气候变化的季节性水平弧菌捕食者Bacteriovorax在大西洋、太平洋和墨西哥湾沿岸的海水中

摘要

Bacteriovorax在美国大西洋、海湾和太平洋的海水中进行量化，以确定这些掠食性细菌的基线水平和可能的季节性波动水平。在夏威夷凯卢阿-科纳，连续1年每月对表层海水进行分析;阿拉巴马州的墨西哥湾沿岸;以及特拉华湾沿岸的四个地点。筛查Bacteriovorax是在诉parahaemolyticus宿主细胞。直接测试来自大西洋、太平洋和墨西哥湾海岸的7.5 mL部分海水的年平均计数≤12.2 PFU。飓风桑迪过后一周，特拉华湾沿岸4个地点中有3个观测到了计数的峰值。对比夏季和冬季的计数，结果明显更多Bacteriovorax（)，并显著增加()，但没有显著的季节差异()夏威夷海水。Bacteriovorax在特拉华州的一个地点，计数只与海水盐度和温度相关(和、职责)。结果表明，气温与气温之间存在较强的负相关关系Bacteriovorax水平()为墨西哥湾海水。对选定的分离株进行序列分析和系统发育分析Bacteriovorax集群IX、X、XI和XII。

1.介绍

弧菌parahaemolyticus和创伤弧菌是重要的食源性病原体，与食用鱼类和贝类有关，尤其是牡蛎，长期以来，人们知道牡蛎会在其可食用组织中生物富集弧菌[1，2］.创伤弧菌亦会因在海洋环境中获得的伤口感染而引致危及生命的疾病[3.］.致病性弧菌在海水和贝类中表现出季节性的喜好，在温暖的月份中数量较高，而在寒冷的月份中数量较低至可忽略不计[2，4，5］.最近，我们发现这是自然发生的蛭弧菌属以及来自沿海海水的类似生物(BALOs)显著降低了诉parahaemolyticus和创伤弧菌在海水和诉parahaemolyticus在海水及牡蛎中[6］.在balo中有海洋和陆地的形式，海洋形式与Bacteriovorax,它们完全是咸水掠食者[7，8］.Bacteriovorax是否表现出优先捕食诉parahaemolyticus与广泛的潜在宿主细菌相比[9- - - - - -12］.这表明,Bacteriovorax可能会入侵并杀死诉parahaemolyticus在海水中比其他细菌病原体更有效。

生命周期Bacteriovorax其他BALO通常涉及宿主细胞内的入侵和复制，尽管有些BALO已知能独立于宿主细胞生长[13- - - - - -16］.在攻击阶段，BALOs用单极鞭毛推动自己寻找敏感的革兰氏阴性菌作为宿主。BALO以酶的方式消化宿主细胞膜上的一个洞，进入周质空间，并利用宿主的营养物质，在一个被称为珠质体的结构中以蠕虫的方式生长。当蛭质体成熟时，它分裂成多个不成熟的细胞，随后当它溶解时从宿主释放出来。不成熟的细胞发育成成熟的，攻击期的细胞重复整个周期。攻击相balo较小，直径仅为0.2 ~ 0.4μ米(16]，使它们可以通过0.45进行过滤μM孔径膜，有利于从宿主细菌中分离。未成熟的BALOs长度大致相同，但看起来比攻击阶段的BALOs更窄、更光滑[6，使它们也很容易过滤。在添加>1 × 10的天然未过滤海水中^3.CFU /毫升诉parahaemolyticus，诉parahaemolyticus在72小时内，计数减少了3个对数，几乎达到无法检测的水平 h、 而自然发生的巴洛斯(Bacteriovorax)在同一时期内，从几乎无法检测到的初始水平增加了3个对数[6］.

