在体外生物活性植物提取物对甲氧西林耐药的抗菌和耐药性修饰作用葡萄球菌epidermidis

抽象的

菊科和唇形科植物的粗提物和精油鼠尾草officinalis和Salvia sclarea研究了其抗菌活性和抗生素抗性改性活性。采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法测定了三种细菌的抗菌效果鼠尾草通过评估260 nm吸收材料的泄漏，我们检测了提取物，即精油对细胞质膜破坏的影响。的评价在体外在分数抑制浓度（FIC）指数方面描述的植物提取物和牛奶蛋白之间的相互作用揭示了植物提取物的协同或添加剂效应，并明确协同效应精油来自鼠尾草officinalis对甲氧西林有耐药性的苯唑西林葡萄球菌epidermidis．

1.介绍

葡萄球菌epidermidis属于凝血酶阴性葡萄球菌（CIL）组。它是非价值的微生物，构成了人类正常皮肤和粘膜微生物的主要组成部分[1］.然而，近年来，这些细菌已成为一种机会致病菌，菌血症的重要病原体，以及院内感染的主要原因，特别是与留置医疗器械(如假体关节和心脏瓣膜)和免疫系统受损的个体(如，癌症病人及新生儿)[2，3.］.葡萄球菌epidermidis发病机制依赖于在前面提到的医疗设备表面粘附和形成生物膜的能力[4］.

葡萄球菌被认为对几乎所有已开发的抗菌药物都自然敏感，但同时又有迅速产生耐药性的声誉[5］.缺点,尤其是s . epidermidis通常具有多重耐药性，包括对甲氧西林的耐药性。医院分离菌株对甲氧西林的耐药性为75-90%美国epidermidis，这比相应的比率还要高金黄色葡萄球菌(40 - 60%)6］.除了甲氧西林耐药性，美国epidermidis菌株已经获得了对其他几种抗生素的抵抗力。大多数抗生素抗性基因是质粒编码的，并且更常见于甲氧西林抗性菌株[7］.这些事实加上无处不在的美国epidermidis作为人类共生微生物，使该细菌成为抗生素抗性基因的最佳载体和库，并将遗传元素传递给致病菌。

随着微生物耐药性的日益增长，需要开发和研究新的抗菌药物或耐药调节剂。药用植物衍生化合物增加了人们对寻找替代抗菌剂的广泛兴趣，因为人们认为它们是安全的，并且在民间医学中用于治疗传染病有很长的历史[8］.高等植物的天然产物可能具有新的抗菌药物来源，可能具有新的作用机制[9，10］.它们有效地治疗传染病，同时缓解了通常与常规抗微生物相关相关的许多副作用[11］.对它们进行系统和系统的筛选可能会发现新的活性化合物[12］.

逆转多药耐药性可能是减轻耐药性传播的另一种尝试。在应对细菌耐药性的方法中，有一个很有前景的方法是，除了使用不同种类的抗菌药物外，还应用抗生素和非抗生素之间的协同活性。许多植物具有直接的抗菌活性，但也具有抗性修饰/调节活性[13］.抗性改性剂可以抑制多药电阻机制。植物提取物增强抗生素的这种能力尚未明确。

一些菊科和唇形科植物具有适当的药用特性，这主要是基于精油的存在[14］.许多物种的抗菌活性鼠尾草植物对几十年来认识到几十年来，已归因于1,8-肺的存在，β-苏约酮、樟脑、冰片和对伞花烃等[15］.从不同的植物精油中提取的萜类化合物均具有抗菌活性，其中一些萜类化合物可作为抗性调节剂。

研究人员研究了各种植物对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株的抗菌特性，包括葡萄球菌金黄色葡萄球菌［16- - - - - -18]但只有少数关于抗菌活性的报道葡萄球菌epidermidis．此外，植物提取物或精油与抗甲氧西林的抗生素之间的相互作用美国epidermidis之前没有记录。

本研究的主要目的是评估在体外菊科和唇形科植物提取物对金黄色葡萄球菌临床分离株的抗菌活性美国epidermidis并评估抗生素和植物提取物或精油在应对甲氧西林耐药性方面的相互作用。

