分子微生物学中的多目标检测

摘要

与传统的基于培养的诊断方法相比，PCR检测的优点包括明显更高的敏感性和更短的周转时间。当病人已经开始治疗，或标本中可能含有生长缓慢、难以培养或没有培养方法的微生物时，它们特别有用。然而，由于基因组的变异性，单靶点检测可能导致假阴性结果。本文着重从我们自己的经验和文献的例子，以提供深入了解单一靶点检测在分子生物学的局限性。从这些经验中吸取的教训包括仔细设计诊断化验，最好是多目标的，详细调查感染发生率和流行病学的重要性，经常参与适当的质量保证计划，以及当研究人员面对不一致的结果时，持续关注的重要性。总之，微生物分子分析中的多目标检测应该是一条规则。

1.介绍

分子方法的引入在诊断微生物学的许多领域都产生了积极的影响。已证明，这些测试通常比传统测试更敏感和具体，并且它们对于可能含有挑剔、生长缓慢或无法培养的微生物的标本或当患者治疗失败时特别有用此外，基于遗传特征的鉴定比传统表型特征的解释更为客观。

商业或内部分子分析的发展始于对当前文献的回顾。这提供了有关先前研究中使用的靶基因选择、潜在的特异性或敏感性问题以及具有临床重要性的额外信息（如截止值）的信息如可行，病原体的所有已知亚型或其他已知序列变体（突变、插入、缺失等）应包括在特异性试验中[1.]．一旦选择了合适的靶标，就可以设计引物和探针。

然而，由于基因组的变异性，单靶点检测可能导致假阴性结果。事实上，今天存在着许多变种，但并非所有变种都是已知的，而且根据不断出现的达尔文进化论，新变种不断出现。

本文侧重于我们自己的经验和文献中的示例，以深入了解单目标测试如何导致假阴性结果，以及未来需要考虑的重要教训。

2.来自我们自身经验的例子

1996年，当我们的临床实验室扩大到分子部门时，很少有商业化验存在。开发了内部测试，首先使用经典PCR(凝胶电泳)，然后是实时PCR (Q-PCR)。由于我们所有的测试都有相同的工作流程，所以我们选择继续进行内部测试，而不是切换到商业平台。所有的分子检测都经过了广泛的验证，实验室自2008年9月以来获得了ISO15189认证。但是，我们已经发现了不少单靶检测出现假阴性的情况。

我们报告了一例脊柱椎间盘炎的原因牛结核分枝杆菌，由于缺乏IS，诊断很复杂6110[2.]．核酸扩增试验（Naats）具有提供快速，敏感和特异性诊断测定的潜力结核分枝杆菌临床标本中的复合体，因为它们具有比酸快染色更高的敏感性，并且比培养更快。大多数（商业）测定基于插入序列6110(是6110)因为专一性结核分枝杆菌复杂和多拷贝数。然而，在某些菌株中报告了完全没有或仅存在该序列的几份，特别是那些在东南亚循环的菌株。大量的临床分离株结核分枝杆菌南印度复杂的复杂有一个副本（40％）或没有副本（4％）是6110，从而表明需要掺入额外的靶位点以改善检测。巴兰等人。最近评估了组合两个引物对的双目标PCR诊断测定（是6110和继续_4.)提高了测试灵敏度[3.]．

在我们的病例中，活检的Ziehl-Neelsen染色抗酸杆菌阳性;然而，PCR检测结核分枝杆菌基于IS的综合体61105周后，抗酸杆菌仅在Löwenstein Jensen上生长。PCR检测结核分枝杆菌基于IS的综合体611016S rDNA和rpoB测序结果与结核分枝杆菌复杂。本研究采用多重PCR技术，在基因组中缺失一个12.7 kb的DNA片段牛分枝杆菌相比结核分枝杆菌将菌株鉴定为牛分枝杆菌.据我们所知，这是第一次分离出牛分枝杆菌缺乏应变是不可能的6110在欧洲呈报[2.]．

以核蛋白(NP-)基因为靶基因的Q-PCR检测人呼吸道合胞病毒(hRSV)始于2004年。聚合酶链反应技术被证明比抗原检测更敏感[4.]2006年秋季，发现了几个经Q-PCR呈阴性的hRSV抗原阳性样本（Respistrip，Coris Bioconcept）[5.].对5个hRSV Ag阳性Q-PCR阴性hRSV变异体的扩增产物进行测序分析，结果显示序列相同。它们都有4个突变位于Q-PCR中使用的探针的结合位点。NP基因被认为是hRSV较为保守的基因之一，对其进行BLAST分析表明，GenBank（2006年11月）中不存在“新的”hRSV变异序列。