一些研究已经评价了Bacteriovorax在包括河口沉积物在内的海洋系统中[17]及海水[18，19]本研究进一步评估了气候变化的季节性Bacteriovorax在河口的物种。在本研究中，我们每月对天然海水进行1年的总可培养物进行评估Bacteriovorax有感染能力的弧菌parahaemolyticusO3:K6宿主细胞(故称弧菌食肉细菌(6)，从特拉华湾沿岸的四个地点(图1(a))，阿拉巴马湾海岸的一个地点(图1(b))和夏威夷凯卢阿-科纳的一个场址(图1(c))。特拉华湾和墨西哥湾沿岸的三个收集点都位于河口。我们还确定了季节模式Bacteriovorax丰度，评估温度和盐度对Bacteriovorax水平，识别一些Bacteriovorax系统类型，并提出可能影响的环境因素Bacteriovorax的水平。

2.材料和方法

2．1．菌株

一种临床菌株诉parahaemolyticusO3:K6称为RIMD2210633作为宿主进行测定Bacteriovorax来自海水。这一大流行菌株最初于1996年从日本的一个机场检疫站分离出来，并导致旅行者腹泻[20.，21］.将该分离株在添加2% NaCl (3% NaCl)的Luria Bertani (Beckton, Dickinson and Co.， Sparks, MD)培养基中常规培养，或在添加2% NaCl (3% NaCl)的LB琼脂上划线。

2．2．采样地点

大西洋海水是在涨潮时沿海岸线或河流边缘收集的地表水，并在特拉华湾的四个地点进行分析，如前所述[6］.实际上，特拉华州的地点是1号地点:位于DE lewis(38°46 ' 57.85 ' N;75°07年“04.73”W);地点2:Broadkill河，位于特拉华大学海洋实验室外的刘易斯，DE，离河口上游0.6公里(38°47 ' 26.37 " N;75°09年“51.36”W);地点3:牡蛎岩路船在弥尔顿的Broadkill河登陆，DE(38°48 ' 08.01 " N;75°12“11.57”W);地点4:Scotton Landing on the Saint Jones River in Frederica, DE(39°05 ' 05.94 " N;75°27 ' 39.99 " W)(图1(a))。海水立即在环境温度下的绝热冷却器中运输到实验室。美国食品和药物管理局实验室位于AL(30°15 ' 25.57 " N;88°6 ' 21.73 " W)(图1(b))，并在绝缘冷却器内过夜运往特拉华州进行测试。在收集海水时，记录特拉华州和海湾地区的海水温度和盐度。Kona Coast Shellfish Co.， Kailua-Kona, HI(19°43′42.9”N;156°3 ' 46.2 " W)(图1（c） ），并在保温冷却器中快递至实验室，在收集后2天内收到。收集时夏威夷水的温度为24-25°c，约为35°c ppt盐度全年。夏威夷和墨西哥湾的水样在夏季随冰袋运输；但是，为了防止直接接触，冰和海水被物理分离。在交付实验室后，所有海水样品在4小时内进行分析 H

2．3.空斑实验

项Bacteriovorax7.5毫升未过滤或0.45μ对M滤过的海水进行了定量测定诉parahaemolyticusO3:K6寄主细胞在Pp20琼脂(多蛋白胨蛋白胨添加Bacto琼脂)中生长，如最近所述[6］.初步研究表明，必须通过海水过滤来降低不溶性Bacteriovorax微生物污染物，否则会使草坪杂草丛生诉parahaemolyticus从而影响未成熟或攻击期的量化Bacteriovorax．在22 - 26°C下孵育7天。潜在的噬菌体斑块将被区分Bacteriovorax一夜之间迅速形成的斑块;然而,Bacteriovorax斑块需要几天才能形成[17].虽然Bacteriovorax在Pp20琼脂上产生斑块，噬菌体通常需要更复杂的营养介质来形成斑块[17］.本研究未检测到噬菌体。由于7.5 mL的海水分析，每次分析，总可培养Bacteriovorax在这篇文章中，计数被列为每7.5 mL海水的计数。

２.４.扫描电子显微镜

如前所述，对选定的分离株进行扫描电子显微镜检查[6范]使用广达200 feg显微镜(有限公司晚宴过后,或戊二醛固定后,清洗与咪唑缓冲区(pH值7.0)0.1米,在分级脱水乙醇冲洗,临界点干燥,真空(丹顿,樱桃山,新泽西),溅射镀膜和黄金在氩气氛使用爱德华兹Scancoat六溅射涂布机(西萨塞克斯郡,联合王国)。

