相关微生物的DGGE鉴定包柔氏螺旋体burgdorferi理智Lato——或者红孢子虫属phagocytophilum来华的Ixodes蓖麻挪威西北部的蜱虫

摘要

蜱类在其生命周期的自然部分获得了广泛的微生物。细菌、病毒和原生动物可在取食和自由生活阶段传播给蜱类。DGGE分析是一种分子方法，用于描述与蜱类相关的微生物种群，并展示蜱类传播的微生物的复杂性和多样性目前的研究共分析了120个组织即蓖麻扁虱被分成三个大小相等的群体。我们发现b . burgdorferi被链球菌感染的蜱呈现出由细菌组成的模式假单胞菌spp。(67.5%),芽孢杆菌spp（50%），以及Sphingomonasspp（77.5%），而嗜吞噬细胞-受感染的蜱与感染有关假单胞菌spp（82.5%）和Sphingomonasspp（57.5%）。所有剖面都有一个或多个假单胞菌种存在，和线粒体内共生念珠菌Midichloria mitochondrii存在于25%以上的样本中。统计分析表明，两组间的微生物群落没有显著差异，且不能通过特定的微生物种群来描述。

1.介绍

复杂的微生物群落存在于大多数自然生态系统中，由多种微生物组成[1.]蜱有可能在其生命周期的各个阶段获得微生物，并且它们与大量的细菌、病毒和原生动物有关[2.]这些微生物中的一些是在取食不同宿主时获得的病原体，而另一些则与蜱在自由生活阶段所处的环境有关[2.,3.].蜱媒人畜共患病可导致人类和动物的严重和致命感染[4.]．许多蜱媒病原体，如细菌、病毒和原生动物，与莱姆病(LD)、无形体病(前埃尔立克体病)、土拉菌血症、巴贝西虫病和蜱媒脑炎病毒(TBEV)等疾病有关[5.]．

包柔氏螺旋体burgdorferi感官由一组螺旋体在全世界引起LD的物种，特别是三种螺旋体基因种-包柔氏螺旋体burgdorferi美国这篇,包柔氏螺旋体afzelii,包柔氏螺旋体garinii-与欧洲的人类疾病有关[6.–8.].在挪威蜱类中发现了第四个基因物种：包柔氏螺旋体valaisiana[9]．莱姆病在挪威沿海地区的流行率各不相同，从挪威南部的约25%到挪威西北部的14-18% [9–11]．

红孢子虫属phagocytophilum引起蜱传立克次体感染，即无形体病[12,13]．人类无形体病在挪威不是一种广泛传播的疾病[14]，但由嗜吞噬细胞在牲畜中很常见，并对牛羊造成严重后果[15]。挪威尚未报告涉及其他蜱传疾病的具体病例数，如图拉血症、巴贝斯病和蜱传脑炎病毒（TBEV）[16]此外，蜱能携带多种病原体，可引起多微生物感染[17]．共同感染微生物之间的协同效应可能有利于致病微生物并改变其发病机制[18]．

变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种广泛的分子方法，已被用于测定蜱的微生物含量[19]．该方法是基于16S rDNA片段的气相色谱钳宽范围扩增。扩增片段在梯度聚丙烯酰胺凝胶中分离，缓冲液加热到60°C。16S rDNA片段在通过聚丙烯酰胺凝胶迁移时缓慢熔化，熔化速度与序列组成有关。这使得区分物种成为可能，即使所有16S rDNA片段都是用相同的引物获得的[20.]。DGGE分析表明，在分析时可以识别出许多细菌和内共生体即蓖麻滴答声[2.,19]．

这项研究的目的是分析来自不同地区的微生物群落即蓖麻蜱，并比较两者感染的蜱相关的社区b . burgdorferi理智lato或嗜吞噬细胞我们构建了两篇论文，以证明各组间DGGE图谱是否存在显著差异，以及各组DGGE图谱中微生物的存在是否存在显著差异。本研究将表明ip之间存在b . burgdorferi理智lato或嗜吞噬细胞有特定的微生物存在。微生物的交流和微生物之间的相互作用对单个有机体的影响是不同的，这使得在研究蜱媒病原体时，对整个微生物群落的了解是有用的[21]．

2.材料和方法

2．1．蜱DNA的分离

即蓖麻2011年5月至10月期间，在挪威Møre和Romsdal县的自治市Skodje的林地收集了蜱。所有的蜱虫都是用一块法兰绒布在植物间拖来的。个体蜱(38只成年雌蜱，442只若虫)被放入无菌试管中，并标明采集日期。由于成蜱数量少，本研究没有区分成蜱和若虫。单独的蜱在70%乙醇中洗涤，单独放置在无菌双蒸馏H无菌管中_2.O，并均质使用5毫米钢珠和Qiagen TissueLyser (Qiagen GmbH, Germany)。根据制造商的协议，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen GmbH, Germany)从每个样本中提取DNA。

