文摘
介绍。自2001年以来,当人类metapneumovirus(HMPV)被孤立在荷兰,病毒已经被发现在几个大洲。虽然报道已经证实HMPV的患病率在世界范围内,从埃及数据仍然有限。HMPV呼吸道感染中起着重要的作用在所有年龄段的人们特别是儿童。本研究旨在估计的患病率HMPV社区获得性下呼吸道感染患者在上埃及和描述循环埃及首次HMPV菌株。材料和方法。从2005年到2008年,520名患者呼吸道样本实时rt - pcr分析HMPV的存在。分子系统发育分析的部分融合基因序列HMPV-positive病人。结果。HMPV-positive患者中发现2007 - 2008。总体感染率为4%,而57%的患者的孩子。序列分析表明循环子群乙型流感病毒谱系B2的优势。核苷酸序列的身份在血统B1是98.8% - -99.7%,高于血统B2 (94.3% - -100%)。三个新的氨基酸替换(T223N、R229K D280N)的血统B2观察。结论。HMPV是一个主要的病毒病原体在埃及人口特别是儿童。2007 - 2008年期间,主要HMPV B2在上埃及流传。
1。介绍
人类metapneumovirus(HMPV)是一个笼罩,单链RNA病毒的消极意义上讲已经分类的Metapneumovirus副粘病毒科的一个属(1)和最密切相关的呼吸道合胞体病毒(RSV) [2]。病毒的基因档案由13350个核苷酸组成,组成核蛋白(N)、磷(P)、基质蛋白(M),融合蛋白(F),基质蛋白(M2-1和M2-2),小疏水蛋白(SH)糖蛋白(G),依赖RNA的RNA聚合酶(L) (3]。融合(F)和附件(G)蛋白是主要HMPV表面糖蛋白。HMPV F基因编码1类病毒融合蛋白介导病毒进入通过附件(4)与宿主细胞膜融合(5]。HMPV F蛋白是一个主要的抗原决定簇介导广泛cross-lineage中和和保护。感染每一个压力提供了一个高水平的抵抗再感染与同源或异源压力(6]。子组之间的F基因是相对保守的,使它的理想目标核酸扩增(7]。
进化分析表明它来自密切相关禽流感metapneumovirus C(AMPV-C)大约200年前8,9]。生产性实验感染的家禽HMPV尚未成功,和血清学研究未能发现人类感染的证据AMPV [10]。最近的数据表明,F蛋白负责这个物种限制。因此,HMPV感染人类可能出现的相对近期的种类从AMPV-C传输11]。
有高seroprevalence HMPV血清的成年人年龄超过40岁,这表明它是一种新近发现的而不是一种新出现的病毒(10,12- - - - - -17]。
HMPV引起的临床症状类似于RSV感染,包括发热、咳嗽、气喘、呼吸困难、鼻涕,咳痰,哮喘18- - - - - -20.]。几项研究已经表明,HMPV占高比例的下呼吸道感染住院治疗下呼吸道感染的婴儿,儿童,和其他高危人群,如免疫功能低下的患者(14,21- - - - - -23]。HMPV感染率从5.5%到25%不等的儿童住院治疗呼吸道疾病(24- - - - - -26]。
成人HMPV感染的临床表现取决于年龄和健康状况(2]。在年轻的成年人(14-25岁),HMPV感染的临床症状类似于其他呼吸道病毒感染包括咳嗽、鼻涕,咳痰。相反,在中年(26 - 65岁)和健康老年人(> 65岁),HMPV类似于流感感染和普通感冒(2]。虽然HMPV感染的发病率在健康成年人在冬天通常是不到6% (27- - - - - -29日),HMPV被认为是一个主要因素呼吸道疾病在老年人的负担29日]。
系统发育分析HMPV已经确定了两个子组,A和b都可以分为遗传血统A1和A2和B1和B2,分别。所有病毒变种被确定在不同的国家在美洲,亚洲,欧洲8,30.,31日]。
虽然报道已经证实HMPV的患病率在世界范围内,数据来自北非和中东仍然有限。第一次,本研究结合HMPV患病率和分子流行病学数据,埃及HMPV系统发育分析。
2。材料和方法
2.1。研究设计
Assiut大学医院的研究。Assiut大学医院在埃及最大的医院之一,他们主要是给医疗服务上埃及的所有地区。上埃及分为九个省,贝尼省Suef, Menia, Assiut,索哈杰省,故事,卢克索,阿斯旺,新谷,红海。
