文摘
抗生素耐药性的选择复方磺胺甲恶唑预防评估,我们复方磺胺甲恶唑抗性机制的特点变形链球菌和链球菌sobrinus。在体外易感性6抗生素是评估在64变形链球菌组(味精)隔离从复方磺胺甲恶唑预防治疗组和比84年味精隔离nonprophylaxis组。的folA和folP基因测序在NCBI并与参考序列。只有耐复方磺胺甲恶唑预防组显著升高(54.7%比15.5%,,95%置信区间CI: 2.89 - -15.3,)。耐阿莫西林、头孢曲松钠、氯霉素、红霉素和四环素为1.4%,25.5%,6.2%,6.5%,和29.6%的分离,分别。相当大的多态性被发现的folP基因变异链球菌,但这不能与磺酰胺耐药性有关。没有出现变化folP或folA基因的美国sobrinus。叶酸的基因转移途径在这些分离株基因似乎是不可能的。
1。介绍
的变形链球菌组(MSG)属于草绿色组链球菌(vg)和重要组成部分的正常口腔菌群(1,2]。虽然vg通常是不致病的,他们已引起关注,因为它们能够充当抗生素抗性基因,将这些麻烦的特征包括经典致病性细菌链球菌引起的肺炎和酿脓链球菌(3]。而许多最近的研究(4,5)调查了vg各种抗菌药物的敏感性模式,只有少数研究[6]报道抗菌素的敏感性vg来自撒哈拉以南非洲尽管抗生素滥用该地区普遍存在(7]。更具体地说,它已被观察到,复方磺胺甲恶唑(SXT)预防选择抵抗感染链球菌(8,9]。然而,信息的影响SXT预防共生的细菌而不是药物靶点仍然稀缺,特别是在撒哈拉以南非洲地区轴承人类免疫缺陷病毒感染的沉重的负担/获得性免疫缺陷综合症(艾滋病),大部分的病人经常采取SXT作为预防耶氏肺孢子菌肺炎。
味精包括七种变形链球菌和链球菌sobrinus感染人群(10]。的主要病原体龋齿(蛀牙)和相关牙原性的化脓性感染,味精是通常被称为生龋齿的细菌(11]。他们也卷入造成extra-oral感染,特别是亚急性细菌性心内膜炎患者的缺陷或人工心脏瓣膜12,13]。评估抗生素敏感性和性格化的抵抗机制的味精是越来越重要,不仅因为这些细菌是牙科和严重的extra-oral感染的主要原因,还因为他们可以携带和抗生素抗性基因转移到典型致病微生物(14]。此外,据我们所知的机制变形链球菌和链球菌sobrinus复方磺胺甲恶唑没有阻力的特征。
这里,我们已经评估选择的抗生素耐药性SXT预防的机制和特征变形链球菌和链球菌sobrinusSXT阻力。病人的唾液细菌隔绝的姆拉戈医院参加牙科诊所和艾滋病支持组织塔索(TASO)()诊所在坎帕拉,乌干达。
2。方法
2.1。研究领域
塔索(TASO)本研究开展的姆拉戈医院诊所和牙科诊所位于坎帕拉乌干达。TASO非政府艾滋病毒/艾滋病保健诊所,参加每日大约100病人定期将SXT作为预防。姆拉戈医院是全国转诊医院。它有一个牙科诊所,每日提供约50名门诊病人的治疗艾滋病毒sero-status是不确定的,而不是以SXT为预防。
2.2。研究设计和主题
这是一个横断面研究的患者塔索(TASO)从诊所的人经常以SXT为预防(预防组),另一组的病人姆拉戈牙科诊所从没有以SXT为预防(nonprophylaxis组)。增加隔离味精的机会,患者选择条件,他们至少有一个牙齿龋齿通过临床检查证实。人口统计数据和信息在使用抗生素之前三个月从患者获得面试和医疗记录。
2.3。道德的考虑
同意开展本研究获得Makerere大学医学院的研究和伦理委员会和乌干达国家科学技术理事会。书面同意从每项研究课题寻求并获得符合赫尔辛基宣言有关人类被试的行为研究[15]。
2.4。微生物过程和抗生素耐药性