2．2.检测b . burgdorferi理智Lato和嗜吞噬细胞实时PCR（qPCR）感染

采用特异性引物对所有蜱标本进行qPCR分析b . burgdorferi理智lato或嗜吞噬细胞以确定蜱虫是否被这两种病原体感染表中列出了所有引物和探针1..在反应体积为15的条件下进行qPCR μL使用7.5 μL of TaqMan (no UNG) Universal Master Mix (Applied Biosystems)。最佳反应条件为:引物浓度为500 nM，探针浓度为100 nMμ在7300实时PCR系统（Applied Biosystems）中进行1个变性周期（10 最低温度为95℃，然后进行45次变性循环（15 秒，95°C）和退火/延伸（1 最低温度（60°C）。

2．3.16S rDNA扩增和变性梯度凝胶电泳(DGGE)

用引物341fGC和518r进行PCR扩增细菌16S rDNA片段(见表)1.)按编号大肠杆菌16srdna序列[19].反应在30分钟内进行 μ1卷共15页 μ红色“y”金PCR主混合物L（德国Eurogentec），0.12 μ每种底漆的L（100 μ9.76米),μL (ddH_2.啊,和5μL的模板DNA。的放大过程修改Schabereiter-Gurtner等人在2720年的一次热循环执行(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德)与1的循环变性(10分钟,95°C)其次是32周期的变性(1分钟,95°C),退火(1分钟,55°C)和扩展(1分钟,72°C)连同最后一个扩展周期(10分钟,72°C) [2.,19]．扩增的16S rDNA片段用聚丙烯酰胺凝胶进行分离，聚丙烯酰胺凝胶的线性变性梯度从30%到60%，其中100%变性剂含有7 M尿素和40%甲酰胺。每孔用0.5x三乙酸乙二胺四乙酸酯缓冲液(TAE缓冲液)清洗，以清除铸造残留物μ将每个扩增子的L放入一个孔中。变性梯度凝胶电泳在V20 CDC双垂直单元系统(Scie-Plas, Gainsborough Warwickshire, UK)中进行，温度为60℃/20 V，时间为10分钟，然后在0.5x TAE中，温度为60℃/60 V，时间为16小时，如前面所述[2.]．

2.4.测序和鉴定

从凝胶中剪出DGGE条带的16S rDNA片段，放入含有20个DGGE条带的试管中μL (ddH_2.O;将这些片段作为模板，用341f/518r引物进行PCR(见表1)1.)，反应程序与原始扩增相同。根据生产商的方案，使用ExoSAP-IT (Affymetrix, Santa Clara, USA)进行两步纯化扩增产物。测序反应在10分钟内进行μL卷包含1个μL大染料终结者3.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, USA)， 1μ5倍测序缓冲液(Applied Biosystems, Carlsbad, USA)， 0.32μ一层341f底漆（10 μ4.68米),μL (ddH_2.O、 三, μL的模板DNA。在2720热循环器(Applied Biosystems, Carlsbad, USA)中进行扩增，1个变性循环(6分钟，96℃)，随后25个变性循环(10秒，96℃)，退火(5秒，50℃)，延伸(4分钟，60℃)。接下来,10μL (ddH_2.如前所述，测序反应完成后，在每口井中加入O [2.]．使用BLAST将DGGE分析的序列与GenBank数据库中已知细菌物种的序列进行比较，从而确定每个序列的来源[24]．BLAST搜索鉴定率小于95%的序列由RDP分类器进行分类[25]．

2.5. 统计分析

统计分析用于研究各组内鉴定的微生物选择与特定致病菌之间的统计一致性。使用IBM SPSS Statistics 20（SPSS Inc.，美国芝加哥）进行单向方差分析，计算各组间方差的统计比较。显著性水平设置为0.05。进行分析，以测试在试验中的微生物之间是否存在显著差异包柔氏螺旋体burgdorferi理智lato——或者红孢子虫属phagocytophilum-感染即蓖麻蜱虫。此外，还确定了DGGE谱中微生物的存在是否存在显著差异包柔氏螺旋体burgdorferi理智lato——或者嗜吞噬细胞无浆体-受感染的即蓖麻蜱虫。采用统计学方法分析G1组、G2组和G3组微生物含量之间的差异。我们绘制了一个散点图来研究三组之间的细菌种类分布。