2.材料和方法

2．1．植物提取物

本研究从菊科植物(黄菊花、金花、母母花、银叶菊、和Tanacetum光)和唇形科(Salvia Fruticosa，Salvia Officinalis，和Salvia sclarea)家庭被使用。在最佳生长发育阶段收获植株。精油的鼠尾草officinalis和Salvia sclarea是根据欧洲药典制备的[19］.将空气干燥的空中零件受到4小时的氢化物，并在正己烷中稀释分离的油并用无水硫酸钠干燥。

2.2。细菌菌株

耐甲氧西林和methicillin-susceptible葡萄球菌epidermidis菌株是从斯洛伐克共和国布拉迪斯拉发老城大学教学医院血液培养阳性的患者中分离出来的，并由斯洛伐克共和国布拉迪斯拉发Comenius大学医学院微生物研究所Slobodníková博士好心提供。菌株标记为Sep1至Sep7。所有菌株常规在脑-心灌注培养基(Biomark，印度)中有氧培养，37℃摇瓶24小时。

2．3.纸片扩散试验

通过盘式扩散测定对穆勒 - 亨顿琼脂（印度HIMEDIA，印度）测试植物提取物进行抗微生物活性。悬浮的测试细菌（0.1ml 10⁸cells/mL)铺于固体培养基板上。无菌纸盘(直径6毫米)，其中浸渍10μ.L，置于培养板上。这些薄片在4°C维持2小时后，在37°C孵育24小时，产生的抑制区直径以毫米计。

２.４.最低抑菌浓度(MIC)的测定

根据CLSI(2011)指南，采用96孔微量滴定板微量肉汤稀释法测定植物提取物的MIC值[20.］.将植物提取物在微孔水中进行旋流，得到连续两倍稀释的植物提取物。在印度Himedia的Mueller-Hinton肉汤中制备微生物接种物，将浊度调整到0.5麦克法兰，并稀释至井中最终浊度约为1 × 10⁶CFU /毫升。二十μ.植物提取物溶液的L和180μ.将L的细菌接种物放入微量滴定板孔中，37℃孵育24 h。使用Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific, Finland)检测细菌的生长与浊度(600 nm光密度(OD))的关系。MIC的定义是完全抑制微生物生长的最低浓度的抗菌剂。

2．5．聚合酶链反应对mec一个基因

检测的mec一个基因在葡萄球菌epidermidis采用聚合酶链反应(PCR)扩增。细胞悬浮在含有1 M Tris HCl、5 M NaCl和0.1 M EDTA的裂解缓冲液中，在95°C孵育10分钟。孵育后，悬浮液在23 000 ×g离心5分钟。上清液作为PCR的模板。PCR检测方法如Zhang等所述[21]使用底漆MeCa147-F（GTGAAGATATACAAGTGATT）和MECA147-F（GTGAAGATATACAAGTGATT）。在含有50mg / ml ETBR的1.5％琼脂糖凝胶上电泳后，使用UV-Transilluminer可视化最终的PCR产物。

2.6。棋盘法

初始接种物的制备如上所述。96孔微滴度板接种试验生物和两种抗菌剂-抗生素和植物提取物连续稀释。每口井都含有独特的植物提取物/抗生素浓度组合。37℃孵育24 h。用Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific, Finland)在600 nm处记录板的吸光度。

通过计算部分抑菌浓度(FIC)指数来测定抗菌药物之间的相互作用。FIC的定义如下:A物质组合时的MIC / A物质单独时的MIC + B物质组合时的MIC / B物质单独时的MIC。FIC指数解释为FIC < 0.5 -协同效应、0.5 < FIC < 1 -相加效应、1 < FIC < 4 -无关效应、FIC > 4.0 -拮抗效应[22］.

