分类法和多相的碱性淀粉酶产生海洋放线菌链霉菌属rocheibts 1001

文摘

放线菌分离海洋沉积物东南海岸孟加拉湾淀粉分解的活动进行调查。海洋放线菌bts 1001年生产的碱性淀粉酶被确认从海洋沉积物Diviseema海岸,孟加拉湾。隔离产生碱性淀粉酶和淀粉分解的最大活动pH值9.5 50°C。生物体产生白色到浅灰色基内菌丝体和灰色气生菌丝体粉红色棕色色素沉着。形态的全面研究,生理参数、文化特征和生化研究。iso c的存在_15:0,anteiso-C_15:0,iso c_16:0,anteiso-C_17:0的主要细胞脂肪酸,LL-diaminopimelic酸特有的细胞壁成分,和甲基萘醌类MK-9H₍₆₎和MK-9H₍₈₎为最主要的类异戊二烯醌类是由于应变bts 1001属于属链霉菌属。16 s rRNA基因序列比较表明,应变bts 1001表现出最高的相似的类型链霉菌属rochei(99%),链霉菌属plicatus(99%)和链霉菌属enissocaesilis(99%)。使用多相分类方法和表型特征研究,1001年孤立bts描述为海洋放线菌链霉菌属rochei。

1。介绍

放线菌一直报告为依然重要化合物的重要来源。最近的焦点是对海洋放线菌作为生物活性化合物和工业酶的来源。这是由于这样的事实:陆生放线菌详尽分析了生物活性化合物和酶,但他们仍然达不到工业应用。因此,需要的时间是确定新来源的能力承受工业和商业应用的条件。一些研究人员的研究(1- - - - - -4]对海洋放线菌多样性和报道存在独特的海洋海洋沉积物的分类单元。生存在极端条件下的海洋沉积物表明他们的适应能力和生产不同类型的生物活性化合物相比于陆地上的(5]。已经建立了海洋放线菌作为丰富的小说等次生代谢物生物活性分子如抗生素、抗真菌、抗癌化合物、植物生长激素、工业重要的酶,酶抑制剂和颜料6,7]。文化独立的方法和多相方法也证明了海洋沉积物包含广泛的独特的微生物(5,8,9)生产天然代谢物。多相方法有助于确定属内物种的分类(10]。

α-Amylases (1, 4 -α-D-glucan glucanohydrolases提到过3.2.1.1)是最重要的工业用酶之一。他们坚持内部α1,4-glycosidic连杆在淀粉。他们的应用潜力和市场价值在各行业广泛探讨11,12]。碱性α-amylases有高催化效率和稳定的碱性pH值从9.0到11.0 (13)和淀粉水解淀粉高pH值条件下,纺织行业也作为洗涤剂原料用于自动洗碗机的洗洁精一样,洗衣店14,15]。由于低产量和稳定的碱性淀粉酶从野生型菌株,重组技术一直积极采用碱性淀粉酶产量的增产(15]。虽然土著碱性α-amylases大多报道从范围广泛的菌株16- - - - - -22链霉菌属),很少有研究报告。大多数淀粉酶报告链霉菌属sp.活跃在5.0 - -7.5的pH值范围,工业应用的局限性。到目前为止,只有有限的研究已经报道了碱性淀粉酶生产链霉菌属(22- - - - - -26]。孟加拉湾的海洋沉积物源(已被证明是一种高效的27在隔离的潜在物种新颖生物活性属性和工业应用。目前的研究主要集中在利用海洋沉积物作为孤立的来源和描述放线菌菌株能产生碱性淀粉酶适合工业生产。筛选和鉴定的研究导致了alkaliphilic和适度耐热性的海洋放线菌bts 1001株。应变股票相似链霉菌属rochei并产生耐热性的碱性淀粉酶。应变为特征的多相分类学研究的独特性和适用性工业酶的潜在来源。

2。材料和方法

2.1。收集海洋样品

收集海洋沉积物在孟加拉海湾的东南海岸,印度,在不同深度从50米到200米用取样器。沉积物被存储在无菌压缩塑料袋。土壤沉积物受到热预处理在50°C 60分钟海洋放线菌的分离。一克的土壤样本随后悬浮在无菌水和孵化28°C在150 rpm旋转瓶1小时。悬架是连续稀释10⁻⁷的水平。0.1毫升每个稀释镀在选择性的媒体如放线菌分离培养基,甘油酵母提取琼脂、淀粉酪蛋白琼脂和天冬酰胺葡萄糖琼脂。所有的媒体都准备使用50% (v / v)岁,过滤(0.20μ米)消毒海水;隔离媒体板块也补充了利福平5μ25 g / mL和制霉菌素μg / mL抑制细菌和真菌污染,分别。媒体的pH值维持在7.9。佩特里板块在28°C和孵化是观察到从一个星期到三个星期的放线菌菌落特征。