从2005年12月到2008年2月,与病人进行前瞻性研究,医院与社区获得性下呼吸道感染(下呼吸道感染)。这项研究是医学伦理委员会批准Assiut大学医院,和口头同意来自成年受试者或孩子的父母之前样本集合。
下呼吸道感染是临床诊断的咳嗽为主要症状,一起吐痰,呼吸困难、喘息、胸部不适或疼痛。
所有与会者都采样在同一天或住进医院后在24小时内。确诊病人下呼吸道感染后48小时的承认(院内下呼吸道感染)被排除在外,确保社区获得性病毒感染的诊断。参加军训期间的考试,成年人连续三个冬天春天季节,而孩子们参加2007 - 2008赛季。根据Assiut大学医院的政策,孩子们那些≤14岁,而成人患者中被定义为患者> 14岁。所有的孩子在儿科门诊了。成年人在胸部诊所或承认胸部部门或胸部Assiut大学医院重症监护室(表1)。病人被要求填写一份调查问卷与人口和临床资料,包括年龄、性别、居住地、职业、出现症状,入学日期和地点,临床诊断、相关危险因素(吸烟、心肺疾病有关,免疫抑制状态,和其他系统的感情),和抗生素治疗。
2.2。样品收集
总共520名患者前瞻性的研究。增加的数量病毒呈阳性的样本身上不止一个每个病人标本收集。鼻拭子标本(NS),咽喉拭子(TS),鼻吸入物(NA),气管吸入物(TA)支气管肺泡灌洗(提单),漱口(G),痰(S),样本收集到无菌杯含有磷酸缓冲盐病毒运输介质。整除从每个样品做,并且储存在−样本80°C,直到最后运往国家流感中心,德国,罗伯特•科赫研究所实验室进行了系统发育分析。
2.3。RNA提取和实时rt - pcr检测
从400年病毒基因组RNA的提取µL原始样品使用RTP DNA / RNA病毒的迷你包(Invitek、德国)根据制造商的指示。实时PCR进行化验检测HMPV和其他呼吸道病毒包括甲型和乙型流感病毒(32,33A和B)、呼吸道合胞体病毒(RSV) (34),腺病毒(副词)35]。一个两步rt - pcr方法用于HMPV融合基因的检测和放大(36]。与25逆转录步骤执行µL病毒RNA和15µ包含200 L的反应混合物µM deoxynucleoside三磷酸腺苷(核苷酸)(通用电气医疗集团、奥地利),5毫米二硫苏糖醇(DTT)(英杰公司、德国),0.4毫米随机引物(英杰公司、德国),20-unit RNasin核糖核酸酶抑制剂(美国Promega), 100 -单位Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶酶(M-MLV)(英杰公司、德国),和一个反应缓冲区(英杰公司、德国)。反应进行了热循环仪在T3000 (Biometra、德国)5分钟42°C,紧随其后的是30分钟在37°C和5分钟在94°C。两套primer-probe对被用来检测和放大HMPV融合(F)基因通过实时PCR(表2)。反应混合物由PCR缓冲(英杰公司、德国),100年µM核苷酸(通用电气医疗集团、奥地利),5毫米MgCl2(默克公司、德国),0.5单位白金TaqDNA聚合酶(英杰公司、德国),每个引物500海里(Tib的Molbiol、德国),每个探测器100海里(美国应用生物系统公司)和3.0µL cDNA 25的最后一卷µl .反应进行Stratagene Mx3000和Mx3000P仪器。PCR热剖面由一个初始步骤5分钟在95°C,紧随其后的是45周期每个组成的15 95°C和30年代60°C。
2.4。PCR和测序
局部放大的F蛋白基因进行供外部或seminested PCR HMPV-positive样本。反应混合物成立于50的总量µL包含PCR缓冲,100年µMgCl M核苷酸,3毫米2(默克公司、德国),0.5单位白金Taq每个引物的DNA聚合酶,250海里,和5.0µL DNA模板。放大了5分钟在94°C紧随其后40周期在94°C 30年代,30年代,60°C和72°C 45年代,最终在72°C扩展了10分钟。引物hmpv - 3637 f, hmpv - 4192 - r1, R2被用于第一轮PCR(表2)。555个基点的放大产品可视化GelRed或溴化乙锭染色后在2%琼脂糖凝胶电泳。在负面结果的情况下,2µL外PCR反应用于semi-nested PCR在50µL与250海里的每一个反应引物hmpv - 3637 f和hmpv - 4164 r(表2)。527个基点的嵌套的扩增子被琼脂糖凝胶电泳和可视化。
