛋白和粘蛋白。他们也帮助假丝酵母抵抗细胞和体液免疫的抗体,补充,细胞因子(37]。总共的52%c . tropicalis隔离是蛋白酶生产商。这个观察是在协议与其他研究人员Deorukhkar和赛(5),鬃毛et al。35],Dosta et al。38]。
开发和利用抗真菌敏感性测试仍低于抗菌测试。CLSI标准化汤采用方法是复杂的,劳动密集型的使用作为一种常规方法。阀瓣扩散和浓度梯度法等其他方法已经用于敏感性测试假丝酵母种虫害资源有限的医院实验室(39,40]。
在我们的研究中,电阻率唑组的抗真菌药物更比两性霉素b唑耐药性c . tropicalis是不够了41]。在目前的研究中,c . tropicalis隔离被发现更耐氟康唑。据报道,耐氟康唑都增加了。Sanglard和Ct概率描述超表达ERG11错义突变相关的基因负责收购唑耐药性c . tropicalis(42]。
的增加耐氟康唑c . tropicalis情况令人担忧,因为这个物种是一种最常见的孤立的NAC种虫害和氟康唑是最常见的抗真菌剂用于治疗各种类型的念珠菌病。c . tropicalis分离菌血培养了较高的耐氟康唑。我们的观察是在协议与杨et al。8]。
c . tropicalis能够表现出某些毒性因素如生物膜的形成和磷脂酶产量较高的耐氟康唑。与细菌生物膜,假丝酵母生物膜抗多种抗菌药物;移除和替换被感染的医疗设备所需有效治疗(1]。在磷脂酶生产氟康唑的确切机制抵抗假丝酵母种虫害不清楚(43]。需要更多的clinicomycological研究来探索这个交互作用。
5。结论
增加系统性念珠菌病的发病率以及抗真菌耐药性已成为全球重要的医疗保健问题。南汽种虫害等c . tropicalis表现出很大程度的变化不仅在其致病性,而且在他们的抗真菌敏感性概要文件。毒性属性的识别特定于每个物种及其相互关系将帮助感染的发病机制的理解。感染的早期和准确识别的重要性假丝酵母物种以及磁化率测试机构及时适当的治疗不能被夸大。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
本研究进行的庇护下实验室,农村医学院微生物系。作者感谢农村医疗学院的管理和农村医院Pravara医学科学研究所,认为大学Loni,马哈拉施特拉邦,印度为他们鼓励和支持在整个研究。他们也感谢部门的技术人员在研究微生物的援助。