2009年8月，我们收到了乙型肝炎病毒（HBV）PCR分析样本。患者HBsAg血清学呈强阳性；而Q-PCR为阴性。琼脂糖凝胶电泳显示存在扩增产物，这表明检测问题与探针有关。样本被送往另一个实验室，在那里Q-PCR对高病毒载量的HBV呈阳性。进行序列分析，确认探针结合位点发生突变。正向引物有1个错配，反向引物有2个错配，但这些错配位于引物的中心，被认为对结合的影响最小，这解释了为什么Q-PCR产物在电泳上是明显的。MGB探针在第四个5′核苷酸上显示1个错配（c/t）。由于MGB探针的结合对错配非常敏感，并且探针在5′端的结合对Taq聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性非常重要，因此该突变可以解释假阴性结果。为了避免将来发生此类病例，开发了双靶点PCR分析。

2010年夏季，脑脊液肠道病毒阳性率较高。然而，一些脑脊液样本含有高的白细胞计数，但在细菌培养和肠道病毒Q-PCR检测中均为阴性[6.]．对于一个临床高度怀疑的样本，使用其他引物但相同探针进行第二次Q-PCR [7.]，产生一个较大的扩增产物，其中包含原始第一个Q-PCR中使用的引物的结合位点。第二个PCR呈阳性（CT 32.85）。为了研究第一个PCR的引物结合位点是否存在突变，对第二个Q-PCR的扩增产物进行了测序。3′端的错配（a→G）在第一个Q-PCR的一个引物中发现了一个。BLAST分析（NCBI）显示，这种突变非常罕见，因为只发现了9个匹配。到那时为止，对每个样本都进行了两次Q-PCR分析。

在2012-2013年流感季节，我们发现A型流感（InfA；31%）阳性样本少于B型流感（InfB；69%）阳性样本。在国家流行病学数据中，观察到相反的情况：甲型流感多于乙型流感（数据未公布）。为了调查可能的原因，使用我们的内部PCR对从另一个实验室获得的几个InfA阳性样本进行了分析。对于InfA H3N2阳性样本，也发现了类似的结果，但通过我们的内部PCR，InfA H1N1阳性样本仅为每周阳性或假阴性。随后，使用CDC推荐的引物对这些样本进行分析[8.]，对INFA H3N2和H1N1的正确结果。对假阴性样品的RNA提取物进行循环测序。在3'末端的位置3中发现了我们内部引物中的不匹配（C / T），这导致引物的结合差。CDC推荐的相应引物在位置11上具有相同的不匹配，对引物的结合没有影响。设计并验证了新的双重目标内部PCR分析。

3.文献中的例子

3.1.沙眼衣原体

沙眼衣原体菌株携带7500 bp隐匿质粒。该质粒存在4-8个拷贝，因此，是一个有吸引力的靶点沙眼衣原体2006年，一种新的沙眼衣原体(nvCT)已被Ripa及Nilsson识别[9,10].他们观察到该指数意外下降了25%沙眼衣原体发病率在瑞典哈兰县。因此，他们使用常规诊断系统(Abbott m2000 real-time PCR;Abbott Laboratories, IL, USA)与Artus并行沙眼衣原体PCR（Artus，汉堡，德国），其靶向基因组IMA基因，而不是隐秘的质粒。仅鉴定13％的样品，仅鉴定为ARTUS PCR阳性。

这些样本包含一个突变株(nvCT)，其特征是在多拷贝隐质粒的ORF-1中有377 bp的缺失，包括Roche和Abbott的靶区沙眼衣原体NAAT在当时是可用的。罗氏和雅培检测均未能检测到nvCT，导致数千例诊断失败，并产生假阴性报告，导致许多患者未经治疗[11]．

当前可用的新设计dual-target化验雅培实时CT / NG(2008年1月)目标的另一个神秘的质粒序列除了序列影响nvCT删除和罗氏COBAS TaqMan CT v2.0(2008年6月)检测染色体ompA除了基因序列的影响nvCT删除。迄今为止，在北欧国家以外只报告了零星病例。然而,当前关于知识的存在和流行nvCT在其他国家是有限的为数不多的研究中,由于一个事实:许多欧洲实验室仍然可以不检测nvCT,和那些可以检测nvCT不使用nvCT-specific或其他区分NAATs [12]．

3.2.淋病奈瑟氏菌

淋球菌孔伪基因是室内常用的靶点淋病奈瑟氏菌PCR方法。Whiley等人的一项研究[13]呈现n球菌Porin a伪果（Pora）PCR假阴性结果是通过横向遗传交换和重组所需的脑膜炎球菌泊序列的存在引起的。为了n球菌，该物种由许多亚型组成，这些亚型具有相当大的序列多样性和突变倾向，这一事实加剧了该问题。值得注意的是，亚型的分布可能在地理、时间和患者群体之间有所不同。因此，由于存在f不同的亚型；第二，与本例一样，由于新菌株的输入或当前流行菌株的突变，给定人群中的表现可能会突然改变。

3.３．Neisseria Meningitidis.