2.7。时间杀死

植物提取物与苯唑西林联合抗甲氧西林的效果美国epidermidis采用时间抑制法进行评价。所有抗菌药物单独或联合使用均对6株耐甲氧西林菌株进行了测试美国epidermidis．提取液与苯唑西林单独或联合使用时的浓度为麦克风。在含营养肉汤的试管中，接种密度约为(10⁷CFU/mL)。试管连续摇晃并在37°C孵育。分别在0、6、10和24 h获得样品。在每个样品时间，取等价物并连续稀释。将50微升未稀释和稀释的样品放在营养琼脂上。37℃孵育24 h。孵育后，对菌落数进行枚举，并确定每个试验和对照的平均计数(CFU/mL)，并以对数表示₁₀．抗菌药物联合使用的效果解释如下:协同作用定义为降低≥2 log₁₀与活性最高的单一药剂相比，联合用药24 h后菌落计数的CFU/mL。可加性或无差异定义为<2的对数₁₀与最有效的单一药物相比，联合用药24小时后平均活菌数的CFU/mL变化。拮抗作用≥2 log₁₀与单独使用最有效的药剂相比，联合使用24 h后菌落计数的CFU/mL增加[23］.

2.8。损耗260纳米吸收材料

利用Devi等人的技术测定了细菌释放的260 nm吸收材料的损耗[24］.过夜培养制备细菌悬液(OD)₆₀₀2.0)。细胞在400 ×g离心15分钟后从培养基中分离，在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次，并在相同的缓冲液中重悬。在细胞悬浮液中加入不同浓度的植物提取物10% ~ 0.03% (v/v)。以环丙沙星(500 mg/L)和不含植物提取物的细胞悬液为对照。37℃摇瓶孵育60 min。实验0和60分钟的样品在13 400 ×g离心15分钟。在260 nm分光光度计(NanoDrop, Thermoscientific, USA)下测量每个时间点和处理剂的光密度。

3.结果与讨论

3．1.抗菌效果

六株耐甲氧西林临床分离株葡萄球菌epidermidis(Sep1-Sep6)和一个对甲氧西林敏感的菌株(Sep7)评价选定的植物提取物可能的抗葡萄球菌活性。我们的结果，采用圆盘扩散法和微量肉汤稀释法，在表中以平均值表示1和2．根据抑菌圈直径，三种提取物抑菌效果最好鼠尾草(抑菌带为12.4 ~ 12.7 mm)洋甘菊recutita。其余部分的摘录菊科家族植物的抑制带较小，为7.0 ~ 10.4 mm。耐甲氧西林菌株与感甲氧西林菌株的抑菌区无差异。

通过测定最小抑菌浓度得到了更准确的抗菌性能数据，微量稀释法的结果证实了之前的结果。摘录S. Officinalis和S. Sclarea在1.25% ~ 10% (v/v)范围内，抑菌性能优于菊科结果表明，其中大部分的MIC为10%或10%以上(v/v)。

抑菌作用的粗提物，即不同种类的精油鼠尾草许多作者对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长进行了评价。其中有些证实了不同的抑菌作用鼠尾草葡萄球菌亦属[25，26]，而另一些则表示摘录自鼠尾草officinalis［27]，美国divinorum［28，其他的对生长没有影响葡萄球菌金黄色葡萄球菌和美国epidermidis。但是精油的化合物S. Sclarea-枞烷二萜是细菌的培养金黄色葡萄球菌和美国epidermidis压力(29］.

3．2.损耗260纳米吸收材料

我们将对植物提取物抑菌作用的研究扩展到对其可能机制的评价。精油中萜类化合物是被试植物的主要成分，其作用机制尚不完全清楚，但推测这些亲脂成分对膜的扰动参与了抑菌作用。细胞质物质明显渗漏被认为表明细胞质膜受到严重和不可逆的损害[30.，31]，通常通过吸收波长为260纳米(核酸)的胞内物质的损失来量化。用植物提取物处理后，OD值从0.3%增加到5% (v/v)₂₆₀所有供试菌株的滤液含量均有所增加，其中5%处理60 min后增加最显著Salvia sclarea和5%鼠尾草officinalis(图1）.同时OD₂₆₀无提取物对照和环丙沙星对照无明显变化。这些结果表明，被测植物粗提物对细胞质膜有损伤作用，并引起细胞内成分的损失。为了证实这一效应是基于精油的性质的假设，如图2我们比较了植物粗提物和同一植物精油存在时细胞内化合物的泄漏情况Salvia sclarea．在较低的浓度下，精油的作用显著增强。

据报道，一些抗菌剂引起大的膜损伤并引起整个细胞的裂解[32］.在这些化合物中还可以发现牛至、红木和百里香的精油[33]，α蒎烯(34]、柠檬草油[35和茶树油白千层属灌木alternifolia［36］.

