临床和食品分离菌株的生物膜形成单核细胞增多性李斯特氏菌

摘要

客观的．总共725个单核细胞增多性李斯特氏菌在4°C条件下5天，在37°C条件下24小时，研究了从各种食物中分离的607株和从临床李斯特菌病病例中分离的118株细菌形成生物膜的能力。方法．在聚苯乙烯组织培养板上进行了生物膜的制备。五个l . monocytogenes分离菌株暴露于酸性和渗透胁迫条件下进行生物膜形成测试。结果．显著差异()。在37°C处理24 h时，大多数食物分离株被归类为弱或中度生物膜形成者，而所有临床分离株都是生物膜产生者，尽管大多数是弱生物膜形成者。在4°C下5 d，来自食物和临床病例的分离株分别为65株和59%为弱分离株。在两次亚致死应激后，在37°C条件下，测试的5个菌株中只有一个对随后的酸性暴露更敏感。然而，在4°C时，这两种压力都没有带来敏感性或抗性。结论．分离菌株的来源、温度和亚致死酸性胁迫在形成生物膜的能力方面存在显著差异。菌株、来源和环境条件可通过以下方法确定生物膜的产生水平l . monocytogenes隔离。

1.介绍

单核细胞增多性李斯特氏菌是世界范围内几起食源性疾病暴发的罪魁祸首李斯特菌病主要局限于孕妇、老年人和高发病率和死亡率免疫功能低下的高危人群[1]．据欧洲食品安全局称，这种细菌仍然令人担忧;与2008年相比，人类李斯特菌病病例增加了19.1%，2009年记录的确诊病例为1645例[2]．

l . monocytogenes可以在食品工业包括冷藏环境中遇到的大多数表面和设备上形成菌落，据报道持久性菌株[3.- - - - - -5]．在加工过程中，这种微生物很容易污染最终的食品。许多细菌能够通过产生生物膜附着在环境表面并定植，生物膜是一种由胞外聚合物(EPS)构成的三维基质[6]．生物膜所产生的l . monocytogenes与其他生物相比结构简单，24 h后可形成成熟的生物膜群落[6，7]．生物膜一旦形成，并与浮游细胞相比，对抗菌剂、紫外线、干燥和消毒剂的处理具有更大的耐药性[8，9]．l . monocytogenes已被报道能够在各种表面上附着和形成生物膜，例如不锈钢、聚合物和橡胶垫圈[6，8，10]．这种能力取决于几个因素:考虑的菌株[8，11，12，表面的拓扑结构[13- - - - - -15]，成长阶段[9，温度[9)、成长媒体[16，以及其他微生物的存在[17]．

Djordjevic等[18]报道了系统发育和产生生物膜的能力之间显然存在着联系。环境应激(如饥饿)也影响附着和生物膜的发育l . monocytogenes［19，20.];一般来说，在环境胁迫下，生物膜的生成能力会增强。因此，研究生物膜形成过程中产生/变异的因素至关重要l . monocytogenes以优化预防措施，从而最大限度地降低生物膜产生的风险l . monocytogenes食品工业。

这项研究的目的是描述725l . monocytogenes在4°C条件下5天，在37°C条件下24小时，在96孔微滴度板中形成生物膜的能力。五食之行为l . monocytogenes在暴露于酸性和渗透性亚致死胁迫后，分离株对其产生生物膜的能力也进行了研究。

2.材料和方法

2．1．隔离的起源

总共725个l . monocytogenes隔离进行了研究;607年从葡萄牙食品质量控制实验室(23%血清群活动花絮,IIb血清组23%,9%血清组IIc,和85%血清组IVb)司长委任和118隔离(IIb 12%血清群活动花絮,21%血清组,85%血清组IVb)司长委任获得临床病例的李氏杆菌病发生在葡萄牙和收集从葡萄牙主要医院,2003年到2008年之间。这些分离菌株在−80℃的Tryptone soy Broth中沉积和储存，Tryptone soy Broth中添加了0.6% (w/v)的酵母提取物(TSBYE, Pronadisa, Madrid, Spain)，其中含有30% (v/v)的甘油李斯特菌CBQF-Escola Superior de Biotecnologia(波尔图，葡萄牙)的培养收集，并用于当前的调查。