由于越来越多地使用入院前抗生素，在许多国家观察到一些培养阴性脑膜炎球菌病病例。因此，PCR检测脑膜炎球菌DNA被广泛应用于疑似脑膜炎球菌性脑膜炎和脑脊液培养阴性的患者。Cavrini等人[14报道了两个分离株的多个核苷酸替换Neisseria Meningitidis.血清组C导致假阴性检测，实时PCR针对ctrA基因。Jaton等人也遇到了类似的问题[15]与临床分离的脑膜炎双球菌针对ctrA基因的实时PCR未检测到B血清群。

3.4。JC病毒（JCV）（人聚瘤）

Landry等人发表了一例进展迅速、致命的神经系统疾病的年轻母亲，其脑脊液(CSF) JCV DNA PCR在参比实验室呈假阴性。最终，脑活检确定了进行性多灶性脑白质病变(PML)的诊断。重复PCR检测同一脑脊液针对不同的基因组区域产生了高度阳性结果。这再次强调，由于基因组的变异性，尽管病毒水平很高，但仍可获得假阴性PCR结果[16]．

3.5.人体免疫机能丧失病毒（艾滋病毒）

Debyser等人报告了一例非洲裔免疫缺陷孕妇HIV-1感染患者未经抗逆转录病毒治疗而无法检测到病毒载量的差异性观察结果[17]．尽管该患者的肺结核和CD4细胞计数较低，但Amplicor监测(罗氏诊断公司，巴塞尔，瑞士)和NASBA检测(Organon Teknika, Boxtel，荷兰)的病毒载量检测均未发现可检测到的RNA水平。患者血浆中存在HIV-1 RNA，通过内部RT-PCR证实。随后用支链DNA方法对HIV-1 RNA进行定量分析，结果显示为高病毒血症。gag基因的DNA序列分析发现了一个G亚型HIV-1毒株(HIV-1BL)。这说明，在HIV-1中观察到的遗传多样性，除了抗逆转录病毒疗法的选择压力引起的病毒群体的潜在变化之外，可能会影响使用“单引物对”技术时的检测或病毒载量量化。

3.6。流感病毒

通过xTAG呼吸道病毒小组(Luminex Molecular Diagnostics, Toronto, Canada) fda通过的检测方法，发现2011年2月流行的季节性H3N2毒株检测灵敏度下降[18]．在带有阳性基质信号的样本中未检测到H1和H3亚型，最初被认为表明了大流行亚型，正如许多使用这种保守和亚型目标组合的实验室的情况一样。然而，这种H1/H3信号的缺失随后被发现是H3N2菌株突变的结果，导致检测失败。

2011年4月，在新加坡对一名有呼吸道症状的3岁男童进行诊断测试时，发现一种新的B型流感变异[19].从培养物中分离出InfB病毒，并通过标准免疫荧光试验进行确认，但未通过针对核蛋白（NP）的常规内部流感筛查RT-PCR试验进行检测随后的测序研究表明，其他一些已发表的针对NP的分析也可能无法检测到这种新的变体。

事实上，由于流感病毒基因组的持续漂移和重组的高潜力，不仅在不同亚型之间，而且在任何给定时间传播的流感病毒的不同谱系之间，可靠的诊断可能是具有挑战性的。即使使用保守靶标也不会对漂移免疫，有几项研究显示，甲型H1N1流感大流行后的几个月内，流感病毒内部保守基因的突变积累[20,21]．

4.讨论

与传统的基于培养的诊断方法相比，PCR检测的优点包括明显更高的敏感性和更短的周转时间。当病人已经开始治疗，或标本中可能含有生长缓慢、难以培养或没有培养方法的微生物时，它们特别有用。此外，基因型试验的解释通常不如对常规表型特征的解释往往往往取决于实验室技术人员的经验的主观。基于PCR的测定的额外有价值的特征包括（i）同时测试几种靶标的能力（从而提供类型和亚型信息），检测具有重叠季节性的其他微生物，并检测繁殖;（ii）使用具有测试大型样品数量的自动化和高吞吐量平台和需要最低技术人员时间的能力来实现的能力;（iii）能够快速调整以检测新的目标。

然而，这些大量假阴性结果的例子突出了与单靶点分析相关的潜在问题，这些分析无法充分识别和/或量化遗传差异菌株。此外，可能低估了这些假阴性结果，因为没有检测到所有这些病例。In瑞典变体的情况沙眼衣原体在美国，这一发现基于流行病学数据的变化。在其他情况下，这是一个具有启发性的临床背景或通过替代检测获得的阳性检测结果，推动了对假阴性结果的进一步调查和检测。