在排序之前,扩增子纯化直接使用MSB旋转PCRapace工具包(Invitek、德国)或从琼脂糖凝胶中提取使用JETquick凝胶萃取自旋工具包(基因组、德国)根据制造商的指示。纯化PCR测序产品周期与先前用于外部和semi-nested PCR引物对,分别在一个ABI-Prism 3130 xl基因分析仪(应用生物系统公司、德国)使用大染料终结者v3.1循环测序工具包(应用生物系统公司、德国)。
2.5。系统发育和分子分析
多序列比对是编译的部分(439元)的F基因的FI单元使用ClustalW大型4.0版本软件(37]。在大型,Neighbor-Joining树与HKY85模型计算和可靠性1000复制。系统发育树是根植于禽流感metapneumovirus C(AMPV-C)。以下序列描述HMPV子组和血统被包含在系统发育分析:DQ009484 (AMPV-C) AY145288 (can98 - 73), AY145289 (can98 - 75), AY145290 (can98 - 76), AY145296 (can97 - 83), AY145297 (CAN00-12) AY145298 (CAN00-13) AY145299 (CAN00-14) AF371337 (NL / 1/00), AY304360 (NL / 17/00), Y304361 (NL / 1/99), AY304362 (NL / 1/94), DQ362939 (Arg / 1/98), DQ362944 (Arg / 1/99), DQ362947 (Arg / 1/00), EU857567 (TN / 94/1-1), EU857569 (TN / 89/7-13), EU857570 (TN / 97/2-37), EU857571 (TN / 98/2-42), EU857572 (TN / 87/2-7), EU857573 (TN / 88/4-21), EU857581 (TN / 99/4-19), EU857587 (TN / 94/4-13), EU857592 (TN / 92/10-32), EU857594 (TN / 01/2-8), EU857595 (TN / 98/5-12), EU857599 (TN / 91/5-21), HQ456590(蒙古包/ 2499/04),HQ456598(蒙古包/ 0394/06),HQ456606(蒙古包/ 0513/07),HQ456611(蒙古包/ 0043/08),HQ456613(蒙古包/ 0259/08),HQ456617(蒙古包/ 0562/08),HQ456633(蒙古包/ 3379/10)。埃及的基因库加入数字HMPV序列JQ041674, JQ041675, HQ909765, JQ041676 HQ909766, JQ041677-JQ041695。
成对核苷酸和氨基酸之间的身份在和遗传血统B1和B2计算使用Bioedit版本7.2.3 [38]。
2.6。统计分析
SPSS程序16.0版本是用于计算未配对以及确切概率法,分别。
3所示。结果
3.1。研究人群
从2005年到2008年,总共有520例社区获得性下呼吸道感染患者前瞻性的研究。几乎所有病人(99%)上埃及和不同年龄段的居民(表1)。埃及的病人,一个病人是来自也门共和国来到埃及寻求医疗护理(表1)。儿童代表13%人口(69名患者)的研究,而成年人代表87%(451例)。孩子们的平均年龄为2.7岁,平均年龄为1年。对于成年人,平均年龄为47.9岁,平均年龄49岁。男性儿童和成人组成分别为55%和61%。考试期间,成年人样本收集连续在三冬天春天季节,而孩子们前瞻性的2007 - 2008赛季(表3)。
的520患者中,369(71%)住院,106(20%)患有支气管肺炎,73(14%),急性支气管炎和其他进一步从不同的疾病肺(表1)。
3.2。检测HMPV和其他呼吸道病毒的实时PCR
病毒被发现在研究的79名(15.2%)患者人口(表3)。三十阳性患者的两个孩子(占总数的46%的儿童参加这项研究)和47个成年人(占10%的成年组)。积极的患者,22(4.2%)被流感病毒感染,由腺病毒(副词),20例(3.8%)和16 RSV (3%)。HMPV检测21例(4.0%)。总共四个合并感染被确认:三个病毒与RSV与HMPV,副词,副词和一个合并感染(表3)。