2．5．统计和DNA序列分析

得到了两者之间的相关系数Bacteriovorax计数和盐度或温度，而计数、温度和盐度的显著差异是由学生的测验价值观≤ 0.05被认为具有统计学意义，而≤0.0001被认为具有极显著的统计学意义。

对13株随机抽取的分离株进行16S rRNA测序μM正向引物(Bac676F)和反向引物(Bac1442R)的最终浓度，如Davidov等[22]，但在5 '端没有GC钳夹。条件为94°C变性1 min，随后在94°C变性1 min, 56°C变性1 min, 72°C变性1 min 45个循环。cdna在0.8%琼脂糖凝胶上电泳纯化，根据制造商说明，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen #28704)切除~700 bp的溴化乙锭染色条带并进行纯化。测序由GENEWIZ公司(South Plainfield, NJ)进行，引物为Bac1442R。在末端修剪数据，通过GenBank Blast搜索确定长度为700 bp的序列，并与Pineiro等人描述的类似采样点的系统类型和克隆进行比较。[9］.

3.结果

Bacteriovorax确定了特拉华湾沿岸四个地点的水位。一个地点（地点1）位于特拉华湾河口附近的梅-路易斯角渡轮码头，而其他三个地点位于特拉华湾附近的潮汐河流上（图1）1（a） ）。每月平均Bacteriovorax每7.5毫升0.45μm滤过海水的测定结果如图所示2(一个)．原定于2012年10月下旬的蓄水计划被推迟，因为飓风桑迪(Sandy)在10月下旬给该地区带来了强烈的潮涌、飓风级别的大风和特大暴雨。由于飓风的影响，原定于10月进行的海水取样工作被推迟到11月5日。Bacteriovorax飓风过后一周，四个收集点中的三个都达到了最高水平(图)2(一个)星号)。最内陆的地点(4号地点)在飓风过后并没有增加，反而比前一个月的平均值有所减少。与其他站点不同的是，4号站点在Bacteriovorax在夏季的几个月里，峰值为33 PFU/7.5 mL海水。的Bacteriovorax也表现出季节性偏好，夏季的数量明显高于冬季()．Bacteriovorax每个月在特拉华湾至少一个地点检测到，但在2013年2月，四个收集地点中的任何一个都没有检测到(<0.33 PFU/7.5 mL海水)。缺乏Bacteriovorax2月份的监测结果与全年最低水温(4个地点的平均水温= 5°C)相吻合。四个地点的特拉华湾12个月期间的海水温度相似，并呈现正常的季节性波动，从2月约5°C的低点到7月下旬≥25°C的高点(图)2 (b))．位点1-3的盐度相似，但位点4的平均盐度(图2 (c))显著降低()，而不是其他地点。

Bacteriovorax图中四个地点的计数及相应的温度和盐度以图形形式叠加，以便进行比较3(一个)- - - - - -3 (d)．温度与Bacteriovorax不同位点间计数差异很大值分别为0.102、0.068、0.053和0.651。4号点(河流站点)是最内陆的站点，与气温的相关性较高Bacteriovorax计数。其余部位没有相关性。除了一个例外，四个地点中有三个全年盐度保持在>25个百分点(见图)2 (c))．Site 4显示了整个研究中最低的盐度，从2月的4.8个百分点到7月下旬的23.4个百分点(图)2 (c)和3 (d))。此外，盐度和温度之间几乎没有相关性Bacteriovorax计数网站1-3分别为−0.067、−0.119、−0.183;然而，盐度与Bacteriovorax站点4的计数()．在每个站点偶尔可以看到计数的峰值(图)3(一个)- - - - - -3 (d))，但与温度或盐度不一致，除了在飓风桑迪之后的站点1-3，当水温从风暴前的一个月的>20°C下降到风暴后的大约10°C时，计数出现峰值(图)3(一个)- - - - - -3 (c))．

