改进抗菌化合物生产培养基的配方及统计优化链霉菌属sp。JAJ06

摘要

链霉菌属JAJ06是一种依赖于海水的抗生素生产者，以前从印度沿海的太阳盐中分离和鉴定。本文报道了在生产培养基中用确定的盐配方替代海水，并对后续的统计培养基进行优化，以确保一致性，提高抗生素生产链霉菌属JAJ06 sp。该菌株被观察到在生产培养基中加入化学定义的以氯化钠为基础的盐配方而不是海水时能够生产抗生素化合物。采用Plackett-Burman设计试验，采用淀粉、KBr和CaCO三种介质组成_3.，被认为对抗生素生产有显著影响链霉菌属JAJ06在他们的个人水平。采用Box-Behnken设计，采用响应面法对影响抗生素产量的培养基成分进行优化链霉菌属JAJ06 sp。共进行了17个二次模型和二次多项式方程的构建实验。通过模型分析和数值优化方法，得到了最佳培养基成分水平。在优化后的培养基中培养菌株JAJ06，其抗菌活性达到173.3 U/mL，较原菌株(136.7 U/mL)提高了26.8%。这项研究发现了一个有用的培养方法链霉菌属以提高抗生素类化合物的产量。

1.介绍

链霉菌属是生物技术工业中生物活性化合物的主要生产商。一些临床上有意义的抗生素以及广泛用于治疗常见疾病的药物都是从属于放线菌目的这个独特的属中提取出来的[1］．这个组织的不同成员包括链霉菌属已经从以前未开发的自然栖息地中分离出来，以滋养目前的微生物抗生素搜索项目[2，3.］．链霉菌属sp. JAJ06是革兰氏阳性，中度嗜盐链霉菌属该菌株以前从印度图提科林的高盐沿海太阳能盐场分离得到[4］．该菌株产生一种抗菌聚酮化合物，据报道该化合物对一系列细菌和酵母具有显著的最低抑菌浓度的有效抗菌活性[5］．据报道，JAJ06生产抗生素类化合物对海水有依赖性。与许多其他复杂介质成分一样，海水的成分也不确定，这可能会影响微生物生产特性的重现性[6］．为了保持可复制的生产概况，可以使用确定的盐配方。

培养基组分及其最适水平对微生物产生的次生代谢产物至关重要。在抗生素领域，许多努力都是为了优化生产速度和指导产品谱[7］．微生物系统中微生物次生代谢物的生产可以通过优化生产培养基的物理参数和营养成分来提高[8］．优化实验通常使用非统计的一次单因素[9，10]和统计实验设计方法[11，12］．但前者比统计方法费时费力[13]因此，统计实验设计技术，特别是Plackett-Burman设计（PBD）和响应面法（RSM）被广泛用于分别选择显著变量和获得最佳水平[7，11- - - - - -18］．与传统的单因素优化实践相比，在介质优化中应用这些统计实验设计技术可以提高产品产量，减少过程变异性，减少时间和总成本[7，13］．Plackett-Burman设计已经被一些研究人员用于选择复杂培养基成分中的影响因素[15- - - - - -17］．采用响应面法对选定的高度影响因素进行优化，可以采用中心复合材料设计(CCD) [7或Box-Behnken Design实验[18］．

在目前的工作中，努力将海水从JAJ06的生产介质中排除，并加入化学定义的盐配方。此外，为了提高JAJ06的抗生素产量，采用连续优化策略对生产培养基进行优化，使用Plackett-Burman设计选择对抗生素产量有显著影响的培养基组分，使用Box-Behnken设计的RSM对这些培养基组分进行优化。

2.材料和方法

2．1．菌株及培养条件

产生抗菌化合物的菌株，链霉菌属sp. JAJ06以前从沿海太阳盐土壤中分离出来，并对其抗菌次生代谢物进行了广泛研究[5］．该菌株在添加3%海盐的ISP4琼脂培养基表面维持。

2．2.基础生产培养基和盐配方

营养培养基中含有10克淀粉，4克酵母提取物，2克蛋白胨，1克MgSO₄2. 可可豆_3.0.04 硫酸亚铁₄h·7₂以1 L无菌海水中0.1 g KBr为基础生产培养基，进行进一步的改进和统计优化。

