文摘
细菌可以减少有毒亚硒酸到更少的有毒,元素硒(硒0),但对细菌细胞机制减少亚硒酸盐在分子水平上还不清楚。我们使用大肠杆菌应变K12,常见的菌株,作为模型来研究其生长对亚硒酸钠(Na2搜索引擎优化3)治疗,然后使用定量实时PCR(存在)来量化转录水平的三个大肠杆菌selenopolypeptide基因和一套机械硒代半胱氨酸的基因(SeCys)生物合成和并入多肽,其责任人亚硒酸的减少很大程度上是未知的。我们决定5毫米Na2搜索引擎优化3治疗抑制经济增长∼50%,0.001 - 0.01毫米治疗刺激细胞生长∼30%。低于50%的抑制或刺激Na的30%2搜索引擎优化3浓度,selenopolypeptide基因(fdnG,fdoG,fdhF)的产品需要SeCys但不是SeCys机械生物合成基因被发现是诱导≥2倍。此外,一个硫(S)代谢基因isc和两个之前报道selenite-responsive基因苏打水和勇气也诱导≥2倍低于50%抑制浓度。我们的研究结果提供关于亚硒酸的解毒的洞察力大肠杆菌通过诱导这些基因参与了亚硒酸盐还原法。
1。介绍
硒(Se)是一种非金属元素原子序数34,这是化学相关的硫(S)和碲但很少发现在它的基本形式。本身是一个重要的微量营养素对哺乳动物和一些细菌和硒代半胱氨酸的一个组成部分(SeCys),一种氨基酸所使用的一组蛋白质(1,2]。在大肠杆菌基因组中,有三种甲酸脱氢酶FdhN, FdhO, FdhH每个组成一个selenopolypeptide要求SeCys [3- - - - - -6甲酸)的氧化和二氧化碳(2]。在浓度升高,然而,Se可以有毒7,8]。众所周知,高硒水平产生活性氧,导致DNA损伤和各种疾病在哺乳动物8,9]。之前的研究表明,一些细菌,与哺乳动物和酵母,可以容忍高水平的Se通过减少有毒硒酸盐和亚硒酸不溶性,更少的有毒,红色Se元素(Se0)[10- - - - - -13]。在自然界中,硒酸盐和亚硒酸盐主要是两种类型的可溶性无机化合物。亚硒酸比硒酸和其他形式的Se有毒化合物(14]。因此,减少亚硒酸的微生物有一个广泛的生物的重要性。
一些细菌种类包括大肠杆菌亚硒酸转换为Se的能力吗0(15- - - - - -27]。大肠杆菌菌株生长的9.2毫米亚硒酸盐和亚硒酸有效代谢成Se0(12]。然而,如何减少,亚硒酸的详细过程分子机制的使用,和亚硒酸细菌细胞如何应对仍未知(13,28]虽然减少亚硒酸的生理机制研究了在几个物种(12,15,26]。亚硒酸相信像硒酸硫酸可以进入细胞通过通透酶系统控制的cysA,cysU,cysW(12]。亚硒酸也可能进入细胞通过另一个系统,如硫酸,硫酸因为中断通透酶表达不完全阻断其吸收(12]。亚硒酸进入细胞后,可能会减少硒化(12),其次是氧化0(29日]。进一步研究亚硒酸盐还原所涉及的分子机制是必要的,这将帮助理解亚硒酸的解毒。
目前,有关知识分子机制参与亚硒酸减少大肠杆菌仅限于四个基因已确定对亚硒酸钠(Na吗2搜索引擎优化3)治疗。他们三个是氧化应激stimulons苏打水,气油比,trxB编码,锰超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶和硫氧还蛋白还原酶,分别调节≥5倍的2毫米Na2搜索引擎优化3治疗(30.]。第四个基因是勇气(或称为yhfC)编码的多肽,同族体膜运输蛋白,可引起钠0.03 - -0.06毫米2搜索引擎优化3和0.002毫米亚碲酸钠(31日]。微阵列分析采用全基因组转录变化进行调查茎菌属crescentus细胞治疗0.3毫米Na2搜索引擎优化3;只有12个基因被认为是调节约2 - 5倍(32]。然而,所有这些基因也引起铬和镉(32],这意味着他们更有可能是一般应力诱导基因亚硒酸而不是具体回应。没有上述四个selenite-induced基因的同源基因参与氧化应激(30.)、膜运输(31日Na)被认为是调节2搜索引擎优化3在c . crescentus(32]。因此,深入分析理解是至关重要的任何额外的细菌基因组的基因是否负责亚硒酸的减少。