孤立的海洋放线菌被保持在淀粉酪蛋白琼脂和酵母提取物麦精琼脂偏与10%甘油。总共10海洋隔离选择深造的淀粉分解的活动。的抽样地点隔离表1。

2.2。筛查淀粉分解的海洋放线菌

降解能力的菌株进行淀粉酶1%琼脂板方法补充淀粉淀粉和水下文化研究。水下文化生产媒体包括(10.0 g / L)可溶性淀粉,2.0酵母提取物,0.5 MgSO₄0.5 MnSO₄1.0 KH₂阿宝₄,30氯化钠,0.02 FeSO₄和0.1 CaCl₂pH值为7.9。烧瓶内注射2% (v / v) 2.0×10的孢子悬浮液⁶孢子/毫升和孵化28°C在200 rpm旋转瓶96小时。

2.3。淀粉酶活性

淀粉酶活性决定的还原糖量释放淀粉水解(29日]。文化在8000转离心10分钟在4°C。合成细胞自由浮层用作粗酶。淀粉酶活性是通过添加0.5毫升粗酶化验0.5毫升的1%淀粉在50 mM Glycine-NaOH缓冲pH值9.5和孵化60°C,持续15分钟。反应停在添加1毫升DNS (3 5-dinitrosalicylic酸)。活动是由估计的解放还原糖的淀粉酶对淀粉和表达单位。(α淀粉酶活动被定义为一个单位的酶量版本1μ麦芽糖的g / mL / min在试验条件下)。

2.4。评估额外的细胞蛋白质

蛋白质的浓度估计的方法(30.),通过使用标准BSA溶液测量蛋白质含量。

2.5。多相活跃隔离bts 1001的描述

2.5.1。形态、文化、生化和生理

主动应变bts 1001年是属一级的特征通过观察空中孢子的颜色质量,扩散性的颜料,所述衬底菌丝色素(31日)和国际链霉菌属项目(ISP)。1001年应变bts的形态特征,包括spore-chain形态、孢子大小、和表面装饰,由扫描电镜(评估模型房子- 6610 LV;JEOL,美国)14 -和28-day-old文化准备ISP 2中。一系列的生理生化特征检测的标准协议(32- - - - - -34]。

2.5.2。Chemotaxonomic特征分析

文化是生长在TSB琼脂和细胞chemotaxonomic特征进行了分析。细胞壁氨基酸和糖类分离分析异构形式的二氨基庚二酸(35)和所有的有机体糖(36]。主要的膜相关甲基萘醌类是由建立协议(37,38]。脂肪酸提取、甲基化和分析GC使用标准方法[39,40),结果与脂肪酸数据库的微生物鉴定系统。

2.6。基因组DNA的隔离

协议进行DNA隔离之后根据[方法设计9用细微的修改。基因组DNA颗粒于200年解散μL的进一步分析和存储Tris-EDTA−20°C。

2.7。基于16 s rRNA序列的系统发育分析

16 s rRNA基因的PCR扩增和测序进行描述的李et al。41]。部分16 s rRNA基因序列(1529核苷酸)是用于搜索的基因库数据库爆炸算法(42),以确定相对系统的位置。最密切相关的多个比对序列放线菌和序列相似度计算进行了使用CLUSTAL X [43]。的系统发育树构建neighbor-joining和最大似然44]tree-making算法使用软件包PHYLIP version 3.69 [45和从树状视图46]。系统发育树的拓扑结构进行评估使用的引导重采样方法Felsenstein [471000复制。

2.7.1。基因库提交

16 s rRNA序列提交加入基因库的数字:JX284411。

3所示。结果

3.1。筛查淀粉分解的海洋放线菌

样品中筛选菌株,bts 1001显示出最高的活动淀粉琼脂板(图1)。进一步辅助检查证实的生产淀粉酶和结果图2。结果表明,隔离bts 1001表现出最大酶活力(391.45 U /毫升)其次是bts 101 (343.59 U /毫升)和bts 801 (340.17 U /毫升)在相同的条件下。

3.2。一般特征的活跃BTSS1001隔离

有氧、不动的、革兰氏阳性放线菌菌丝形式广泛支衬底和天线。气生菌丝体带有光滑螺旋孢子。孢子的平均直径约为0.9毫米。孢子链由10 - 12 /孢子链(图3)。应变bts生长良好媒体ISP 2, ISP 3、ISP 4, ISP 5 (30.),但不是在ISP 1和营养琼脂培养基32°C作为媒体成分无法支持生物体的生长,因为他们缺乏所需的矿物盐。薰衣草红褐色扩散性的颜料观察ISP 2, ISP 7,淀粉酪蛋白琼脂潜伏期的一个月。隔离BTSS1001白色到浅灰色底物形成菌丝和鼠标灰气生菌丝体与薰衣草色素淀粉酪蛋白琼脂板的特点链霉菌属sp。增长模式和文化特征在不同的ISP媒体给出了表2。

给出详细的菌株的生理生化性质在物种描述(表中3)。最孤立能够利用碳源除了鼠李糖。从糖酸生产只与葡萄糖和木糖是积极的。它无法转换所有其他糖类。隔离bts 1001显示了文化相似链霉菌属rochei但展览生化和生理特性的差异。隔离显示最优增长96小时的潜伏期(图4),在一个温度范围25-42°C(图5)(最佳35°C),在pH值8.0 - -10.5(图6)(最佳pH值9.0),3 - 10% (w / v)氯化钠(图7)(最佳7% w / v)。

