文摘

弯曲杆菌在人类物种造成的疾病。疾病的类型和结果取决于感染病原体的毒力菌株和宿主免疫状态。急性压力会严重危及宿主免疫力,增加对感染的易感性。去甲肾上腺素(NA)是一种应激激素。几项研究已经表明,它刺激经济增长,增加了生物的致病性,包括大肠杆菌和空肠弯曲杆菌。然而,NA对其他的影响弯曲杆菌物种是未知的。我们已经检查了NA对增长率的影响,能动性,T84上皮细胞入侵和殖民鸡的多样化弯曲杆菌物种。弯曲杆菌文化发展与NA减少滞后阶段,经济增长率增加,和最终的光学密度高于控制。的能动性弯曲杆菌也明显增加去甲肾上腺素的存在。的一些弯曲杆菌压力测试也显示增加入侵T84上皮细胞紧密连接的破坏,殖民鸡和一个增强的潜力。我们的结果表明,noradrenaline-induced增强的毒性弯曲杆菌会影响感染的结果。

1。介绍

弯曲杆菌物种是人类细菌性肠胃炎全球的主要原因。弯曲杆菌据估计,1%的人口感染每年在英国1,2]。弯曲杆菌常导致急性胃肠炎,也会引起严重疾病如格林-巴利和米勒费雪症候群,急性脊髓炎横、心内膜炎、肝炎、和心肌损伤在免疫功能低下的患者3- - - - - -6]。众所周知,一种疾病的结果是依赖于感染病原体的毒力菌株和宿主免疫状态(7]。急性压力会严重危及宿主免疫力,增加对感染的易感性。去甲肾上腺素(NA)是一种应激激素。它是人类的主要神经递质释放大量的肠神经系统(8]。通过胃肠道细菌病原体进入宿主可能接触到当地的高浓度的钠(9]。这样的接触可能导致强调宿主对感染的易感性增加。多项调查人员表明,钠会增加细菌的毒力和致病性通过增加增长(10,11),通过增强宿主组织附件(12- - - - - -16),或参与交叉王国信号(真核激素导致原核生物反应)的毒性基因转录激活(17- - - - - -19]。

到目前为止,研究去甲肾上腺素的影响弯曲杆菌很少的物种。去甲肾上腺素增加的增长弯曲杆菌股薄肌。增长率、运动性和入侵一个细胞系c .空肠应变11168年(20.暴露后增加去甲肾上腺素。是否去甲肾上腺素的毒性特性也有类似的作用弯曲杆菌物种,我们检查了NA对经济增长的影响和能动性弯曲杆菌spp。我们还研究了入侵培养T84上皮细胞及其紧密连接完整性和殖民三的潜力弯曲杆菌物种在鸡。

2。材料和方法

2.1。菌种、培养基

的弯曲杆菌压力是c .空肠81116年(21),c .空肠M1(环境隔离),c .杆菌1669(猪肾),c .胎儿胎儿10842(国家文化类型的集合,活动场所)(22),空肠c . 11168据国家反恐怖主义中心(应变)c .杆菌RM2228(从Oxoid)。菌株培养在哥伦比亚与5%柠檬酸盐琼脂补充血液在37°C (BA) 48小时在microaerobic的气氛中(一个环境氧浓度小于空气)(20.,23]。

microaerobic大气中创建与集市罐子喝醉酒的5 - 6%₂有限公司,6 - 7%₂H, 2 - 4%₂N和剩下的气氛₂所提供的,这是Anoxomat系统(发射诊断有限公司,肯特,英国)。提供的一些实验,microaerobic气氛MACS-MG 1000厌氧内阁(DW科学,皮普,英国)(MAC-Cabinet)有限公司为10%₂,5%的人啊₂,2% H₂,83% N₂。试剂,除非另有说明都是买从西格玛奥德里奇(英国多塞特郡普尔)。

三个基地媒体被用来准备实验细菌培养:Mueller-Hinton (MH)肉汤(英国Oxoid)和杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)(英国表达载体)补充2毫米谷氨酰胺和1%牛血清的边后卫(PAA实验室,德国)。

2.2。细菌生长化验

细菌增长进行了化验,没有NA。的菌株生长在英航接种集落形成单位(cfu) /毫升,到1.5毫升的DMEM有或没有160μM NA (20.]。文化在200年增长μL卷100 -无菌蜂窝板覆盖在37°C的48小时内微生物读者Bioscreen C (Labsystems,芬兰赫尔辛基)。光学密度(OD)在600海里每60分钟,从图上看,在固定相比较使用一个未配对以及。所有的实验都是在三个不同场合表现一式三份。