在大肠杆菌,只有三个蛋白质FdhN FdhO FdhH,每个包含一个多肽需要SeCys残留的活动(3- - - - - -6]。的基因fdnG编码一个110 kD selenopolypeptide,FdhN的亚基。的fdoG编码110 kD selenopolypeptide FdhO而fdhF编码一个80 kD selenopolypeptide FdhH。此外,还有一群SeCys生物合成基因和整合机械SeCys和selenopolypeptides如生物合成的塞拉(硒代半胱氨酸合成酶)selB(selenocysteinyl-tRNA-specific翻译因素),selC(tRNA特定硒代半胱氨酸)selD(selenophosphate合成酶)6,33),ybbB(selenophosphate-dependent tRNA 2-selenouridine合成酶)34),而进而(PLP-dependent硒代半胱氨酸裂合酶)35]。亚硒酸盐还原期间我们质疑这些基因如何回应。评估Se代谢基因的转录水平变化,Na2搜索引擎优化3刺激30%和50%浓度抑制细菌细胞生长测定和用于研究其表达式定量实时PCR(存在)。此外,也用于屏幕selenite-responsive基因微阵列分析除了以上选择的基因。
2。材料和方法
2.1。菌株和生长条件
大肠杆菌应变K12的被用于这项研究。细菌细胞生长在Luria-Bertani 14-mL聚苯乙烯圆底管(磅)中。最后一卷3毫升用于文化和孵化在37°C在225 rpm旋转瓶不同的时间取决于实验。
2.2。筛选抑制和鼓舞人心的浓度
的浓度,以确定哪些Na2搜索引擎优化3抑制细菌生长刺激,一夜K12的文化适应光学密度在600 nm (OD600年)(1)用作细菌原液进行测试。Na2搜索引擎优化3(Sigma-Aldrich)溶解在ddH2亚硒酸O准备1 M股票的解决方案。最初,每一个20μL的细菌原液接种到3毫升磅中含有钠2搜索引擎优化3最终浓度为0、25、50、75、100或125毫米。实验进行三个生物复制一式三份,每个浓度测试。经过14 h的增长,Se亚硒酸的程度0减少的红色在每个文化的程度确定定性和照片进行比较。减少红Se以来0可能会干扰光密度测量,细菌生长是由计数活细胞数。细胞被使用LB培养基稀释,然后20μL稀释文化传播到磅琼脂和孵化在一夜之间37°C。连续稀释为每个文化都是一式三份。因此,菌落(cfu)计算每个治疗九个盘子。
初始测试后0、5、10、15、20、25、30 mM Na2搜索引擎优化3被用来确定浓度,抑制细菌生长。另一个实验中使用低浓度(0,0.0001,0.001,0.01,0.05,0.1,0.5,1、5和10毫米)进行,以确定哪些浓度刺激细菌生长。两个实验进行三个生物复制一式三份,每个浓度测试。
2.3。确定一个时间点的显著增长5毫米Na之间的区别2搜索引擎优化3处理和未经处理的文化
筛选抑制亚硒酸盐的浓度后,文化被接受选择5毫米Na2搜索引擎优化3决定什么时候应该收获细胞RNA提取的显著差异在治疗细菌生长和未经处理的控制可以观察到。使用相同培养条件如前所述;处理和未经处理的文化孕育在37°C为0,2,4,6,8,10,12或14 h。集落形成单位为每个时间点记录如前所述。三个生物复制一式三份完成了为每个文化。
2.4。准备0.5 - 2 h文化中存在的分析
研究文化的影响持续时间诱导selenite-responsive基因,两次此前报道,0.5 h (30.,32)和2 h (30.,31日),选择6 h进行测试。以确定一个最优初始文化允许细胞浓度达到对数期增长0.5和2 h后短文化时期,细胞precultured首先到达OD600年0.2、0.4和0.8;然后,这些都是作为初始接种菌浓度为0.5,培养1、1.5、2、2.5、和3 h。每个文化的细胞密度是通过测量记录OD600年价值。三个生物复制一式三份分析每个时间点都是对整个实验。