所有选定的患者()捐赠的唾液标本进行研究。至少1 h患者的餐后,2毫升唾液收集在一个无菌猎鹰管(Sarstedt、奥地利),和1 h内收集、标本运输生物化学系,Makerere大学健康科学学院进行分析。每个标本稀释1:100年生理盐水(美国Chemtrec)和100年μL稀释的样本在盘子里包含修改HLR-S培养基培养(16味精的选择性分离。板块在37°C孵化48 h在大气中5%的二氧化碳。味精被假定的殖民地之一,有巧克力琼脂板(BioMerieux、法国),补充5%绵羊血液和polyvitex (BioMerieux、法国)。巧克力琼脂的殖民地被形态、革兰氏染色法,红血球溶解在血琼脂培养基(BioMerieux、法国),过氧化氢酶试验,对奥普托欣(2]。随后分化的细菌是由生化测试(2,17),经聚合酶链反应(PCR)的PCR糖基转移酶(gtf)基因10]。确认后由PCR细菌物种,对阿莫西林、复方是评估使用以及(AB Biodisk、瑞典)而对头孢曲松钠、红霉素、四环素和氯霉素评估了科比鲍尔盘扩散法(BioMerieux、法国)18]。链球菌的破发点标准以外的其他物种链球菌引起的肺炎建立的CLSI [18)被用于所有的抗生素研究除了复方磺胺甲恶唑的破发点建立的瑞典参考集团抗生素(19]。
2.5。脱氧核糖核酸提取
隔离的味精在37°C孵化12 h巧克力琼脂。细菌从一个殖民地在Trypticase resuspended酱油汤(BioMerieux、法国),在37°C孵化24小时在大气中5%的二氧化碳。从培养细菌的DNA链球菌当时向导的使用修改后的协议基因组DNA提取净化设备(美国Promega)。
2.6。聚合酶链反应的物种鉴定
中使用的引物序列PCR证实细菌物种如前所述[10]。在这个过程中,DNA片段(517个基点)gtfB基因的变形链球菌或更长的片段(712个基点)gtfI基因的链球菌sobrinus被放大。简单地说,每一个PCR 20的混合物μL包含DreamTaq绿色缓冲(Fermentas,立陶宛),100年μ米每个dATP dTTP、dGTP dCTP, 0.5μM寡核苷酸引物(GTFB-F, - r和GTFI-F - r), 1.25 U DreamTaq聚合酶(Fermentas,立陶宛)和0.5 1毫微克的模板DNA。
变性的PCR条件由30个周期在95°C 30年代,退火在59°C 30年代,在72°C和扩展了1分钟。扩大产品在0.8%琼脂糖凝胶电泳分离(σ,比利时)和溴化乙锭染色(英国BDH)。
2.7。统计分析
数据分析使用社会科学统计软件包Inc .(12.0版Windows,芝加哥,美国)。频率分布是用来描述材料。因变量(SXT预防使用)归类为1 =是,2 =否。二元逻辑回归分析被用来估计的大小的风险预防细菌耐药性发展中,nonprophylaxis组。周围的95%置信区间是生成的所有优势比(或)来确定预测变量的重要性。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。
2.8。序列分析
DNA的分离使用BigDye终结者贴上周期序列测序工具包(应用生物系统公司)和ABI棱镜310基因分析仪(应用生物系统公司)在瑞典乌普萨拉大学。引物用于DNA扩增和测序反应表中列出1。的结果folA和folP基因序列分析与数据库序列变异链球菌飞往洛杉机的联合航空159班机(20.]和NN2025 [21使用爆炸计划在NCBI]。此外,folP基因分离的797年相比,许多生物使用多重序列比对程序clustalW欧洲生物信息学研究所的数据库。
2.9。克隆的folP从797年菌株基因
与大多数特征点突变进一步隔离797。的folP基因的菌株797放大使用底漆MdhpsSph和MdhpsBam(表1)限制性内切酶识别序列Sph我和Bam嗨,被改造成正向和反向扩增引物,分别。结果PCR产品消化与这两个向量pUC19酶质粒一起。结扎后PCR产品和向量使用快速结扎工具包(Fermentas,立陶宛),由此产生的质粒被用来改变主管细胞大肠杆菌DH5α。质粒验证后建设、引入大肠杆菌淘汰赛应变C600ΔfolP(22]。
2.10。克隆和测序folP基因链球菌sobrinus
没有完整的基因组序列美国sobrinus可用,但序列密切相关的物种呢美国downei最近被添加到数据库中。因此,引物设计匹配美国downei序列如表所示1。PCR进行的退火温度45°C;否则,PCR条件如前所述。测序反应和分析如前所述。