2.3。测量的能动性

活性测试,没有NA,进行运动性琼脂制成的0.4% (w / v)琼脂(Oxoid), 10 g / L胨(Oxoid), 5 g / L氯化钠(默克公司),3 g / L牛肉膏(Oxoid)和0.05 g / L(2、3、5三苯基四唑氯(σ)。NA-treated板块,160μM NA之前添加到运动性琼脂涌入中盘子。琼脂被允许冷却和盘子被刺伤在48小时内的细菌和孵化中心在37°C。测试是一式三份和直径的能动性光环使用成对的测定和比较以及。

2.4。入侵弯曲杆菌成T84细胞

庆大霉素阻力试验被用来衡量入侵弯曲杆菌细胞进入T84细胞。庆大霉素阻力测定是基于原则的庆大霉素真核细胞渗透的能力有限(24]。T84人类结肠恶性腺瘤细胞系来自欧洲的细胞培养(ECACC,健康保护局文化收集、索尔兹伯里、英国)(25,26]。细胞生长的单层膜和展览相邻细胞之间的紧密连接和桥粒,以防止细胞扩散。细胞种植在37°C公司5%₂调湿大气与10%胎牛血清DMEM补充(FCS)、青霉素和链霉素的浓度和0.4 200单位μg / mL,分别、谷酰胺。庆大霉素保护试验进行支流T84 12-well板细胞生长10天(康宁)37°C公司5%₂孵化器。弯曲杆菌物种在DMEM增长48 h + 10% FCS,有或没有160μM NA, microaerobic气氛。接种物被调整到0.1 OD在600 nm和单层感染感染复数(MOI) 25: 1和孵化为90分钟37°C公司5%₂孵化器。单层是用磷酸缓冲盐(PBS)和2毫升的庆大霉素,享年100岁μg / mL是补充道。在室温下盘子被孵化。2 h后,单层是水洗的PBS和2毫升1% Triton x - 100(美国圣路易斯丙烯酰胺)补充道。单层膜的混合5分钟,连续稀释,在BA板镀,孵化microaerobically 48 h和细菌细胞数。入侵检测的结果作为输入存活的细菌数量的百分比庆大霉素的杀菌作用(入侵百分比)。测试都是一式三份和入侵的比例使用成对比较以及。

2.5。去甲肾上腺素的影响在T84细胞的紧密连接的完整性

transwell模型被用来观察NA的能力的影响弯曲杆菌压力改变T84细胞的紧密连接的完整性。T84细胞种植在transwell插入直到transepithelial电阻(TER) 300Ω厘米以上²之前弯曲杆菌被接种到他们。自行确保NA对TER,没有影响井孵化了NA 48 h在每一个实验,而未受感染的控制。后被记录在感染前(T0)。顶端30井被感染μ10 L的细菌(MOI)或细菌+ 160μ米37°C的NA和孵化有限公司5%₂48 h。单层膜的完整性评估通过后48 h后读数下降(T48)和后由以下公式计算和比较了未配对以及: transwells被紧密连接蛋白occludin的染色。感染后,transwells固定在冰冷的甲醇在4°C 45分钟,在PBS洗了三次,permeabilised 1% Triton x - 100年在室温下10分钟。Transwells又洗了三次PBS和屏蔽5%的人类和山羊血清一小时在室温下。这是紧随其后的100年μ美国L鼠标反occludin的单克隆抗体(酶)的浓度1:200年,一夜之间在4°C的环境。第二天,洗了transwells PBS和100年μL山羊anti-mouse FITC二次共轭(美国阿拉巴马州南部生物技术)的浓度增加了1:100。这是在室温下培养一小时。transwells再洗,过滤器剪到幻灯片使用手术刀和安装一滴vectashield(向量实验室,彼得伯勒,美国)。用莱卡DMRA十字段的视图呈现与滨松单色荧光显微镜使用徕卡相机和数字化问氟软件和分析定量免疫荧光图像J软件上使用宏(27]。occludin染色的平均面积百分比(绿色)测量相比,十个视图和一个未配对以及。