2.5。RNA隔离
总RNA分离使用RiboPure-Bacteria RNA隔离设备(美国应用生物系统公司/ Ambion)和DNase对待我(美国应用生物系统公司/ Ambion)来删除任何DNA污染。RNA浓度量化使用NanoDrop ND 1000分光光度计。RNA是可视化的质量1.2%的琼脂糖凝胶。微阵列分析、RNA质量进一步检查使用双光束分光光度计和安捷伦生物分析仪2100芯片实验室系统。
2.6。存在分析
三个selenopolypeptide基因(fdnG,fdoG,fdhF)和五个机械基因(塞拉,selB,selD,ybbE,进而)SeCys生物合成和插入选择量化的表达水平对亚硒酸治疗。的selC没有选择,因为它的序列(95个基点)太短,以满足要求的引物设计软件底漆Express 3.0(美国应用生物系统公司/ Ambion)设计一对引物。之前报道四selenite-induced基因(气油比,苏打水,trxB,勇气)[30.,31日)和三个代谢相关基因(sbp硫酸输送单元,thiP、硫胺转运体膜蛋白isc半胱氨酸desulfurase) (36- - - - - -38)包含了比较。细菌细胞治疗和治疗有0.01或者5毫米Na2搜索引擎优化3被用于RNA隔离。等量的RNA为每个样本被用来合成第一链cDNA高容量cDNA逆转录工具包和随机引物(美国应用生物系统公司)。PCR进行力量SYBR绿色混合(美国应用生物系统公司)。引物设计和ΔΔCt计算进行了如前所述[39]。选择基因序列从应变检索K12的基因组(加入。AC_000091)存入NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)设计引物。的16 s rRNA作为一个内生控制。16 s rRNA引物设计基于719个基点保守地区的七个成员(rrsA,B,C,D,E,G,H)也从应变K12基因检索。每个样本化验一式三份,与三个生物复制实验重复了。详细的每个基因的引物信息列在表中1。
2.7。微阵列分析
细菌细胞治疗和治疗0、0.01或5毫米Na2搜索引擎优化36 h用于微阵列分析筛选额外selenite-responsive基因并不在前面的分析中存在。三个复制处理和未经处理的样品。在这个实验中使用的微阵列芯片是Affymetrix GeneChip大肠杆菌美国基因组2.0数组(Affymetrix)包含10208个探针集检测整个20366个基因在K12的应变和其他三名大肠杆菌菌株。RNA质量控制分析、标准化cRNA标签,阵列杂交在基因组探索加工有限公司(http://www.genome-explorations.com/美国)。原始信号(移动电话文件)被标准化,转换成日志2值的MAS 5(按比例缩小的TGT = 250)。统计分析的意义分析基因的交通的工具集来执行多级方差分析。两两之间的比较是未经处理的控制和治疗0.01或5毫米。所有探针集比较达到绝对改变≥1.5折起来以及值≤0.05进一步确认中存在的选择。提到的存在条件和内生控制使用。序列相关的基因从应变检索K12的基因组。详细的每个基因的引物信息列在表中1。
2.8。统计分析
细胞数量之间的比较未经处理的控制和Na2搜索引擎优化3治疗,学生的以及使用。
3所示。结果
3.1。Na2搜索引擎优化3浓度导致50%的抑制效果
检查Na2搜索引擎优化3抑制对细菌生长的影响,大肠杆菌K12的培养在高浓度的钠的存在2搜索引擎优化3在0、25、50、75、100、或125毫米。结果表明,所有这些导致超过50%的抑制亚硒酸治疗大肠杆菌增长(图1(一))。一夜之间治疗使用25毫米亚硒酸抑制细菌生长比未经处理的文化(图约8倍1(一)),导致文化变红(图1 (b)亚硒酸),表明减少发生。50 mM或使用亚硒酸浓度高时,细胞数量大大减少,这些文化但不会彻底红了。这表明,亚硒酸盐还原在高亚硒酸浓度降低,这可能是由于极低的细菌细胞的数量。