2.11。甲氧苄氨嘧啶耐药变异的选择变形链球菌菌株797
当在实验室里培养,变异链球菌菌株797显示稳定的抗磺胺甲恶唑,但对甲氧苄氨嘧啶(tp)。压力在Isosensitest肉汤培养(ISB)(英国Oxoid)与低浓度(2μtp的g / mL),增长非常弱。从这种文化,包含ISB 5细菌接种成管状μ克/毫升的tp和从这个文化随后reinoculated与10的特色μtp的g / mL。从后者的两种文化,细菌被飞跑到Isosensitest琼脂(ISA)板(英国Oxoid)包含10μtp的g / mL。两管生长细菌的选择性盘子和被称为797 (5),797 (10)。
2.12。竞争实验
细菌菌株797(10),797人接种2毫升的脑心浸液(BHI) (BioMerieux、法国)以下比例:管1,100μL 797 (10);管2,10μL 797 + 90 (10)μL 797年;管3、50μL 797 (10) + 50μL 797年;管90μL 797 (10) + 10μL 797年;和管5,100年μL 797年。此外,100年μL 797(10)和797年的10倍稀释扩散在ISA板块(英国Oxoid)为了获得个人殖民地,这是识别最初的比例计算。
五个文化在一夜之间被孵化在37°C公司5%2的气氛。在6小时间隔:0,6、12、18、24小时,10μL的细菌被每个试管和稀释100倍的BHI肉汤(BioMerieux、法国)。一百年μL稀释被传播的ISA板块(英国Oxoid)和隔夜在37度5%孵化有限公司2的气氛。第二天,个别殖民地和接种ISA板块(英国Oxoid)和甲氧苄氨嘧啶10μ克/毫升。这个实验做了三次的平均值的比例对易感殖民地种植在ISA板块与时间计算和绘制。
3所示。结果
3.1。抗生素耐药性的模式预防组()
基于文化和gtf基因分型,31.4%病人的标本有味精菌株。36(56%)的菌株变异链球菌和28 (44%)美国sobrinus。没有统计上显著的差异之间的各种抗生素的耐药模式美国sobrinus和变异链球菌 ;因此,数据池。复方磺胺甲恶唑显示电阻(54.7%)最高,而阿莫西林耐药性最低(1.6%,表2)。发展中抵抗SXT的风险预防组nonprophylaxis组的6.59倍(、表2)。对其他抗生素,没有明显的电阻率差异这两个学习小组。风险发展的多药耐药性(MDR),也就是说,阻力超过2药物预防组,nonprophylaxis组的1.42倍。然而,差异没有统计学意义(95%置信区间:0.55—-3.71,表3)。单个组件的基础上SXT(磺胺甲恶唑和甲氧苄氨嘧啶),大多数(95%)的隔离预防组显示抗磺胺甲恶唑,而61%的阻力是对甲氧苄氨嘧啶。
3.2。抗生素耐药性Nonprophylaxis组模式
nonprophylaxis组51%的患者有积极的味精的细菌生长。根据gtf37岁的基因分型(43%)的菌株变形链球菌47 (54%)链球菌sobrinus而3(3.4%)包含两个物种的标本。最普遍的阻力与四环素(35.7%),而阻力最小与红霉素(3.6%,表被发现2)。抵抗复方磺胺甲恶唑nonprophylaxis组为15.5%。Coresistance隔离不同的抗生素如表所示3。总的来说,MDR在nonprophylaxis标本的14%。
3.3。的决心folA序列在敏感和耐药隔离
序列的分析folA基因变异链球菌数据库序列UA159和NN2025相比并没有发现点突变的易感性地位无论压力。一个隔离,797年,被选为更详细的分析。它原本孤立的甲氧苄氨嘧啶(tp)耐药菌株但失去了抵抗在接种的实验室。进一步应用甲氧苄氨嘧啶选择性压力应变在实验室中导致其耐甲氧苄氨嘧啶的快速发展。当两个实验室分离797(5),797(10)派生和选择在5μg / mL和10μ甲氧苄氨嘧啶的g / mL,分别的核苷酸序列thyA一个基因编码一个假定的运输车,folA基因测定包括上游序列thyA,但没有单核苷酸变化是发现在这一地区。基于lab-derived tp 797年竞争实验与原来的耐药菌株,tp敏感隔离797被发现更适合耐tp 797(10)(图1)。tp敏感隔离超越的耐药菌株在24小时内即使添加少数比例。