2.6。去甲肾上腺素的影响治疗鸡的殖民化弯曲杆菌

四组的小鸡在四周的年龄被安置在学校临床兽医学的布里斯托尔大学的放养密度为12.6千克/米²为了满足英国内政部的要求。根据要求所有动物实验的动物(科学程序)法案1986年,当地的伦理审查委员会的批准。每组的鸟类是住在单独的房间在严格的条件下独立的生物安全。布里斯托尔大学动物服务单位生物安全协议之后。这包括使用防护服(工作服、手套和一次性引导袜子),在畜牧业和抽样。防护服装和鞋类改变和消毒剂使用引导浸在每个房间的入口和出口。鞋子是专门用在动物的房子,以前也没有被穿在外面。饲料和水随意。确保实验从天然感染鸟是自由的,粪便样本之前收集的挑战和考验弯曲杆菌spp。控制鸟类分别被安置和样本分析在每个尸检证实的缺失弯曲杆菌。

弯曲杆菌种虫害种植48 h在37°C而言不啻肉汤或包含160这一媒介μNA的M NA-treated细菌细胞。鸟~ 10⁶可行的细胞c .空肠M1,无论是在NA的存在与否,通过口服填喂法。48小时后感染后期执行和肝脏和盲收集细菌分析。盲肠的内容被变成一个普遍的管,与生理盐水稀释1在10,涡甚至暂停。他们连续稀释10⁻⁶和100年μ每个稀释的L镀在木炭头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂(CCDA)和孵化37°C microaerobic条件下48 h。菌落数和CFU /毫升的数量是由下列计算(平均殖民地/板/ 100)×1000×稀释⁻¹。肝脏样本单一化埃克塞特肉汤九卷,200年μL镀CCDA琼脂直接计数。6毫升的匀浆浓缩在额外的埃克塞特肉汤37°C孵化器。48小时后,顶层被擦洗到CCDA板和孵化microaerobic氛围弯曲杆菌识别。

3所示。结果

3.1。去甲肾上腺素的存在

弯曲杆菌在160年的物种生长μ米去甲肾上腺素为48小时37°C。以下结果代表三个技术和三个生物复制的平均值。光密度值在固定相的开始由一个未配对比较以及。所有弯曲杆菌菌株显示减少迟滞期和生长速率和最终的光学密度的增加去甲肾上腺素的存在(数字1(一)- - - - - -1 (f))。然而,减少滞后阶段,增长率在指数期要高得多空肠c . 81116(),c .空肠M1(),c .胎儿胎儿(),空肠c . 11168(在NA的存在。尽管有更高的减少滞后阶段,显著增加NA-treated最后的光学密度c .杆菌1669(图1 (d)),c .杆菌RM2228(图1 (e)),没有在对数期生长速率的变化。均值±SEM的三个实验使用一个未配对比较以及和意义值(值)如表所示1。

3.2。运动性的NA

能动性是用半固体的能动性琼脂通过测量距离感动48 h后细菌的存在与否NA。运动性光环的直径明显高于在NA的所有物种的存在弯曲杆菌(;图2)。

3.3。去甲肾上腺素对T84细胞的入侵的影响

入侵的效率弯曲杆菌使用庆大霉素保护物种用钠预处理进行了分析测定。在这个实验中,弯曲杆菌物种生长在48小时内去甲肾上腺素的存在,用于感染T84单层90分钟,细菌侵入到细胞的数量统计。4和5倍数量的c .空肠M1()(图3 (c))和c胎儿胎儿()(图3 (d)),分别已从细胞相比,去甲肾上腺素处理控制。然而,没有显著差异在NA-treated入侵细胞空肠c . 81116(图3(一个)),c .杆菌1669(图3 (b))相比治疗组。

3.4。NA对T84细胞的紧密连接的完整性

T84 transwells被感染细胞生长弯曲杆菌NA的存在与否和紧密连接的完整性测量通过阅读后在T0和T48小时。我们观察到当T84细胞后感染的减少弯曲杆菌。此外,添加时减少TER增加去甲肾上腺素是细菌。下降后高出至少16% ()的情况下空肠c M1,大肠,和c .胎儿胎儿(图4)。空肠c . 81116没有显示故障的增加紧密连接在去甲肾上腺素补充道。

紧密连接是occludin染色和显微图像分析测量面积百分比的染色蛋白质从十场的观点。在每个被未配对相比的百分比以及和测试都是一式三份。数据5(一个)- - - - - -5 (e)显示的结果从一个实验一式三份的代表。Occludin碎片和蜂窝结构描述紧密连接故障。48小时后,一个蜂窝结构在未感染T84单层膜(图5(一个)(一))和未感染T84层处理观察去甲肾上腺素(图5(一个)(B))的完整的连接。没有差别的面积百分比occludin控制T84 T84层和控制层之间的染色处理去甲肾上腺素(图5(C);)。我们观察到高分解T84层紧密连接的感染c .空肠M1(,图5 (c)(A)、(B)和(C)),c .杆菌(,图5 (d)(A)、(B)和(C)),c .胎儿胎儿(,图5 (e)(A)、(B)和(C))的存在NA相比T84细胞感染菌株没有去甲肾上腺素。然而,去甲肾上腺素并不影响结T84层感染时的完整性空肠c . 81116(图5 (b)(A)、(B)和(C);)。