(一)
(b)
(c)
(d)
窄范围的Na2搜索引擎优化3(0到30毫米和5毫米的间隔)是用来确定钠的浓度2搜索引擎优化3这将抑制细菌增长了50%。我们发现5毫米Na2搜索引擎优化3治疗细胞数量减少了53%,并将红色文化(数字1 (c)和1 (d))。浓度的10到30毫米使用时,细胞数量减少了79 - 97%,所有这些文化仍然变红,尤其是在10和15毫米。这些结果与以前的观测一致,亚硒酸盐可以减少到红色0通过大肠杆菌(12,30.亚硒酸),表明减少发生有效大肠杆菌K12的细胞治疗5 - 30毫米Na2搜索引擎优化3。
3.2。Na2搜索引擎优化3浓度有刺激作用
Se是细菌生长的必需元素。来确定Na2搜索引擎优化3浓度范围刺激细菌生长,0到10毫米Na2搜索引擎优化3进行了测试。与未经处理的控制相比,0.0001到0.1毫米Na2搜索引擎优化3治疗可以刺激K12的细胞生长(图2(一个))。刺激效果从10%上升到30%,当浓度从0.0001增加到0.001毫米。然而,没有观察到明显的颜色变化在0.0001到0.01毫米对待文化中,表示没有或非常低水平的亚硒酸减少发生(图2 (b))。亚硒酸的刺激影响细胞生长和增加减少的Na2搜索引擎优化3浓度(图2(一个))。0.05到0.5毫米的治疗方法被使用时,文化变红(图2 (b)),但刺激这些疗法对细菌生长的影响是轻微的(图2(一个))。一致,超过50%的抑制效果与清晰的红色文化在这个实验观察Na2搜索引擎优化3浓度高达5和10毫米。基于上述结果,0.01毫米被选为刺激浓度进行进一步的研究。
(一)
(b)
3.3。选择基因的表达水平在抑制和刺激条件
调查如何selenopolypeptide基因和机械SeCys生物合成基因和插入应对Na2搜索引擎优化3浓度导致30%的刺激或抑制细菌细胞增长50%,其转录水平被存在量化。相比之下,收获Na2搜索引擎优化3处理和未经处理的文化在一个时间点,增长最显著的差别是很重要的。为此,5毫米Na ~ 50%抑制浓度2搜索引擎优化3是用于文化和细菌生长监测每2 h 14 h。细胞密度显著不同的处理和未经处理的文化之间在生长2和4 h(图3(一个))。细胞的数量在对待文化在第一次减少2 h的增长,这表明一些细胞有可能死于最初的文化舞台。存活细胞逐渐陷入增长,达成最高的细胞数量在10 h。未经处理的文化,另一方面,达到早期固定相在6 h,但最高的细胞数量也在10 h。因此,本文选取6 h作为量化的时间点收获细胞基因表达水平。
(一)
(b)
调查selenite-responsive基因的表达在不同的文化中时间点,此前报道的时候0.5 [30.,32)和2 h (30.,31日)也使用以及6 h治疗。然而,细胞的数量可能太低了隔离一个可用的RNA的质量和数量增长0.5和2 h后如果相同的20倍μL细菌原液(OD600年= 1)接种到3毫升磅中等。确定哪些初始浓度将允许文化达到对数阶段培养后0.5到3 h,预备考试文化与初始OD实验进行600年0.2、0.4和0.8。结果表明,OD600年值增加从最初的0.2,0.4,0.8,0.4,0.6,和0.9后培养为0.5 h, 0.9, 1.1,和1.2培养2 h后,分别(图3 (b))。基于这些观察,细菌生长达到0.5和2 h后日志阶段文化当初始OD600年0.4使用。因此,文化与初始OD600年0.4处理0.01或5毫米Na2搜索引擎优化30.5或2 h被用来研究基因表达。