所有HMPV-positive病例被发现在2007 - 2008赛季,虽然RSV和难以被发现从2006年到2008年。流感病毒出现在所有的三个赛季调查(表3)。呼吸道病毒的季节性分布如图期间检查1。HMPV检测到1月和2月的2007 - 2008赛季。
3.3。HMPV-Positive患者的特点
在21 HMPV-positive病人,12(57%)的孩子。当孩子们所有的门诊2 9成人住院病人承认胸部。因此,绝大多数(90%)的HMPV-infected ambulant医疗手术(表中患者治疗4)。患者主要的居民Assiut(80%),其次是居民governarates红海,故事,阿斯旺,卢克索(各5%)。
最明显临床症状与HMPV急性支气管炎(未配对的存在以及,与感染恶化),支气管哮喘(),毛细支气管炎()(表4)。急性支气管炎是成人最常见的诊断(44%),而毛细支气管炎是儿童最常见的诊断(50%)。此外,有一个两岁的病人(如/ 347)合并感染患者放置如/ 476和EG / 478遭受潜在的疾病双边肾盂积水和高血压,分别。
描述的发行量HMPV在埃及人口,患者按年龄分组:0 - 4年,为5 - 14岁,15 - 34年,35-60年,> 60岁(图2)。HMPV感染发生于所有年龄组,但患者最常见的儿童0到4年(确切概率法,)。
3.4。系统发育分析HMPV
局部放大的F蛋白基因进行了32 21 HMPV-positive患者的标本。除了病人如/ 459,部分融合基因序列其他所有患者均获得。序列获得24个标本的32 HMPV-positive标本(75%)。进行了系统发育分析在埃及HMPV 439元F基因的序列。目前,HMPV分化成子组A和B,每个都有两个遗传血统A1, A2, B1, B2,分别。所有的埃及HMPV序列集中在B组(图3)。24埃及序列3属于血统B1和21血统B2。因此,3例(15%)感染HMPV血统B1和17个病人(85%)感染HMPV的谱系B2。有埃及HMPV序列相同(蒙古包/ 3379/10,蒙古包/ 0562/08)或密切相关(蒙古包/ 0394/06,蒙古包/ 0259/08,蒙古包/ 0043/08)序列来自德国。此外,埃及序列集中在批几乎相同(血统B1)或相同(在天堂B2)序列。HMPV序列如/ 303 (NA) / 08年和EG / 513 (TS) / 08年的血统B2集群分别从其他埃及序列相同的血统。这些序列中发现患者居住在红海和卢克索。
3.5。分子分析HMPV
血统B1和B2之间核苷酸的身份是94.3% - -95.2%,而这是98.8% -100% -99.7%和94.3%在血统B1和B2,分别(表5)。血统B1和B2之间的序列内共享一种氨基酸97.2% - -98.6%的身份和血统B1和B2的99.3% -100%,-100%和97.2%。血统B2是最不同的。核苷酸序列相似性的分析显示超过氨基酸多样性是由其他研究[8,18,39从例如,荷兰,加拿大,或者美国,分别(表5)。
有五个氨基酸残基(233、286、296、312和348)常见的子群B菌株(表6)。单一氨基酸的变化出现在一个,两个,或几个序列。最高的氨基酸变化观察12序列的谱系B2(图4)。他们都表现出更多的独特的氨基酸替换残留223年和280年。此外,系统发育分析(图3)透露,这些集群分别和十二个序列密切相关序列从德国(蒙古包/ 3379/10和蒙古包/ 0513/07)。有趣的是,有两个埃及菌株(如/ 303 (NA) / 08年和EG / 513 (TS) / 08)包括一个额外的,但不同的氨基酸替换残留229(表6)。这些序列集群分别从其他埃及菌株(见上图)。
4所示。讨论
本研究进行估计的患病率HMPV社区获得性下呼吸道感染患者在上埃及,而更重要的是,给新见解循环HMPV菌株在埃及。
总体比例的HMPV感染上埃及在2005年和2008年之间的频率为17% 4%的儿童群体。在该地区更大的开罗(埃及)儿童的积极率是2006 - 2007年的6.4% (40]。儿童HMPV感染的另一项研究的收住曼苏拉,科2010年埃及东北部的一部分,显示一个积极的8% (41]。此外,我们的研究相比,儿童HMPV的感染率在阿拉伯半岛的同等频率水平。从2007年7月到2008年11月8.3%的发病率在沙特阿拉伯(42),而HMPV的频率是12.7%住院儿童的乔丹在2007年(43]。