3．3.植物提取物与苯唑西林的相互作用

六种临床菌株的耐药性美国epidermidis从表中可以明显看出2．根据Eucast 2013，苯唑西林对CoNS耐药性的断点[37的MIC >为0.25 mg/L。耐药菌株(Sep1-Sep6)对苯唑西林的MIC为16 ~ 256 mg/L，对甲氧西林敏感菌株Sep7的MIC为0.125 mg/L。通过基因检测证实了Sep1-Sep6菌株对甲氧西林的耐药mec一个(图3.）.聚合酶链反应的mec通过青霉素结合蛋白2a（Pbp2a）对甲氧西林抗性的基因进行了很好的建立，并且被认为是与表型方法相比检测甲氧西林抗性的“金标准”[38- - - - - -40］.

的评价在体外以部分抑制浓度(FIC)指标描述了植物提取物与苯唑西林的相互作用。所有使用的植物提取物和苯唑西林对耐甲氧西林菌株的ficics美国epidermidisSEP6显示在表中3.．这三者的摘录鼠尾草种属与苯唑西林联用具有协同效应。从所有菊科只有从洋甘菊recutita与苯唑西林有协同作用，其余各提取物均有添加作用。人们发现鼠尾草officinalis降低了氨基糖苷类对万古霉素耐药的最低抑制浓度eNtroCocci.然后分离出有效化合物。Carnosol，活性化合物表现出较弱的抑菌活性，大大降低了各种氨基糖苷类化合物的mic值[41］.还原的确切机理β- 天然抗微生物的抗酰胺（甲氧西林）耐药性未知，但可能是由于抗性细菌的一些结构变化。Epigallocatechin Gallate从绿茶中抑制了生成的青霉素酶的活性金黄色葡萄球菌［42协同增强碳青霉烯类抗甲氧西林的活性金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)43］.来自红玫瑰的Tellimagrandin I (狗牙蔷薇叶提取物的MIC明显降低β-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内酰胺抗生素[44］.同样的，科里拉金，一种从Arctostaphylos uva-ursi,发现可降低苯唑西林和头孢美唑对MRSA的mic [45］.

苯唑西林与植物提取物的协同作用鼠尾草用消磨时间的方法对棋盘分析中的物种进行了更详细的探讨。如图所示4，协同效应(差异)可以从10小时的潜伏期开始观察，并持续至24小时。棋盘格法和消磨时间法的结果在所有情况下都一致。

3．4．精油的相互作用鼠尾草officinalis苯唑西林和

关于提取物的协同作用鼠尾草物种，在这部分工作中，我们关注评估精油之间的相互作用鼠尾草officinalis和新青二。棋盘格法检测结果表明，6株耐甲氧西林菌株均具有协同作用美国epidermidis测试精油和牛奶蛋白的组合（表4）.FICI 1.811对甲氧西林敏感株Sep7的检测效果不显著。这与以下事实是一致的，即只有当试验生物体对至少一种药剂具有耐药性时，两种药剂的联合才会显示出显著的协同作用[46］.

目前所观察到的植物提取物(精油)与苯唑西林的协同效应，理论上可能是苯唑西林作用下的细胞膜扰动的结果。β-内酰胺抗生素苯唑西林抑制细胞壁肽聚糖合成的最后阶段(transpeptited reaction)，该反应发生在细胞膜外，由编码的替代蛋白结合蛋白PBP2a介导mec一个基因(47］.

与苯唑西林有协同作用的化合物可能抑制PBP2a活性或抑制其生成[45］.第一种机制可能与细胞膜的扰动有关，这是我们在本工作中已经证实的;第二种机制:抑制ppb2的产生mec基因表达是我们目前研究的内容，其结果将在后期发表。

4。结论

植物提取物的抑菌活性菊科和LamiCeae.家族被证实，并有助于所含精油对生物膜的干扰能力。提取物和精油的协同活性年代．officinalis苯唑西林为解决甲氧西林耐药引起的细菌感染问题提供了另一种方法葡萄球菌epidermidis．活性化合物的鉴定及与抗生素的相互作用机制的研究仍需进一步研究。

利益冲突

作者在论文内容上没有任何利益冲突。

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