特拉华州遗址的地形有些不同。地点1是最南端的地点，直接沿着特拉华湾河口附近的岩石加固的海岸线(图)1(a))。相反，其他三个地点都是潮汐河，河岸上生长着沼泽草。收集地点附近是否有沼泽不能显示对总数有影响Bacteriovorax在这个研究过程中。位点4总体表现出不同的趋势Bacteriovorax1-3号站点的计数相似（图2(一个))这可能更多地是由于现场4距离特拉华湾内陆最远（盐度较低），而不是该区域是否存在沼泽。

墨西哥湾沿岸的海水盐度(4.8 ~ 28.8 ppt)和温度(12.2 ~ 31.1°C)不等(图4(一))。与特拉华州海水相比，墨西哥湾沿岸海水显示出较低的Bacteriovorax(≤5 PFU/7.5 mL海水)。)水平(图4(一))．这与特拉华州的调查结果相反，特拉华州的调查结果明显高于特拉华州()事实上，温度和温度之间存在着较强的负相关关系Bacteriovorax水平()为墨西哥湾海水。最高的意思Bacteriovorax该海湾的读数是在12月获得的，与最高的盐度读数同期。从1月到2月，随着盐度水平的下降，总盐度也在下降Bacteriovorax(图4(一))．然而，盐度与盐度之间的相关性较低Bacteriovorax在一年中计算()．

夏威夷的海水，像特拉华湾和墨西哥湾沿岸的海水一样，是地表水，但它不受季节温度变化或盐度变化的影响。它全年的温度和盐度几乎恒定(24-25°C和35个百分点)。结果显示有两个高峰Bacteriovorax当平均计数从一般<5 PFU/7.5 mL海水增加到23 PFU/7.5 mL海水和121.8 PFU/7.5 mL海水时(图)4 (b)).这些峰值的原因仍不确定。Bacteriovorax墨西哥湾沿岸和夏威夷的海水计数可能都受到了船运的影响，这两种情况分别需要1天和2天。我们不能排除在运输过程中计数可能发生变化的可能性，特别是在海水中存在潜在宿主细胞的情况下。对海水中天然细菌的捕食可以解释夏威夷海水中观察到的两个月计数高峰(图)4 (b))．

分离株测序结果与Pineiro等人提交到GenBank的同源序列一致99.9-100%(每个分离株700 bp中最大1个碱基差异)[9］.系统类型和克隆见表1表明分离株位于四个不同的系统型簇席（IX，X，XI，XII）中，聚类XII菌株为CO2B和HaWAII5的克隆，如前所述[9］.没有一个分离物属于编号较低的类群，如IV和V，它们通常被认为是低盐的河口物种[9，19，23］.第IX组分离株来自特拉华湾靠近DE lewis的两个地点，以及墨西哥湾沿岸的一个地点(见表)1)．此前，Pineiro等人[9]从刘易斯的特拉华湾获得了相同的分离物，并将其命名为克隆刘易斯11。两个特拉华分离物分别从中等盐度地点（地点3）和低盐度地点（地点4）获得。

在未经过滤的大西洋和墨西哥湾海岸的海水中存在大量的微生物污染物，但夏威夷的海水更干净，因此可以进行比较Bacteriovorax未过滤和0.45中的计数 μm过滤后的样本2).在未经过滤的海水中，Bacteriovorax在大多数月份都比较高(表2)．只有在8月份，未经过滤的水平为0.45μm过滤海水基本相同（23.5对23.3 PFU/7.5 2013年2月，未经过滤的夏威夷海水中的计数太多，无法计数，远远超过121.8 PFU/7.5 在过滤样本中观察到的mL海水。这些峰值在Bacteriovorax计数不能归因于温度或盐度的变化，因为夏威夷海水的温度和盐度几乎保持不变。此外，没有异常的天气条件来解释这些高计数。剔除2013年2月的数据后，平均计算结果显示，这一数字还要高出6.2倍Bacteriovorax在未过滤的海水中比在过滤过的海水中。