为了替代化学非定义海水，筛选了两种定义盐配方，并与海水进行比较，以支持JAJ06中的抗生素化合物。根据以前的报道，经过一些修改，制备了两种盐配方:盐配方I [6]含有12 g NaCl, 0.35 g KCl, 0.22 g CaCl₂h·2₂O, 10.7 mg H_3.薄_3., 7.3 氯化锶毫克₂， 1.3毫克NaF, 26μ克CoCl₂h·6₂O在1升去离子水中；盐配方II[19]含有15 g氯化钾，0.22 g氯化钙₂h·2₂O, 10.7 mg H_3.薄_3.， 7.5毫克的氯化锶₂， 1.3毫克NaF, 26μ克CoCl₂h·6₂O在1l去离子水里。

2．3.种子储备和培养条件

在添加3%海盐(w/v)的改良ISP-4培养基上培养，30℃，蒸馏水中制备JAJ06孢子悬浮液7天。然后将悬浮液以10的速率加入到250 mL Erlenmeyer烧瓶中ISP-2的肉汤中⁸孢子在50毫升液体培养基中。培养物在30°C、120 rpm的摇床上培养3天，作为种子砧木。为了生产抗生素，将JAJ06菌株接种到生产培养基中，在30℃，120 rpm的摇床上培养8天。

２.４.抗生素物质的提取

发酵液10000 rpm离心10 min，回收无细胞上清。上清液按1:1的比例加入乙酸乙酯，搅拌10 min。将含有抗生素物质的溶剂层从发酵液中分离出来，以5000 rpm离心15 min，以去除发酵液的痕迹。抑菌粗提物经旋转真空浓缩10倍后进行抑菌分析。

2．5．抗菌试验

对提取的粗提物进行3个重复的抑菌活性测定枯草芽孢杆菌MTCC 441的琼脂扩散平板测定[7，20.].粗提物装在6 mm无菌盘，干燥，并放置在接种有枯草芽孢杆菌悬挂调整到麦克法兰0.5的标准，相当于 CFU/mL。使用浸渍有乙酸乙酯的无菌圆盘作为对照。将平板在37℃下培养24小时 h和椎间盘周围形成的抑制区用透明尺测量，单位为毫米[20.Wang等人[7证实了抑菌带的大小可以作为抗生素滴度的衡量标准。因此，抗生素活性以每毫升培养粗物质的活性单位来表示，其中1u定义为围绕在抗生素盘周围的1.0 mm环形清除物。

2.6。用Plackett-Burman设计筛选基本培养基成分

Plackett-Burman设计（PBD）用于筛选最重要的培养基组分，用于培养基的生长和抗菌化合物的生产链霉菌属JAJ06 sp。使用Minitab 15.0 (Minitab Inc.， PA, USA)进行实验设计和后续实验数据分析。在实验设计中，通过在12个试验中以低(−)和高(+)两个水平来筛选7个中等成分(自变量)。表格1显示媒体组件，符号代码，和实际的低和高水平的变量。表格2显示设计的细节，每一行表示一次试验，每一列表示一个自变量。实验进行了3个重复，平均抑菌活性b .字幕被视为回应。置信度在90%以上的变量被认为对抗菌化合物生产有显著影响，因此用于进一步优化。

2.7。采用响应面法优化配方

采用Box-Behnken设计，采用响应面法(RSM)对淀粉、KBr、CaCO 3种基质进行优化_3.以加强JAJ06的抗生素生产。三种介质成分(自变量)分别在(−)、(0)和(+)三个不同的水平上进行研究，分别适用于低、中、高浓度3.）.本试验共进行了17次试验4)，在中心点有5次重复，反应值为两次重复的平均值。为进行统计计算，按下式对各因子进行编码: 在哪里是一个独立因素的编码值，是一个独立因素的实际值，在中心点的独立因子的实际值，和为步长变化值。

为了预测最优点，拟合了一个二阶模型来关联自变量与响应之间的关系。系统的行为可用以下二次方程来解释: 在哪里是预测的反应，是截距项，为线性系数，是二次系数，是相互作用系数，和表示自变量。