3.5。NA治疗对鸡的殖民的影响弯曲杆菌

小鸡被给予c .空肠M1文化生长在NA的存在与否,48小时后;盲肠和肝脏样本检查的数量弯曲杆菌礼物。NA的存在不显著的增长影响的能力c .空肠M1殖民地的小鸡。因此,84%的盲鸟控制文化弯曲杆菌积极的96%给予NA-treated细胞。然而,NA-treated细胞c .空肠M1能更好地离开肠道和肝脏样本42%的鸟类给这些细菌吗弯曲杆菌积极,相比之下只有12%在鸟类控制文化(;图6)。细菌的CFU / g计算肝组织(肝脏看好浓缩是给定一个值为0.5)。从鸟类给NA-treated肝脏感染水平c .空肠354 CFU / g,但只有0.05 CFU / g (鸟类)的控制弯曲杆菌文化。

4所示。讨论

弯曲杆菌人类物种是胃肠炎的主要病原体。在食物链的理解他们的行为的有效控制是至关重要的粮食生产减少传播的风险。根等人注意到提高增长率,运动性和入侵空肠c . 11168接触后去甲肾上腺素(20.]。在目前的研究中,我们探索了NA的效果在体外和在活的有机体内在普遍的物种弯曲杆菌。相比之前的研究,调查了影响细菌NA预曝光后,我们研究这些影响在去甲肾上腺素的存在。铁是一个重要的营养和行为作为许多酶的辅因子参与重要的细胞过程,包括电子转移(28]。Enterochelin是大多数属含铁细胞由肠道细菌的螯合铁转铁蛋白(29日]。弯曲杆菌没有显示生产含铁细胞(30.),但可以利用enterochelin [30.]。去甲肾上腺素儿茶酚有一部分类似于enterochelin和建议隔离铁转铁蛋白/乳铁蛋白和供应对细菌生长31日,32]。去甲肾上腺素是促进铁的吸收空肠c . 11168在血清的存在20.]。在这项研究中,一个组织环境模拟低铁利用DMEM补充FCS为10%。在这个媒介,NA发现减少迟滞期,提高增长和最终的光学密度的大部分时间弯曲杆菌物种测试。毛石等。注意到增加10倍或更高的增长4/6 15/17革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌,当媒体补充了NA在铁限制条件31日]。去甲肾上腺素也增加的增长大肠杆菌,假单胞菌,和鼠疫(11]。大肠杆菌紧张,未能在SAPI +血清生长介质(基本培养基补充30%血清)10²CFU / mL,回应了50μM NA的人口密度达到最终10⁸CFU /毫升(29日]。精确的潜在增长时增加的机制弯曲杆菌对待NA是不清楚。毛石等人提出,血清DMEM培养基中(转铁蛋白)结合铁和NA提出促进转移的铁转铁蛋白和宿主铁扎蛋白质类似细菌,从而刺激微生物的增长iron-restricted环境(32]。

76 kda蛋白质、CfrA最近特征作为潜在iron-siderophore运输车c .空肠(33]。曾等。建议NA促进铁吸收空肠c . 11168通过siderophore-mediated过程通过enterochelin受体CfrA [34]。的空肠c . 81116基因组包含单个基因编码TonB和缺乏CfrA Cj0178外膜受体对铁的吸收35]。一个爆炸的搜索cfrA基因还透露其缺席c .空肠M1。这些实验的结果表明,所有物种的空肠弯曲杆菌去甲肾上腺素的存在增加了增长。这表明,空肠c . 81116和c .空肠M1可能有一个CfrA同系物,负责noradrenaline-mediated效果。曾庆红等人提出的系统发育树cfrA基因和将它分成两大组;空肠c . 11168在一组和在场吗空肠c . 81116在其他有93 - 98%的氨基酸相似性cfrA在两组之间(34]。综上所述,可以认为CfrA负责noradrenaline-mediated增长促进c .空肠在某些种类的CfrA的同系物c .空肠会引起同样的效果。