2．2.生长和储存条件

从冷冻砧木中接种工作培养物到含0.6%酵母提取物(TSAYE;Pronadisa)， 37°C孵育24小时。

每株菌在TSBYE中传代过夜，然后进一步接种(10% v/v)到10 mL TSBYE中，37℃孵育18 ~ 20 h。这个过程重复了两次。

2．3.生物膜的生产

生物膜的生产过程如Cerca等人所述[21]．尽管聚苯乙烯很少出现在食品生产或临床环境中，但由于正在调查的分离株数量高，它被用于实际原因。德国韦特海姆布兰德镇的每口井都装了180只μTSBYE和20的LμL的过夜培养获得如上所述。覆盖板并在37°C下有氧培养24小时，在4°C下有氧培养5天。用2%结晶紫溶液观察生物膜，并使用平板阅读器(Microplate reader, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)在655 nm处测量光密度(OD)进行定量。根据分离菌株形成生物膜的能力进行分类，获得了临界值。截止值(ODc)来确定生物膜生产商的分类隔离nonbiofilm生产商(OD≤ODc)、弱生物膜生产商(ODc < OD≤2×ODc),温和的生物膜生产商(2×ODc < OD≤4×ODc),和强大的生物膜生产商(4×ODc > OD)。因此，每项试验将分离菌株分为非生物膜产生者、弱生物膜产生者、中等生物膜产生者和强生物膜产生者[14]．对于每个菌株，所有实验都至少进行6次:在两个不同的聚苯乙烯组织培养板上进行3孔。以有培养基和未接种细菌的孔为阴性对照。

２.４.酸性和渗透胁迫后生物膜的形成

2.4.1。隔离和增长

从不同植物中筛选出5株分离株:1079(血清型1/2b-3b)、1055/4(血清型4b-4d-4e)、1509/2(血清型1/2c-3c)、1592/2(血清型1/2b-3b)和1743(血清型4b-4d-4e)。由于这些乳业分离菌通常与广泛的环境压力接触，如高盐浓度，低pH，和a_w，我们选择这些分离菌来研究这种胁迫对生物膜形成能力的影响。

如前所述进行培养，但只将最后的0.1 mL接种物转移到10 mL TSBYE(1:100)中，在37°C下进一步培养18-20小时。每个分离物通过离心(8877 ×g, 10分钟，4°C;Rotina 35R, hetich，德国)，重悬于10ml无菌四分之一浓度的Ringer’s溶液(Lab M, Lancashire, UK)中，混合获得约10的接种量⁷CFU/mL，滴计数技术定量[22]， 37℃孵育24 h。

2.4.2。亚致死胁迫后生物膜的测定

亚致死条件是预先确定的[23]．如上所述制备的接种物接种(0.5 mL)到含有49.5 mL BPW(缓冲蛋白胨水，Lab M)的玻璃烧瓶中。

相应地调整pH和NaCl浓度(pH为3.5的BPW与乳酸(1 M, José M. Vaz Pereira, Lda, Lisbon, Portugal))和BPW含有30%的饱和溶液，仅对分离株1592/2和1743，或40% (w/v)的NaCl (Panreac, Barcelona, Spain);细胞在37°C条件下应激1小时。分别在0(接种时间)和60分钟后取样。对每个亚致死胁迫进行对照(BPW)不加盐)。幸存者被点算一式两份，采用滴数法[22]，在37°C孵育24 h。结果以CFU/mL表达。

在暴露于这些亚致死应力后，通过离心(8877 ×g, 10分钟，4°C;Rotina 35r)，用50 mL TSBYE重悬。从这次停职算起，20μL加入3孔含有180个的无菌聚苯乙烯组织培养板中μL TSBYE。覆盖板，37℃好氧孵育24 h, 4℃好氧孵育5 d。生物膜的定量方法如上所述。

2．5．统计分析

使用KaleidaGraph 4.0 (Synergy software Reading, PA, USA)软件进行方差分析，以检验使用的两种温度之间、重复内以及食品和临床分离株之间的显著差异。

3.结果与讨论

人们普遍认为，生物膜中的细胞比浮游细胞更能抵抗杀菌剂、抗生素、抗体和表面活性剂。因此，了解食源性病原体的生物膜能力对食品工业至关重要，以便确定最有效的清洁和消毒策略，并在临床设置时建立最合适的治疗机制。几个l . monocytogenes研究了从食品和临床来源分离的菌株在4°C和37°C下产生生物膜的能力。显著差异()。在37°C处理24 h时，大多数食物分离菌属弱菌(；54%)，或中度生物膜形成者(, 40%)。所有临床分离株均为生物膜产生株，但大多数为弱生物膜产生株(；70%)(图1）.

在37℃下，食品分离株中中度生物膜产生株的百分比略高于临床分离株的百分比(图)1）.

4°C时，临床分离株较弱(；59%)或非生物膜生产者(；41%)。从食物中分离出的细菌为非传染性(， 24%)、弱(；65%)或中度(；11%)生物膜生产者(图2）.