3.4。的决心folP序列
序列的分析folP797显示四个点突变基因在位置命名的V, E 80 K, Q122 H, S146G应变NN的数据库序列相比,2025年。然而,相比与其他序列从UA 159年出版,797年只有S146G位置不同。进一步比较的井下供电隔离797年井下供电从其他磺胺类药耐药生物(图2)表明,差异发生之前以外的特征突变确定位置。的folP基因多态多了folA基因。其他一些孤立的序列决定显示氨基酸(图10个不同模式的改变3)。当folP从797年克隆基因pUC19矢量,这是表达井下供电大肠杆菌C600Δ淘汰赛的转型压力folP。797菌株容易长在0.1毫米磺胺甲恶唑,但克隆folP基因只允许增长0.02毫米磺胺甲恶唑。
没有基因的序列年代sobrinus是可用的,最初是很难得到完整的folP序列的分离,最后通过设计引物的侧面来解决folP基因的美国downei序列相似年代sobrinus。完整的folP提出了序列图4。隔离7变种(0)显示不同的应对磺胺甲恶唑有完全相同的序列folP和上游地区。序列的基因干预folE(编码三磷酸鸟苷cyclohydrolase)和folP几乎是100个基点长在吗美国sobrinus比在美国downei(数据4和5)。其间的序列显示没有任何相似序列数据库和似乎因此是独一无二的美国sobrinus(图5)。的folP和folA基因序列的美国sobrinus一起folP的不同变体的序列变异链球菌准备在这个研究已经提交给欧洲核苷酸档案加入数字他599533年到599539年。
4所示。讨论
草绿色组链球菌对抗生素越来越多的报道在过去的十年里(4,5],研究抗生素耐药性的变形链球菌群很少(23,24]。在目前的研究中,生龋齿的变形链球菌(变形链球菌和链球菌sobrinus)隔离病人参加牙科和艾滋病毒/艾滋病保健诊所在坎帕拉,乌干达,在研究共生的菌群是稀缺的耐药性,但报道增加使用抗生素(7]。最引人注目的结果是非常不同的选择SXT抗药性细菌的预防组,而其他抗生素抗性两组之间没有显著差异。
最近,Wilen et al。25]报道复方磺胺甲恶唑耐药性草绿色链球菌喉咙植物,发现100%的频率的阻力。然而,隔离变形链球菌和链球菌sobrinus并不包括在之前的研究[25]。在目前的研究中,低水平的阻力(15.5%)nonprophylaxis组样本中发现可能解释为不同SXT选择压力在不同的环境和生龋齿的细菌产生生物膜(26),一种保护机制,使抗生素接触细菌的生存。然而,更高水平的阻力发现预防组(54.7%)表明,选择性力量作用于口腔和喉咙植物。阻力水平的差异可能更好的通过不同的方式解释喉咙共生的植物抗性SXT (25]。可能还有其他限制基因转移在口腔咽喉植物相比。
SXT当nonmutans草绿色链球菌耐药性机制进行了分析,它容易被认定为由于突变的变化目标酶dihydropteroate合成酶(井下供电)和二氢叶酸还原酶(DHFR)以及不同链球菌物种之间的基因转移(25]。然而,从测序的结果folP和folA本研究基因耐药味精(数据2- - - - - -5)不建议突变DHFR酶的变化,也没有任何基因转移的阻力因素其他铬绿组链球菌变异链球菌或美国sobrinus。缺乏变化folA耐甲氧苄氨嘧啶基因显示一个不同的机制,可能由于基因扩增中指出美国agalatiae(27]。另一方面,folP基因的变形链球菌797显示四个点突变与NN2025相比(图2)和一个与UA159相比。比较这些突变的位置与阻力确定突变在其他生物(图2)表明,他们主要发生在保守的部分蛋白质和不同很明显与以前相比,职位描述电阻赋予突变(22,25,28- - - - - -30.]