在Pp20琼脂平板上选取有代表性的菌斑进行进一步评价。斑块的大小因分离物而异，斑块通常是无色的(图)5)．Bacteriovorax通常是从大的、分离良好的斑块中心分离出来的;在无菌海水中悬浮的宿主细胞中富集;和扫描电子显微镜成像，如前所述[6］.观察到一系列的形态，如图所示6包括寄主内的小型可过滤形态（未成熟期和攻击期）和大型形态（蛭形体期）。因此，它们通过0.45的能力 μM过滤器取决于它们在生命周期中的阶段。偶尔观察到菌落周围的清除区域，这与菌落产生的抑制物质扩散有关。他们没有被算作Bacteriovorax斑块。对有代表性的样本进行测序表明它们是假交替单胞菌在本研究中没有观察到噬菌体代表的快速形成的斑块。

4.讨论

在一年的时间里，Bacteriovorax夏季在特拉华湾和冬季在墨西哥湾沿岸检测到了最高水平的放射性同位素。后一个发现一开始可能令人惊讶，因为弧菌在冬季的几个月里，这一水平通常非常低。然而Bacteriovorax已知对多种革兰氏阴性菌具有广泛的宿主特异性[9- - - - - -12].虽然this study concentrated on culturableBacteriovorax感染诉parahaemolyticus因此可以被称为弧菌食肉细菌(6，它将被期望Bacteriovorax可能捕食其他革兰氏阴性细菌弧菌科家庭,尤其是当弧菌水平很低。Bacteriovorax几乎全年从小容量(7.5 mL)海水中分离，不需要浓缩。应该认识到，上述计数代表可培养的数量Bacteriovorax0.45分 μm滤过的海水，可能少代表总数量Bacteriovorax在水中。数字6表示的相对大小Bacteriovorax相比,其弧菌parahaemolyticus宿主虽然处于不成熟和攻击阶段Bacteriovorax小到可以通过0.45吗μM滤波器，有相当数量的Bacteriovorax不可能;因此，在本文中表达的计数应该被认为是主要来自不成熟和攻击阶段的最小计数Bacteriovorax．更大的Bacteriovorax也就是说，那些在寄主细胞内成熟的蛭质体，或所谓的“独立寄主”菌株(偶尔长成细长链)，很容易被过滤掉。通过比较Bacteriovorax在过滤和未过滤的夏威夷海水中(见表2)，我们估计84%的Bacteriovorax在海水中无法通过0.45 μm过滤器。这突出了用过滤海水定量的缺点Bacteriovorax在文化相关的方法。不确定季节是否对不同的生命形式或大小有任何影响Bacteriovorax．

各种各样的存在Bacteriovorax在对chespeake Bay的一项研究中，一些系统类型(簇IV和V)是低至中盐度(河口)物种，而其他(簇IX和XII)是从中或高盐度位点恢复的[9，23］.本研究对13个样本进行序列分析，结果显示所有分离株均属于聚类IX、X、XI或XII(见表)1)，而不考虑分离株的来源。如前所述，从特拉华州盐度最低的位点(位点4)获得的四种测序分离物是IX、X或xii簇，这些簇通常与盐度较高的海水有关[23］.在目前的研究中，特拉华湾的三个地点或从夏威夷获得的海水的盐度没有大的偏差;然而，来自墨西哥湾海岸和特拉华湾4号站点的海水变化明显。当这两个地点的盐度最高时Bacteriovorax水平达到峰值（数字3 (d)和4(一)).我们证明了盐度和总盐度Bacteriovorax计数相关性很好()，但在盐度较高的特拉华湾(Delaware Bay)地点则不存在。与其他站点相比，站点4的盐度相对较低，且差异较大;因此，盐度与Bacteriovorax由于这条河流的盐度从未达到特拉华湾其他地区的高盐度水平，这个地点的盐度必须有所缓和。Pineiro等人在特拉华湾的低至中等盐度区域和附近的切萨皮克湾检测到簇IV和V [23］.我们没有在特拉华州或其他地方发现任何簇IV或V分离株，尽管这些簇被认为更多的是河口物种[9，23］.的部分原因可能是我们的抽样是非常有限的,不是phylotypes的综合分析,从新鲜的或低盐度的动态混合不同比例的水和海水涨潮期间在这些领域将不断改变phylotype概要文件。在特拉华湾，仅对系统类型IX、X、XI和XII进行鉴定，并不排除在许多未测序的系统类型中存在其他未检测到的系统类型Bacteriovorax都是在一年中列举出来的。