设计专家试验包（7.0版）用于实验设计，并对获得的数据进行回归分析。通过应用方差分析（ANOVA）验证模型的统计显著性。使用Fisher’s分析确定总体模型显著性-检验及其关联概率。拟合不足也被用于估算模型。拟合不足值低于0.05表示模型未考虑的变量-响应关系可能存在影响。多项式模型方程的质量通过确定系数进行统计判断()和调整．然后将拟合的多项式方程表示为三维响应面图，以说明各自变量的响应与实验水平的关系。采用Design Expert的数值优化方法对每个变量的水平进行优化，以获得最大响应。

2.8.实验验证

通过在优化和未优化的生产培养基中培养JAJ06，实验验证了产生最大响应的不同优化变量的组合。收集无细胞培养液，用等体积的乙酸乙酯提取，并干燥顶部有机层以进行进一步分析。将干燥的乙酸乙酯提取物重新悬浮在甲醇中，并如上所述进行抗生素活性测定。

3.结果

3．1.JAJ06的化学定义盐配方

用摇瓶培养法测定了JAJ06在三种不同培养基中的最大抗菌活性。产生的生长和抗生素活性链霉菌属sp. JAJ06在含有各种盐组成的生产介质中的作用见表5．我支持的氯化钠盐配方的抗生素活性比海水更好。但在海水和氯化钠盐配方中的生长速度似乎是相同的，而盐配方II的生长速度和抗生素活性略低于其他两种。

3．2.利用PB设计筛选基本培养基成分

计算每个变量对抗生素活性的主要影响，以确定影响抗生素合成的培养基成分链霉菌属sp.JAJ06.表格6表示效果，标准误差，值,根据表中给出的抗生素检测结果，每个成分的值和置信水平2．根据培养基组分的效应，以92.5%的置信度筛选培养基组分。研究表明，淀粉(), KBr (), CaCO_3.（)对JAJ06的抗生素生产有明显影响。这三个变量的置信度均高于90%，表明它们的贡献显著高于其他媒体成分。帕累托图也证实了这一点1)，较高的效果出现在上面部分，然后继续向下到较低的效果。直接表明淀粉、KBr和CaCO是影响抗菌化合物生产的主要因素_3.．

3．3.培养基组分的优化

根据Plackett-Burman设计的结果，淀粉，KBr和CaCO_3.被选为最具影响力的培养基成分，并使用响应面法进一步优化。在这种方法中，在Box-Behnken设计实验中进行批量运行，确定独立因素对响应的影响以及预测值的结果如表所示4．计算回归方程系数，并将数据拟合为二阶多项式方程。抗生素活性的反应可以用以下回归方程表示: 在哪里代表了对抗生素活性的反应，,是淀粉、KBr和CaCO的编码值_3.,分别。

采用方差分析对二阶响应面模型进行检验，结果如表所示7．方差分析显示，该模型是高度显著的，因为它是明显的从低值(<0.0001)以及。模型的显著性也得到了统计上不显著的拟合不足的支持，从较低的计算中可以明显看出值(4.01)。该模型为0.9831，表明模型方程可以解释总变异量的98.31%，表明预测值与实验值吻合较好。

绘制了诊断图以判断模型的充分性，并澄清实验数据中任何问题的迹象。观察到的反应(抗生素活性)与预测反应的曲线图如图所示2（a）．在这种情况下，预测值与观测值在操作变量范围内是一致的。使用被研究残差的正态概率图来检查残差的正态性(图2（b））.在这张图中观察到的线性模式表明，实验数据中没有任何问题的迹象。数字2（c）表示研究残差与预测值的关系图，以检查常量误差。残差显示出散射的随机性，表明原始观测的方差是恒定的。

绘制三维(3D)响应面图来说明淀粉、KBr和CaCO的单独和相互作用的影响_3.JAJ06的抗生素生产情况(图3.）.每个3D图显示了两个变量的影响，而其余的则保持在中间水平。淀粉与KBr、淀粉与CaCO的相互作用不显著_3.(数据3(一个)和3 (b)),分别。随着淀粉浓度从2 g/L增加到17.5 g/L(编码值，−1.0 ~ 0.75)，中等浓度KBr(编码值，0.5)下抗生素活性显著增加;然而，即使在高淀粉浓度下，随着KBr的进一步增加，抗生素活性也会下降(图)3(一个)）.