而儿童HMPV频率为17%,感染率在我们研究成年人口的2%。在不同的研究中从埃及从2007年到2009年,积极观察率为13.6% (19],它的感染率高于成年人在这项研究。儿童感染率越高HMPV支持假设HMPV呼吸道感染的一个主要原因是在生命的最初几年44]。一般来说,HMPV频率全球变化在巴西在芬兰从3.5%到17.8% (45- - - - - -50]。,HMPV每年不同的频率在给定地区根据地理位置的不同,而且积极的速度改变了由于不同的样本收集方法和变化的计算方法(43,51]。
HMPV-infected患者的临床表现主要是轻微的上呼吸道疾病(52]。在我们的研究中,这反映的演讲HMPV-infected病人在门诊(90%)。然而,HMPV可以与下呼吸道的严重疾病。在本研究的一个主要临床诊断肺炎被发现在20%的感染HMPV病人。类似的发现在埃及的成年人在同一时期(2007 - 2009)和频率(17%的肺炎19]。HMPV儿童的常见临床诊断指出本研究毛细支气管炎,可支持的数据从埃及、美国、和巴西(23,41,53]。
旁边单HMPV感染,病毒HMPV不同的呼吸道病原体发生。合并感染率(0.8%)在这项研究很低。我们发现三个病毒合并感染(4.3%)和一个儿童在成人(0.2%)。关于HMPV,有一个合并感染婴儿HMPV和难以确定的原因。在不同的研究从埃及在2006 - 2007年进行的类似儿童(4.5%)合并感染率我们的观察结果40]。有趣的是,在中国的一项研究显示58%的合并感染频率HMPV-positive儿童(54]。病毒与HMPV常常被描述为儿童(55,56),主要是与年龄相关的历史不超过6个月(57]。
调查HMPV菌株的遗传变异在上埃及,439元的一段融合基因进行了分析。执行的系统发育分析既与德国菌株和其他出版参考株代表HMPV子组A和B .埃及序列集中在HMPV子群与优势的遗传谱系B2 B。而在上埃及HMPV B在2007 - 2008赛季,在约旦(阿拉伯半岛)两个子组在2007年被发现(43]。HMPV子群中发现93%的患者和28.6%的患者感染了子群B合并感染HMPV子组A和B中检测出21日4%43]。这些不同的环流模式在同一地区支持假设的发行量HMPV子组和类可能是一个地方的现象58]。
在这项研究中,高度的身份在F基因在大多数埃及序列核苷酸和氨基酸水平。符合这些发现,F基因是守恒的HMPV流传在欧洲、北美、和亚洲(8,18,31日,59- - - - - -61年)(表5)。F基因的氨基酸保护埃及压力高于核苷酸序列保护。这是支持的假设核苷酸多样性大于氨基酸之间的多样性HMPV F序列由于功能限制融合蛋白,防止激烈的氨基酸的变化。这可能导致缺乏定向抗原漂移地利亚与流感病毒(62年]。
我们的系统发育分析表明基因血统的cocirculation B1和B2在2007 - 2008赛季。HMPV血统B2在那个赛季主导。埃及HMPV菌株形成三个集群,两个在B1的B2分支,一个分支。关于氨基酸的替换,这是显示B2菌株比B1菌株变量。两名埃及HMPV(如/ 303 (NA) / 08年和EG / 513 (TS) / 08)显示一个独特的氨基酸替换F基因导致的分配这些菌株B2病毒的一个独立分支。这些病毒被发现在两个病人从红海和卢克索。有趣的是,埃及和德国HMPV菌株有很密切相关。HMPV的关系从遥远的区域是已知的,但原因尚不清楚。可以认为,人类行为影响HMPV多样性和进化的旅行。
5。结论
人类metapneumovirus是一个重要的呼吸道病毒病原体在埃及人口尤其是儿童患者。埃及HMPV隔离的系统发育分析表明,循环的病毒B组在2007 - 2008赛季血统B2的优势。我们的研究提供了新的见解的流行病学HMPV在埃及。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突的存在。
确认
本研究在经济上支持罗伯特·科赫研究所(RKI),柏林,德国。他们非常感谢成员国家流感中心的工作人员在RKI援助。最后,但并非最不重要的是,他们都想表达深深的谢意,埃及的患者参与了这项工作。