。其他的进一步测序变异链球菌隔离显示更多的多态性(图3),很明显变异链球菌井下供电可以改变很明显没有任何明显的抗磺胺甲恶唑的关系。缺少证据的抗性基因的水平转移相关的链球菌是相当惊人的。在隔离生龋齿的细菌,这是很常见的共生链球菌找到其他物种,例如,美国杂志,s . parasanguinis和唾液链球菌在同一隔离。在一些情况下我们放大folA和folP从这些其他共生的物种的基因,发现预期的阻力赋予突变之前的研究中描述(25]。而电阻的变种folA和folP大部分口腔链球菌菌株之间的自由传播,似乎有一些障碍,限制转让抵抗生龋齿的细菌。
链球菌sobrinus非常不同于变异链球菌方面我们研究DNA序列的基因,而且在这种情况下,sulfa-trimethoprim阻力似乎不与序列的差异folA和folP。这些基因的序列显示很高的相似性美国sobrinus和美国downei(图5),在一些情况下,我们发现美国downei序列的样本。两者之间的显著的不同细菌之间的基因间区域folE和folP(图4)。这可能需要进一步探索对其表达的关系folP因此电阻。然而,在种植,我们获得的美国sobrinus菌株不同程度的磺胺类和tp脆弱的感情,但没有指出这个地区的变化。
尽管保护作用的复方磺胺甲恶唑预防艾滋病毒/艾滋病患者机会性感染和疟疾(9],目前研究发现之间的药物选择电阻变形链球菌类似于其他报道是共生的大肠杆菌(8]。看着其他个体的电阻率,只有少数研究明确地描述变形链球菌或金黄色sobrinus。来自印度的一项研究[22]显示阻力水平的20 - 30%四环素、阿莫西林、红霉素。在目前的研究中,抗变形链球菌对四环素是35.7%,这显然是一个令人担忧的发现,因为适度的成本和简单的药物在乌干达的可用性。
耐阿莫西林、头孢曲松钠和氯霉素被发现在1.2%,32.1%,和6%,分别隔离(表2)。这些阻力相似或高于报道来自印度(22]。我们观察到的阻力可能归因于选择耐药生物的研究区域类似于印度的发现(22),考虑到现行的抗生素的使用在这两个国家7]。
Coresistance(电阻超过一种抗生素)或微生物的活动获得耐多种抗生素串联非常麻烦和曾被指出22]。尽管我们发现患病率略高的多药耐药性预防相比nonprophylaxis组(表3),差异无统计学意义。这不仅可以部分解释的事实:大多数抗生素在目前的研究中不常用的艾滋病毒/艾滋病患者也区别这些抗生素和复方磺胺甲恶唑的作用机制。
这些发现在预防呼吁改善抗生素耐药性的监测。更新的信息报道等抗生素耐药性抗生素药物政策制定者目前的研究有助于通知设计策略有效的预防和治疗细菌感染。
5。结论
在目前的研究中,人们已经发现,复方磺胺甲恶唑预防治疗的选择在口腔细菌同源抗生素耐药性。有一个高的电阻率变形链球菌和链球菌sobrinus四环素、头孢曲松钠在乌干达病人SXT独立的预防研究。叶酸通路中的基因转移基因似乎没有耐药性的机制收购。
利益冲突
作者没有利益冲突。所有作者负责的内容和写作论文。
作者的贡献
b .威廉进行聚合酶链反应测试,参与了微生物抗生素耐药性测试和序列分析,并起草了手稿。c . m . Rwenyonyi参与研究的设计和执行统计分析。g . Swedberg设计引物,参与研究设计和序列分析,并帮助起草的手稿。f . Kironde构思研究和参与其设计和协调,帮助起草手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
作者感谢临床团队组成Kiryowa Haruna, Kakande勒·穆罕默德,Namuli Annet, Sania Kaddu,和Zalia Nalumansi。他们从查尔斯Izale欣赏援助,果皮牧师在细菌培养和鉴定。他们真诚地感谢塔索(TASO)病人和管理员和姆拉戈医院牙科诊所。这项工作是瑞典研究机构支持的经济与发展中国家的合作。