3.结果

3.1.qPCR分析

总计480即蓖麻对蜱进行qPCR鉴定b . burgdorferi理智lato——或者嗜吞噬细胞来华的蜱虫。结果显示，87只蜱为阳性b . burgdorferi有47只蜱虫呈阳性嗜吞噬细胞。在阳性样本中，有6个样本对两种药物均呈阳性b . burgdorferi理智lato和嗜吞噬细胞．在进一步的分析中，未包括合并感染的蜱。根据qPCR分析结果，指定三个大小相等的组进行进一步分析。的数量嗜吞噬细胞-阳性样本将每组样本数量限制在40个。基于这一限制，40b . burgdorferi感觉阳性蜱分为G1组，40只嗜吞噬细胞-阳性蜱虫包括G2组，40只蜱虫对这两组均为阴性b . burgdorferi理智lato或嗜吞噬细胞由G3组。

3.2. DGGE与序列识别

对3组(G1-G3)的120只蜱进行扩增和DGGE分析，得到120条DGGE图谱，每只蜱1条。数字1（a）图中为G1组的DGGE谱图(1-12)1（b）图中为G2组的DGGE谱图(1-17)，如图所示1（c）图中为从G3组获得的单个DGGE图谱(1-15)。

共切除94条不同迁移率的条带，重新扩增，并进行序列鉴定。除了b . burgdorferi理智lato或嗜吞噬细胞，测序的菌株包括28种不同的细菌种类。在94个序列中，一些被鉴定为同一物种。BLAST搜索和RDP分类的结果显示在Table中2.这个即蓖麻18S rDNA区域也在取样材料中鉴定。

各种各样的假单胞菌所有样本中均存在物种，无论是哪一组假单胞菌，线粒体内共生体Candidatus Midichloria mitochondrii和Sphingomonas在G1组和G2组的大量蜱中都存在spp。在G1组中，50%的DGGE图谱包含芽孢杆菌仅在这一组中出现。

3.3.统计分析

通过DGGE分析获得的数据进行统计分析，计算所有三组的微生物含量之间的方差。

单因素方差分析（表1）3.)给出计算方差比()为0.630，显著性临界值()是1.8。说明G1、G2、G3组间微生物含量差异不显著。

结果表明，经鉴定的微生物间无显著差异b . burgdorferis.l.-infected蜱虫,嗜吞噬细胞-感染的蜱和未感染这两种病原体的蜱2.)进一步证明了所有三个组的微生物内容物之间的相似性，并且在整个图中，每个组的细菌分布是相同的。

对各组内的个体蜱的分布进行统计比较，以计算G1、G2和G3组内微生物的存在是否存在显著差异。各组内计算的差异给出了一个方差比() 6.905 ()这表明G1组、G2组和G3组内的微生物含量存在显著差异，并且感染这三组的蜱虫b . burgdorferi理智lato或嗜吞噬细胞不能用特定的DGGE谱图来描述。

4.讨论

即蓖麻蜱通过取食不同的宿主和在其自然栖息地内接触微生物[4.,26].广泛的细菌、原生动物和具有不同致病特征的病毒被描述为蜱媒人畜共患病[3.,27]．DGGE分析是一种基于分子的工具，已被用于描述除已知致病微生物外与蜱相关的微生物群落[2.,19]这里，DGGE图谱用于描述该地区的微生物种群b . burgdorferi理智lato - - -嗜吞噬细胞来华的蜱虫。

所有DGGE谱线都有一致的条带即蓖麻18 s rDNA地区。真核生物的18S区与细菌的16S区同源，因此18S片段可以扩增[28]。通过DGGE分析鉴定的大多数微生物是来源于环境样品的微生物。假单胞菌putida,螺原体属。，Roseomonas属。，甲基卵丘属。，Methylobacterium属。，比林欧文氏菌,Raoultella以及肠杆菌属在G1组和Roseomonas属。，Methylobacterium属。，比林欧文氏菌,肠杆菌科,寡养单胞菌属。，威廉斯属。，未培养分枝杆菌以及Luteibacter rhizovicinus出现G2组DGGE谱。环境样本中常见的细菌已在几项与蜱有关的微生物的研究中得到证实[2.,19,29–31]，而共生微生物可能在宿主的生存中发挥重要作用[32–34]．

几株假单胞菌在我们的研究中被确定，以及假单胞菌经常在其他有关蜱类微生物群落的研究中发现[2.,19,30.,31]．至少有一种假单胞菌都被标记出来了，这说明假单胞菌可能与蜱有共生关系。蜱属的成员假单胞菌是多种多样的细菌，有广泛的自然生境[35]，并且已经证明p .荧光，该研究中发现的菌株之一，很容易形成表面生物膜[36]．p .荧光在以前的研究中也与蜱有关[2.,19]．生物膜是附着在表面的微生物群落，位于生物膜基质中的微生物很难去除[36].细菌与宿主通过生物膜基质的相互作用对细菌和宿主都有好处，并能提高宿主的生存能力[21,32–34]Carpi等人的一项研究鉴定了土壤样本中常见的细菌，尽管进行了严格的清洗程序，并表明这些细菌是蜱类外骨骼的一部分[37]．外骨骼中的生物膜基质或微生物可能解释了为什么在这项研究中，蜱虫样本中可以识别出各种环境相关的细菌。