存在结果表明两个selenopolypeptide基因fdnG和fdoG被诱导2 - 0.01或5毫米Na 10倍2搜索引擎优化32到6小时治疗,但不是在0.5 h(图4(一))。第三个fdhF是诱导2倍0.01和5毫米Na呢2搜索引擎优化3治疗2 h。表达水平的所有五个SeCys生物合成和插入机械基因塞拉,selB,selD,ybbE,进而没有显示任何治疗≥2倍的变化(图4 (b))。这些结果表明,维护这些机器的常数表达式是生存所必需的基因。关于三个年代代谢基因,isc是诱导治疗2.7 - 2.2倍,5毫米2和6 h(图4 (c))。剩下的两个基因治疗isc在剩余的治疗没有造成≥2倍的表达水平的变化。当四之前报道亚硒酸盐诱导基因进行了分析,其中两个(苏打水和勇气)诱导治疗2.6 - 3.8倍,5毫米2和6 h而不是其他疗法(图4 (d))。其他两个基因的表达水平(气油比和trxB)不符合截止在5毫米或0.01倍治疗,这与先前的报告不一致Bebien et al。30.]。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。识别额外的Selenite-Responsive基因微阵列分析
微阵列基因差异表达分析是一种强大的方法来研究同时通过全基因组筛查。为了识别基因除了上面所选基因响应当前亚硒酸盐处理条件下,微阵列分析比较在全基因组转录水平的基因治疗细胞之间和0.01或5毫米和6 h细胞治疗。RNA样本三个生物复制/治疗被用于杂交。结果表明,杂交探针的信号集平均是554.4,557.0,39.7和560.1,而背景信号,45.8,47.4,未经处理的,0.01毫米,5毫米处理样品,分别(表2)。这些结果表明,杂交和扫描效率。使用统计分析两两比较的数据后,褶皱变化之间的所有基因治疗和0.01或5毫米计算处理。全基因组的比较与K12的基因组的4326个基因(40)通过微阵列显示,几乎没有一个基因的转录水平变化超过2倍文化发展时刺激30%或50%亚硒酸抑制条件下(数据没有显示)。令人惊讶,以上selenite-responsive基因的转录水平检测到存在不显示区别对待和控制。只有表达水平的yegB(探针组ID 1764732)诱导2.2 - 0.01和1.8倍,5毫米治疗,分别(表2),但其平均杂交信号组为27.0,这是低于39.7(表背景信号2)。
使用绝对改变≥1.5折起来值≤0.05作为标准,三个基因在K12基因被诱导表达在两个基因被0.01毫米Na2搜索引擎优化3治疗6 h(表2)。当K12的细胞治疗5毫米6 h,只有两个基因被诱导而他们被抑制在一个表达式。在这些发现selenite-responsive候选基因,yegB是诱导≥1.5,0.01和5毫米的治疗方法。然而,所有这些候选基因杂交信号相对较低(表2)。存在时用来证实这些selenite-responsive候选基因的表达水平细胞治疗与亚硒酸0.01或5毫米0.5,2,或6 h,可他们都没有他们的表达水平改变刺激或抑制条件下超过1.5倍(图5)。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
以前的研究已经表明大肠杆菌亚硒酸细胞表现出三种类型的反应,当受到治疗。在极低的浓度(< 0.0002毫米),亚硒酸盐很容易融入SeCys硒蛋白的合成,如甲酸脱氢酶(4]。在中等浓度(> 0.001毫米),亚硒酸盐侵入沿着路线的代谢途径和代谢的代谢,但从不影响细胞生长,直到达到0.08毫米(41,42]。在更高浓度(> 5毫米),亚硒酸盐成为有毒通过氧化应激的机制(30.]。在目前的研究中,0.001到0.01毫米亚硒酸钠浓度被发现(图促进细菌增长约30%2(一个))。所有四个浓度的趋势用于刺激效应虽然都是一样的0.001和0.05 mM的治疗没有明显刺激作用。同时,5毫米治疗抑制细胞生长稳定超过50%(数据1 (c),2(一个),3(一个))。我们的经济增长研究的结果与先前的报道是一致的(4,30.,41,42]为进一步调查selenite-responsive基因奠定基础。