当碳酸钙的浓度_3.当淀粉浓度从2 g/L增加到15 g/L(编码值为- 0.1到0.5)时，抗生素活性增加，进一步增加淀粉浓度至高水平导致抗生素产量轻微下降(图3 (b)）.

随着KBr浓度从0.02增加到1.1 g/L(编码值，−1到0.15)，低浓度CaCO的抗生素活性显著增加到一定水平_3.(编码值，−1)，并在中等水平的CaCO进一步轻微增加_3.(编码值,0.25)。低浓度碳酸钙_3.发现对抗生素活性有支持作用；但当CaCO浓度增加时，活性受到抑制_3.在生产培养基中含量较高。

3．4．优化与实验验证

在数值优化的基础上，二次模型预测当编码单元中试验因子的最优值为淀粉= 0.37、KBr = 0.24、CaCO时，最大抗生素活性为169.07 U/mL_3.=−0.20(图4)，其中淀粉7.4 g/L, KBr 0.048 g/L, CaCO 0.8 g/L_3.,分别。在摇瓶中进行了三次重复实验，验证了优化培养基的统计结果。实验获得的最大抗生素活性单位为173.3 U/mL，(表8)，与预测值(169.07 U/mL)基本一致。因此，所建立的模型对抗生素生产的预测是准确可靠的链霉菌属JAJ06 sp。最终优化培养基中淀粉7.4 g，酵母膏4 g，蛋白胨2 g, MgSO 1 g₄， 0.8克碳酸钙_3.0.04 硫酸亚铁₄h·7₂在1 L氯化钠基盐配方I中加入0.048 g KBr。

4.讨论

链霉菌属是具有抗生素性质的次级代谢物的潜在生产者[21- - - - - -23］．它们的抗生素生产能力不是静态的，它会受到生产培养基成分的显著影响[24，25］．目前的调查主要集中在改进抗生素生产链霉菌属sp. JAJ06作为生产培养基中成分水平的函数。的链霉菌属sp. JAJ06曾被鉴定为依赖海水的产抗生素放线菌[5］．海水的性质不明会影响放线菌生产的可重复性[6］．在这项研究中，海水被从生产介质中排除，并加入了化学定义的盐配方。在两种确定的盐配方中，以氯化钠为基础的盐配方有利于JAJ06中最大限度的抗菌化合物生产。这种类型的化学定义的盐配方已经被报道用于从依赖海水的生物活性化合物的稳定生产Salinispora tropica应变NPS21184 [6］．

培养基组成的小操作可以对微生物次生代谢产物的生物合成产生显著影响[7，26］．一些从事抗生素发现项目的研究人员应用PBD和RSM作为统计工具来识别、操纵和优化影响培养基成分，并记录增加的抗生素产量。例如，Wang等人，[7]应用RSM法优化微生物发酵生产抗生素的培养基Xenorhabdus bovienii并且抗生素活性增加了37.8%[27据报道，抗生素产量增加了2.7倍芽孢杆菌sp. ZJUIBE-076采用RSM方法。

本研究利用PBD和RSM对抗生素生产培养基进行优化链霉菌属抗菌活性增加26.8%。PBD结果显示，与JAJ06抗生素生产相关的关键培养基成分是淀粉、KBr和CaCO_3.Raytapadar先生和Paul先生[28报道淀粉是生产抗生素的重要培养基成分链霉菌属aburaviensis1 da-28。同样,CaCO_3.已被确定为与环六肽抗生素生产相关的关键成分链霉菌属alboflavus［29］．RSM被发现是非常有效的优化选择培养基成分从阳性诊断图(图)2),值为0.9831，与之前的报告具有可比性[7，27］．

5.结论

目前的调查主要集中于改进抗生素的生产链霉菌属sp. JAJ06作为生产培养基中各种盐组成和成分水平的函数。结果表明，PBD和RSM在可管理的试验次数中对培养基组分的选择和优化非常有效，总抗菌活性提高26.8%。此外，本实验获得的最佳培养基将有助于进一步研究在发酵罐中进行大规模发酵，从而有效地生产抗生素链霉菌属JAJ06 sp。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

承认

作者感谢印度科学和工业研究理事会-人力资源开发小组(CSIR-HRDG)的财政支持，通过高级研究奖学金提供资助。

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