3.3。Chemotaxonomic研究

细胞壁氨基酸、糖类、甲基萘醌类和脂肪酸成分的应变进行了分析。细胞壁的氨基酸是LL-diaminopimelic酸。未发现特征全细胞糖。甲基萘醌类和脂肪酸的分析显示主要的甲基萘醌类(类异戊二烯醌类)1001年bts应变MK-9 (H₆)和MK-9 (H₈)。脂肪酸概要显示iso-branched, anteiso-branched和饱和脂肪酸。主要的细胞脂肪酸被发现是iso c (14: 0) -8.37%;iso c (15: 0) -10.12%;anteiso-C (15: 0) -23.84%;iso c (16: 0) -22.28%;C (16: 0) -6.02%, anteiso-C (17: 0) -6.49%。菌株在微生物沉积类型文化收集和基因库(MTCC),印度,MTCC 36855。

3.4。1001年应变bts分子分类

爆炸的结果接近完成16 s rRNA基因序列(平均1529个核苷酸)的应变bts 1001基因库数据库中序列显示的同源性99%成员的家庭链霉菌科。爆炸的结果给相似性匹配链霉菌属rochei(99.00%),链霉菌属plicatus(99.00%),链霉菌属olivaceus(99.00%)和链霉菌属enissocaesilis(99.00%)。高度相似的序列的多个对齐clustal X和最大吝啬研究生成引导值用于构建系统发育树。生成的系统发育树显示,最亲密的邻居分支链霉菌属rochei173260年,(加入资源库。EU593730.1),隔离来自新疆,中国80%的引导价值。压力还显示分支与64%引导价值链霉菌属enissocaesilisHUMB 174552,链霉菌属plicatusNBRC 13071和其他的报道链霉菌属rochei。系统发育树(图81001年bts) 16 s rRNA序列表明属下的隔离放置链霉菌属和放置接近链霉菌属rochei。

4所示。Disscussion

海洋放线菌的多样性是重要的科学和医学在一些地区9]。他们是化学的丰富多样的生物活性化合物(48]。研究海洋沉积物链霉菌属作为潜在的生产者淀粉分解的酶。最大的海洋隔离产生淀粉酶酶活动9.5 pH值和温度50°C。类似的活动是热稳定的水平,碱性细菌淀粉酶、贷出隔离链霉菌属rochei作为一个潜在的微生物生产碱性淀粉酶高温度和pH值的应用程序所必需的。在更高的温度下酶的功能改善淀粉的溶解度,降低了粘度、限制微生物污染物,减少反应时间(49]。

多相的方法在描述孤立启用识别生物物种水平。色素沉淀的文化特征、菌落形态和孢子形态放置家庭链霉菌科的应变。的细胞壁糖、甲基萘醌类和脂肪酸剖面下的生物属链霉菌属。生物体表现出相似的形态链霉菌属rochei(伯杰et al . 1953年)(28]。完整的理化和生物化学特性和16 s rRNA基因序列的分析支持。此外,16 s rRNA基因分析和系统发育研究显示三种不同物种的同源性链霉菌属rochei,链霉菌属plicatus,链霉菌属enissocaesilis。基于多相的方法,被认为是链霉菌属rochei。的意义是孤立的研究显示不同的需求相比链霉菌属rochei(伯杰et al . 1953年)(28)和其他报告菌株。海洋应变增长所需的嗜中温37°C条件按照(威廉姆斯et al。) [34放线菌表现为嗜温菌。8.0 - -10.0的一个碱性条件适合生长和酶生产。碱性环境对经济增长和酶生产的偏好可能归因于海洋环境在源头,因此从陆地上的分歧。中度嗜盐的海洋生物生长在氯化钠浓度从5到20%。隔离bts 1001显示耐盐9%,最佳为7%,因此它可以被放置在中度耐盐嗜盐的集团和盐公差表示应变作为本土海洋物种。生物特征作为alkaliphilic,中度耐盐放线菌链霉菌属rochei。研究海洋放线菌的主要目标是由于这样的事实:海洋生物的微生物多样性也显示了化学多样性。我们从这个研究,建立海洋物种多样性从陆地上和展示代谢物也将显示在结构和功能的多样性。这是第一个研究报告到目前为止对碱性淀粉酶生产链霉菌属rochei孤立的从海洋沉积物。酶的活动水平和碱性性质显示承诺在各种工业应用范围。隔离的特征是建立本土海洋隔离的性质和范围的海洋沉积物作为一个丰富的淀粉分解的放线菌。进一步表征研究碱性淀粉酶对媒体进行优化研究,评价酶新奇和蛋白质结构说明。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

阿帕纳Acharyabhatta谢谢DST钱包项目的高级分析实验室,安得拉邦大学的扫描电子显微镜图像和l . Bullayya大学博士,维萨卡帕特南提供的设施。

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