能动性是入侵的一个重要因素;突变体在鞭毛出口装置显示减少了殖民主义的小鸡,减少入侵Caco-2细胞(36]。游泳的特点c .空肠在粘性环境中可能的相互作用的一个重要因素和宿主上皮细胞(37]。卡等人发现~ 18%c .空肠细胞在低铁中能动的相比,在一个包含NA ~ 60%,表明神经递质可以增加运动型和潜在入侵细胞的数量,并允许更好的殖民化的肠20.]。motility-related基因fliA、fliY fliB,flhC时显著调节沙门氏菌被暴露在NA (18]。这项研究的结果也显示出更高的能动性在NA的存在(图2)。然而,目前还不清楚如果运动性基因调控在NA的存在弯曲杆菌种虫害,这应该是调查。

卡等人研究了入侵Caco-2细胞空肠c . 11168,发现至少有10倍后上皮细胞内细菌恢复2小时时使用NA (20.]。在这些实验中,当T84细胞被感染了NA进行预处理c .空肠M1和c .胎儿胎儿四到五倍,细菌接种的90分钟内(图中恢复过来3)。这些观察表明,预处理弯曲杆菌NA使他们更多的入侵,尽管一些应变的差异。空肠c . 81116和c .杆菌没有显示显著增加入侵T84细胞。这可能是因为90分钟的入侵时间不够长,以促进这些菌株或入侵,因为预处理与NA没有/对其毒性的影响很小。

c .空肠入侵造成的损失紧密连接障碍函数,它可以表示显著下降和occludin再分配从胞质间的交叉的平台38]。在这些实验中,当T84细胞被感染c .空肠M1,c .杆菌,c .胎儿胎儿(图4),减少后,增加钠添加时随着细菌(图4)。空肠c . 81116没有任何故障的增加紧密连接在NA补充道。卡等人发现,当一个Caco-2单层被感染空肠c . 11168100年增长μ米去甲肾上腺素,大约降低50%后在24小时内和occludin染色是支离破碎的,表明细胞之间的紧密连接的破坏。在这个工作中,当一个T84单层被感染弯曲杆菌物种和NA,大约下降100%和完整的紧密连接中断在48小时内表明毒性的增加弯曲杆菌去甲肾上腺素的存在。陈等人发现NA增加野生型的粘膜粘附大肠杆菌O157: H7菌株85 - 170在猪盲肠的粘膜13]。这种效应发生后30 - 90分钟内细菌接种,这表明NA能调节早期,nonintimate依从性导致入侵(13]。·莱特等人注意到的表达增加K99菌毛粘附产肠毒素的大肠杆菌在体外后接触NA (39]。这些观察表明,noradrenaline-mediated增加入侵可能是由于增加上皮细胞粘附的细菌。现在还不知道如果NA造成毒性基因的表达变化,有必要探索紧密连接的具体故障的原因。

弯曲杆菌鸡的污染是一个主要公共卫生问题40]。鸡殖民实验了解家禽殖民化的动力学,这可以帮助我们找到措施减少弯曲杆菌病对公众健康的风险。c .空肠M1显示更高的殖民化的鸟类NA-pretreated组。入侵肝脏发生更多的鸟类NA-pretreated组。此外,从正肝脏分离出细菌的数量也显著较高(图6)的毒性增加弯曲杆菌与去甲肾上腺素预处理。弯曲杆菌用钠预处理模拟了弯曲杆菌从强调动物棚,现在显示更致命的,入侵在更短的时期。

把这些观察得出的结论,运输鸡会导致压力和鸟儿弯曲杆菌从鸟类。的弯曲杆菌将暴露在NA,摆脱以更高的速度增长(由于增加),更致命的,入侵(由于更高的能动性和入侵)其他鸡造成更多的污染群和随后的尸体。这可能表明,羊群在农场级别负面原因成为后殖民运输和控股(41- - - - - -44]。所以采取措施,如减少运输时间,导致更少的压力鸟类中,运输可能会减少的传播和流行弯曲杆菌在尸体上。

最后,似乎NA的生长和毒性增加c .空肠,允许更好的殖民统治和侵略的禽流感主机和可能增加传播的风险弯曲杆菌给人类。因此,钠的存在,因此,急性应激带来的人类,可能允许大乘法和毒性增加弯曲杆菌在主机上。这可能导致的一系列症状弯曲杆菌感染,从无症状感染到严重的并发症,出现在不同的个体。跟压力荷尔蒙似乎有助于相关的毒性不同的属性弯曲杆菌物种。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢英国环境、食品和农村事务部(DEFRA)和英格兰高等教育拨款委员会(HEFCE)支持和资助这项工作通过VTRI计划。