除了已知的蜱媒病原体b . burgdorferi理智lato或嗜吞噬细胞，没有检测到已知的蜱媒病原体。的研究即蓖麻来自欧洲的蜱类已经检测到几种致病物种，如立克次体,巴贝西虫,巴尔通体,米库新埃立克体假丝酵母[38–41].一会儿立克次体种虫害和立克次体在之前的一项研究中发现了这种细菌即蓖麻来自挪威西北部的蜱[2.]，这些在本研究中未被确定螺旋体基因种类在14.8%和18.7%之间变化[11]，但尚未对挪威西北部动物群中大多数蜱传播病原体的流行情况进行检查。

统计分析进一步描述各组微生物群落之间的差异。散点图说明了细菌种类的分散和微生物群落之间的相似性。经单因素方差分析，G1、G2、G3检测到的微生物差异无统计学意义。这表明蜱虫体内微生物的存在或缺失似乎与某种特定的病原体无关。

G1组由即蓖麻蜱类感染的螺旋体b . burgdorferi莱姆病病原体莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病莱姆病，假单胞菌仕达屋优先计划．,芽孢杆菌仕达屋优先计划．,和Sphingomonas在大多数DGGE剖面中都存在这种细菌。假单胞菌仕达屋优先计划．和芽孢杆菌仕达屋优先计划．以前从培养菌群中鉴定的即蓖麻滴答声[31]．G1组的两个最常见的图谱包含了细菌的组合假单胞菌种虫害和芽孢杆菌种虫害或假单胞菌种虫害和SphingomonasG1内统计方差的计算表明，这一组不能用一种特定的微生物谱来描述。

G2组由即蓖麻蜱嗜吞噬细胞．在一次嗜吞噬细胞专性细胞内感染嗜吞噬细胞细菌以髓细胞或粒细胞为目标进行繁殖。细菌分裂，细胞裂解释放出可以感染其他细胞的细菌[13]．几个假单胞菌种类及SphingomonasSpp.属于重复出现的细菌类型，构成了鉴定的大多数微生物嗜吞噬细胞-感染的蜱。G2组中两种最常见的蜱体含有细菌的组合假单胞菌种虫害和荧光假单胞菌或假单胞菌种虫害和Sphingomonas计算G2组内的统计方差表明，G2组内的分布差异显著，没有特定的分布可以用来描述被感染的蜱嗜吞噬细胞．

G3组包括即蓖麻没有被任何一种病毒感染的蜱b . burgdorferi理智lato或嗜吞噬细胞.该组的DGGE图谱包含一种或多种假单胞菌．除了内共生体Candidatus Midichloria mitochondrii还有乐队即蓖麻18S rDNA区域，每个图谱通常包含1-2种细菌。Sphingomonas属。，恶臭假单胞菌，甲基杆菌以及洋葱属。，比林欧文氏菌,威廉斯和未培养的分枝杆菌属。，分枝杆菌,Beijerinckiaceae构成G3组中鉴定的细菌。G3组中最常见的特征是两种不同细菌的组合假单胞菌物种。统计上，不存在可用于描述G3组的特定微生物特征。微生物群落内物种计算的方差比证实，在每个组内均无法识别特定特征。

DGGE分析是一个有用的工具，可以证明与疾病相关的微生物种群b . burgdorferi理智lato - - -嗜吞噬细胞来华的蜱虫。G1-G3组不能以特定的微生物种群来描述，统计分析证实不同组的微生物多样性没有显著差异。这些发现表明一种特定的病原体，例如b . burgdorferi理智lato和嗜吞噬细胞，不影响蜱中微生物含量的多样性。与蜱相关的微生物的随机模式可能表明微生物是相互独立获得的。尤其是与土壤和环境样本相关的细菌假单胞菌种，存在于所有样本中。患病率很高假单胞菌可能表明细菌和载体宿主之间的共生关系。本研究还概述了与之相关的微生物种群即蓖麻蜱类和蜱类具有多样的微生物含量，因此可以更好地了解蜱类相关微生物含量的选择压力。

利益冲突

没有什么利益冲突需要宣布。

承认

作者要感谢Synnøve T.Broum协助收集蜱虫。

工具书类

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