IIa和IIb(临床分离株的IIc)血清组中，在37℃下24小时内形成生物膜活性最强的分离株所占比例最高;血清组IVb则相反(见表)1）.在4°C下5天，由于大多数分离株均为非或弱生物膜形成者，因此观察到生物膜形成能力与血清组无相关性(见表2)1）.

五种食物分离物l . monocytogenes是为了研究两种亚致死胁迫条件(酸性和渗透性)对随后在37℃和4℃形成生物膜的能力的影响。在应激条件下，观察到菌株1592/2因酸性暴露而致敏，其在37℃下形成生物膜的能力降低(图)3.）.然而，在4°C的胁迫条件下，暴露在胁迫条件下的所有研究分离株既没有敏感性，也没有抗性，因为没有显示出显著差异(图)4）.

温度对能力的影响l . monocytogenes几位作者已报告可分离形成生物膜[17，24- - - - - -26]．Chavant等人[24)表明,l . monocytogenesLO28在37°C时在聚四氟乙烯(PTFE)表面定植，而在8°C时没有。Di Bonaventura等人[25证明了44种不同的分离菌株在聚苯乙烯表面产生的生物膜l . monocytogenes在37°C显著高于4°C。诺伍德和吉尔莫[17，然而，报告了两个l . monocytogenes分离在4°C和30°C下黏附相同的菌株。在本研究中，温度影响了被测菌株形成生物膜的能力。这种能力被证明依赖于菌株和分离物的来源。重要的是强调在这项研究中获得的结果在强生物膜形成的临床分离。虽然缺乏关于食品分离株和临床分离株生物膜产生差异的文献，但临床分离株可能更适应接近体温的温度，这可能是其在37℃下产生中度或强生物膜的一个原因。

IIa和IIb(食品分离株的IIc)血清组中，在37℃条件下具有形成生物膜最强活性的分离株所占比例最高。Nilsson等人[27]报告了在食品和临床分离中l . monocytogenes（)，血清型1/2a(属于血清型IIa)菌株产生的生物膜明显多于其他血清型。

五种食物分离物的行为l . monocytogenes在酸性和渗透亚致死胁迫条件下，研究了它们产生生物膜的能力。据报道，亚致死条件经常增强微生物对后续胁迫的抗性[28]．适应细胞对其他胁迫的交叉抗性对食品工业具有重要的意义，特别是因为食品在加工过程中通常会遇到亚致死的酸性处理[29]．菌株1592/2在酸性亚致死胁迫条件下，在37℃下形成生物膜的能力降低。在37°C下的渗透暴露以及在两种亚致死条件下的暴露在4°C下没有观察到形成生物膜的能力的差异。Adrião等[30.调查了一些人的行为l . monocytogenes从手工制奶酪的环境中分离出来的对酸和盐胁迫的反应。结果表明，部分分离菌对盐或酸的适应能力可提高次氯酸盐消毒下固着细胞的生存/抗性。Longhi等人[15研究了一种蛋白酶的处理方法，发现l . monocytogenes亚致死浓度的细胞外金属蛋白酶降低了形成生物膜的能力。Nilsson等人[27认为环境条件决定生物膜的产生水平l . monocytogenes与浮游生物的生长速度无关。

4.结论

在目前的工作中，临床分离株和食品分离株在形成生物膜的能力方面存在显著差异。这种能力也受所使用的温度的影响，因为生物膜的形成在37°C增加。考虑到亚致死酸性胁迫，只有一株菌株的生物膜形成能力降低。在亚致死渗透胁迫下，未观察到生物膜形成能力的变化。解释食品和临床生物膜产生的差异l . monocytogenes隔离以及环境因素(如温度)的影响，还需要进一步的调查，如测试与食品和临床环境有关的不同表面生物膜的产生和耐药性l . monocytogenes用于临床和食品加工环境中的消毒剂的悬浮物和生物膜分离物。此外，进一步研究更多亚致死压力对临床和食品分离物行为的影响也很重要。

利益冲突

所有作者证明，与本文相关的实际或潜在的利益冲突不存在。

致谢

这项工作得到了Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)国家基金的支持，项目包括PEst-OE/EQB/LA0016/2011和PTDC/AGR-ALI/64662/2006。作者Joana Barbosa, Rui Magalhães, Vânia Ferreira和Joana Silva的资金支持分别由Fundação para a Ciência e a technologia提供，博士奖学金SFRH/BD/48894/2008，博士奖学金SFRH/BD/ 71794 /2010，博士后奖学金SFRH/BPD/72617/2010，博士后奖学金SFRH/BPD/35392/2007。感谢P. A. Gibbs博士对这篇论文的编辑。

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