使用中存在的分析,我们发现这三个selenopolypeptide基因fdnG,fdoG,fdhF编码selenopolypeptides FdhN、FdhO FdhH诱导超过2倍0.01和5毫米Na2搜索引擎优化3(图4(一)),它没有被报道。大肠杆菌只有这三个蛋白质与每个包含一个selenopolypeptide要求SeCys的活动(3- - - - - -6]。SeCys的可能角色这些酶可能是重要的氧化还原电势的调整,使催化反应可能没有氧气传输(43]。FdhN和FdhO负责氧化硝酸甲酸和甲酸的电子转移(44,45]。因此,观察结果可以简单解释说,这些基因的诱导表达编码selenopolypeptides亚硒酸的只是保护细菌细胞通过其抗氧化功能。这可能是合理的fdnG,fdoG,fdhF只有5毫米Na引起的吗2搜索引擎优化3治疗。因为他们被0.01毫米Na诱导2倍以上2搜索引擎优化3,这些蛋白质包含SeCys是否有额外的功能除了抗氧化作用需要进一步研究。在0.01毫米Na2搜索引擎优化3亚硒酸的一小部分,可以用来合成selenopolypeptides虽然很大程度上可能代谢与先前的研究建议的年代(41,42]。然而,这些结果表明,这些selenopolypeptide基因亚硒酸直接或间接参与的减少。
此外,我们还发现一个硫代谢基因isc和两个之前报道selenite-induced基因苏打水和勇气是诱导只有5毫米(图4 (d)),这表明这些基因也参与亚硒酸的减少。下5毫米Na2搜索引擎优化3治疗,细菌细胞有毒的条件下已经有超过50%的增长抑制亚硒酸虽然减少仍活跃从Se的积累0(数据1和2)。众所周知,在不良条件下,亚硒酸减少涉及thiol-containing分子的反应与含巯基的团体,如谷胱甘肽、和其中的一些反应产生活性氧,过氧化氢和过氧化物(12,30.]。过氧化氢和过氧化物都可以破坏细胞膜和DNA (46]。因此,基因苏打水编码抗氧化酶(30.)是诱导氧化应激反应。然而,目前尚不清楚为什么之前报道亚硒酸盐诱导基因气油比和trxB,分别编码蛋白质抗氧化剂谷胱甘肽还原酶和硫氧还蛋白还原酶(30.亚硒酸),不能引起的治疗在目前的研究中。诱导表达勇气亚硒酸的是类似于以前的报告31日]。的勇气基因产物可以使Se渗透进入细胞,因为它的股票与膜运输蛋白同源性。感应的isc亚硒酸盐有毒的条件下(图4 (c))可能是由于它的年代和Se新陈代谢双重职能。与其他两种硫代谢基因,isc也是生物合成所需的tRNA 2-selenouridine和FdhH [47]。
在目前的研究中,我们也试图识别selenite-responsive全基因组基因芯片筛选。令人惊讶的是,这个筛选没有产生任何selenite-responsive抑制基因在细胞治疗50%或30%刺激Na2搜索引擎优化3浓度。我们的微阵列实验的结果是类似报道胡锦涛和同事(32),只有少数一般应激基因芯片筛选确定。尽管低估褶皱的变化差异表达基因微阵列分析报告之前相比,存在分析(48),胡锦涛和同事(2005)(32)仍然可以使用微阵列分析来识别铬和镉(但不是Se)诱导基因的细菌。我们目前的芯片结果与微阵列筛选结果报道胡锦涛et al。(2005) (32从亚硒酸治疗细菌细胞表明亚硒酸减少可能导致从微小的贡献从少量的基因在转录水平和轻微的变化,微阵列分析可能不够敏感识别那些selenite-responsive基因,这可能是由中存在标识。
5。结论
我们已经全面研究了细菌生长在不同浓度的Na2搜索引擎优化3和确定,0.001到0.01毫米促进细菌增长约30%,而5毫米治疗抑制细胞生长50%以上。虽然不够敏感的微阵列分析识别这些selenite-responsive基因在细菌中,我们能够确定基因编码selenopolypeptides亚硒酸和一些抗氧化蛋白参与减少。我们的研究结果将有助于进一步阐明机制负责亚硒酸的减少。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是由美国国家农业合作研究,教育和推广服务格兰特(没有。2009-35318-05032),生物技术研究格兰特(没有。2007 - brg - 1223)的北卡罗莱纳生物技术中心和创业基金金叶子基金会为生物研究所和科技企业(闪亮)。