研究表明，牡蛎迁移到高盐度地区的现象减少了弧菌比在盐度较低的水域中饲养牡蛎的速度快[24，25］.高盐度继电器已被提出作为一种采后处理策略，以减少创伤弧菌在牡蛎中也被证明是有效的诉parahaemolyticus也(26］.高盐度增强的机制弧菌牡蛎的减少仍然不确定。我们最近假设，高盐度支持捕食性细菌的增殖，2007年至2009年北卡罗莱纳州的干旱条件可能是这种细菌明显消失的原因创伤弧菌海水及牡蛎[6，由Froelich等人报道[27］.除了盐度和温度之外的其他因素也可能会影响Bacteriovorax在快速变化的河口系统中，水位和系统类型包括由于风暴事件、洋流和风、径流、海水的物理和化学参数，以及可能靠近沼泽地、海滩、农田、森林或居民区或岩石海岸线而导致的流速急剧波动。

水体中营养物质和悬浮物的含量各不相同，重悬沉积物是常见的现象。在冬季,Bacteriovorax没有在切萨皮克湾的顶部或底部的水样本中发现，而是在这个时期从沉淀物中分离出来的[23］.这可能表明更多的Bacteriovorax在冬季和一年中的其他时间，沉积物中都存在这种物质；因此，沉积物再悬浮到水柱中可能会影响Bacteriovorax在水中检测到的水平。我们发现飓风桑迪一周后特拉华湾的海水含有最高的Bacteriovorax在特拉华水域检测到的可能是由于飓风使大量沉积物重新悬浮到水柱中。这些都是影响贝类生长区域和水平的因素Bacteriovorax在这些区域内。这些高度可变的因素的组合将使对环境中弧菌和其他细菌的捕食性相互作用的复杂性的全面识别变得复杂。

牡蛎和其他软体动物双壳贝类因从海水中过滤病原体和其他污染物而闻名，使贝类成为疾病的潜在来源。Bacteriovorax可能悬浮在海水中或附着在悬浮物上的物质可能是双壳贝类的食物来源，并可能集中在贝类体内，类似于病原体Bacteriovorax贝类组织内的定量尚未发展到今天;然而，我们假设Bacteriovorax贝类体内会继续寄生弧菌和其他潜在病原体，就像它们在海水中所做的那样，因此，当从这些地方获取贝类时，食用它们会更安全Bacteriovorax出现在更高的数字。我们以前的工作表明诉parahaemolyticus牡蛎和海水中的含量显著下降弧菌掠食性细菌在周围水域增加[6]。我们未来数年的目标是：（a）发展方法，以准确量化Bacteriovorax牡蛎组织内的水平，(b)决定了两者之间的关系Bacteriovorax和弧菌在海水和贝类中计数，(c)开发潜在的商业处理策略Bacteriovorax以减少贝类中的弧菌和其他潜在病原体。

致谢

作者要感谢美国弗吉尼亚海洋科学研究所的Corinne Audemard和美国农业部(USDA, ARS)的David Kingsley对本文进行了关键审查，鲍国平(USDA, ARS)对电子显微镜分析的协助，以及美国农业部(USDA, ARS)对序列分析的David Needleman。本研究由美国农业部、农业研究服务局(ARS)与特拉华大学的《58-1935-0-043具体合作协议》以及美国农业部、农业研究服务局的校内基金资助。提及商品名称或商业产品仅为提供具体信息的目的，并不构成美国农业部或美国食品和药物管理局的推荐或认可，它们是机会均等的提供者和雇主。

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