由于这些例子，我们实验室决定逐步用多靶点分析取代所有单靶点试验。显然，选择合适的靶基因是至关重要的。应该包括对微生物生存至关重要的高度保守基因。可能包括高拷贝数的基因以获得adequate敏感性。我们的分析进行定期评估，例如BLAST分析，以筛选最近和当前传播的不同菌株。此外，定期将流行病学数据与国家监测数据进行比较，以检测性能特征的任何变化。

与商业测定相比，内部测试具有一些（理论）优势。由于用户设计了测试，因此问题的原因可以更快地识别。对于商业测定，设计不众所周知，并且在与制造商联系之前，实验室将首先重复测试（例如，例如，具有不同的许多试剂）。内部测试的另一个优点是灵活性。当发现假阴性结果时，可以“轻松”切换到另一个目标，或添加附加目标。实际上，任何给定的诊断系统的重要属性是能够快速调整以提供对新变体的特定检测的能力。商业测定需要更多的时间来纠正当前的缺点。此外，只有少数商业测定基于检测一个生物的多个靶标。

另一方面，内部开发需要更多的专业知识和资源。更多的over, not all laboratory-developed assays are as thoroughly validated by individual laboratories as required by official instances (e.g., FDA), and evaluation of a small number of strains and/or small number of clinical samples may fail to bring about important performance characteristics. Also, studies have demonstrated that there is significant variation in the ability of in-house assays among clinical laboratories to reliably detect infectious agents [22,23]．相比之下，商业测定通常在大量和多中心设置上验证。

分子诊断方法通常用于根据何时和如何治疗患者以及监测治疗方案的有效性和识别可能影响长期治疗计划的潜在耐药菌株来做出临床决定。因此，对实验室服务提供给临床医生的结果的可靠性有信心对病人的治疗是至关重要的。因此，适当的质量保证和质量控制措施对于确保实验室方法和服务符合国家和国际各级必要的监管要求非常重要。

频繁参与独立机构组织的适当质量保证计划已被反复证明是有价值的外部质量控制措施。除了评估诊断性能（分析敏感性和特异性）外在各个实验室使用的不同分析中，结果的统计分析提供了商业或内部NAAT技术的实际快照，用于检测参与者中的特定病原体。在这种情况下，至关重要的是，所有相关的循环菌株迟早都应d.为确保对可能发生巨大变化的生物体（例如流感病毒）进行正确诊断，最好在每个季节开始时，由参考实验室和/或公共机构组织一组循环菌株进行年度分配。这可能是ex内部质量控制方案比检测低拷贝数的病原体更重要，这是当今的重点。

值得注意的是微阵列分析的出现，它具有同时检测和鉴定数千个微生物基因的前所未有的潜力。尽管仍需要改进，以使大多数微阵列应用程序能够适应临床微生物实验室，但这些稳健的技术在诊断微生物学中的未来作用是无可争议的[24]．

5.结论

从这些经验中吸取的教训包括仔细设计诊断分析，最好是多目标的，详细调查感染发生率和流行病学的重要性，经常参与适当的质量保证计划，以及调查人员在面对不一致的结果时持续关注的重要性。在地方一级，使用分子技术的诊断实验室有必要不断警惕出现变异的可能性，这些变异可能会降低其一线筛查分析的敏感性。此外，本报告强调了诊断实验室需要对其自身的循环菌株群体进行室内或商业分析。对于实验室开发的分析，应相应地调整引物和探针，以便将诊断失误的风险降至最低。

对于商业检测，制造商应该尽可能详细地描述目标区域。

此外，从公共卫生的角度来看，世界各地的诊断和研究实验室必须不断更新和共享公共数据库中(可能是新的)细菌和病毒的基因序列。这使得制造商和实验室能够开发和更新针对新变异的诊断分析方法，并评估其敏感性和特异性，也就是说，将上传的可用序列与引物/探针序列进行多序列比对。

临床医生和实验室都必须认识到PCR的局限性，因为误导性的结果可能会产生严重后果。实验室应警惕这种可能性，并鼓励临床医生对漏诊提供反馈。如果怀疑仍然很高，临床医生应与实验室沟通，并针对应在基因组的不同区域进行检测。结果（阳性和阴性）应始终在该区域存在的循环菌株、临床怀疑程度、疾病严重程度和疑似感染患者并发症风险的更广泛背景下进行解释。

因为所有的生物都有进化的倾向，即使是非常保守的基因也容易发生突变(达尔文从不睡觉!)，所以分子技术的漏诊率可能被低估了。

总之，微生物分子分析中的多目标检测应该是一条规则。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

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