文摘

本研究的目的是调查在活的有机体内3147年活动的lantibiotic lacticin发光金黄色葡萄球菌应变Xen 29使用小鼠模型。雌性BALB / c小鼠(7周大,17 g)被分成组(),通过腹腔内感染Xen 29株路线的剂量cfu /动物。1.5人力资源后,动物皮下注射治疗剂量的磷酸盐(PBS;-控制)或lacticin 3147。postinfection发光成像是3和5小时。小白鼠被牺牲,和水平的金黄色葡萄球菌Xen 29日在肝脏、脾脏和肾脏被量化。值得注意的是,光致发光和培养分析都表明lacticin 3147成功控制的系统性传播金黄色葡萄球菌在老鼠身上从而表明lacticin 3147有潜力的化学治疗剂在活的有机体内应用程序。

1。介绍

金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌之一,可引起的疾病从轻微和手术部位感染(1)可能危及生命的心内膜炎(2- - - - - -4和菌血症5- - - - - -8]。这是一个特别的问题在医院的结果的出现和传播耐多药耐甲氧西林等形式金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌),万古霉素中间易感性金黄色葡萄球菌(签证)和异构签证(hVISA)。这些抗生素耐药形式的流行意味着新的化疗药物来对付这些病原体的发现是至关重要的9,10]。lantibiotics (lanthionine-containing抗生素(11])是一组转译后的改性抗菌肽的乳酸链球菌肽和lacticin 3147是最广泛的调查。许多lantibiotics已经指出具有强大抗菌活性对葡萄球菌的临床相关性。在琼脂扩散试验,I型lantibiotics epidermin, Pep5, epicidin K7、epilancin 280显示令人印象深刻的活动水平对凝固酶阴性葡萄球菌(CNS) [12],它已建议他们的潜能可以被利用,防止医疗设备(的殖民化12]。乳酸链球菌肽也在多个场合被证明具有明显的反葡萄球菌活动。当测试20耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株,一项研究显示,乳酸链球菌肽的最低抑制浓度(MIC)介于1.5和16之间mg / L (13),而最近的一个调查显示麦克风0.5 - -4.1 mg / L (14]。的在体外其他形式的活性乳酸链球菌肽(乳酸链球菌肽F, Q, Z)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌最近也被高亮显示(15]。的在活的有机体内活动的lantibiotics对葡萄球菌也被调查。的有效性epidermin-like mutacin B-Ny266测试对小鼠感染腹腔内注射(IP)为3.1×10⁷cfu的金黄色葡萄球菌史密斯/鼠标。后立即注射,mutacin B-Ny266管理,同时通过IP路由,浓度的1 - 10毫克/公斤的鼠标和被发现保护(16]。最近,microbisporicin已经建立,除了拥有强大的在体外活动(μg / mL),有效控制鼠败血症所致金黄色葡萄球菌在女性cd -老鼠(第23 - 25 g)。被感染的老鼠通过1×10的IP路由⁶cfu的金黄色葡萄球菌史密斯819年写明ATCC 19636年0.5毫升猪胃粘蛋白。Microbisporicin当时管理静脉或皮下注射(SC)在感染后10 - 15分钟的最终浓度10 - 15 mg / L (17]。有效剂量50 (ED₅₀)microbisporicin被发现2.1毫克/公斤,无论是否通过IV或SC管理。₅₀值的基础上确定第七天的小鼠的生存。更高的剂量microbisporicin(≥200毫克/公斤)治疗导致所有动物的生存,无毒(16]。乳酸链球菌肽F有效控制MRSA菌株,金黄色葡萄球菌K,在免疫力低下Wistar鼠4×10的引入⁵金黄色葡萄球菌细胞的鼻孔大鼠连续4天前处理8192任意单元(AU)的乳酸链球菌肽F鼻内随后的4天(18]。相比之下,然而,当1 x10⁸金黄色葡萄球菌Xen 36细胞被注入腹腔内,政府的低浓度的乳酸链球菌肽F (640 AU) 4小时后成功地抑制病原体的生长只有15分钟后这段时间病原体再度出现(19]。最后,短期和长期的在活的有机体内研究建立了mersacidin这lantibiotic有效地抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌鼻内引入免疫功能不全的(hydrocortisone-treated) BALB / C小鼠20.]。对于短期试验,小鼠感染5天,7和9 3×10²-10年⁴cfu的金黄色葡萄球菌压力。老鼠然后用mersacidin治疗鼻内(1.66毫克/公斤/治疗)一天两次10天,11和12所示。试验的时间越长,老鼠的挑战金黄色葡萄球菌30天5、7、9日,32岁和34随后处理mersacidin 35天,36和37。在这两种情况下,成功地抑制MRSA-induced mersacidin治疗鼻炎(20.]。值得注意的是,一个比较的在体外和在活的有机体内活动mersacidin对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株的数量表明mersacidin更有效地抑制金黄色葡萄球菌在体内(21]。

Lacticin 3147是最广泛研究的两个肽lantibiotics。这些多肽是活跃的协同活动的结果两个lanthionine-containing肽(22,23]。Lacticin 3147被发现展览的在体外对一系列的致病菌包括的活动艰难梭状芽胞杆菌,vancomycin-resistant enterococci,痤疮丙酸菌属,抗肺炎球菌,和变形链球菌(14,24- - - - - -26)以及致病性分枝杆菌等鸟型分支杆菌无性系种群副结核和结核分枝杆菌H37Ra [27]。这项研究最相关的是lacticin 3147具有反葡萄球菌活动。lantibiotic本身,当纳入一个奶头密封,防止金黄色葡萄球菌有关牛乳腺炎(28,29日),而使用lacticin 3147 -生产Lactococcus lactisDPC 3251乳头凹陷内抑制金黄色葡萄球菌这两个在体外也在活的有机体内(30.]。的在体外活动lacticin 3147临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离株与中等收入国家也建立了从1.9到15.4 mg / L (14]。

尽管lacticin 3147被最广泛研究lantibiotics之一,它能够控制系统性感染所致金黄色葡萄球菌或者其他病原体,没有被调查。这里我们解决这个问题用BALB / c小鼠感染通过IP路由金黄色葡萄球菌Xen 29日,甲氧西林敏感的菌株金黄色葡萄球菌(MSSA)转基因表达Photorhabdus luminescens勒克斯基因促进在活的有机体内成像。皮下注射lacticin 3147控制感染的能力进行评估在活的有机体内成像和微生物分析牺牲动物的器官。

2。材料和方法

2.1。抗菌活性分析

的在体外活动lacticin 3147和万古霉素(受雇为一个积极的控制)金黄色葡萄球菌Xen 29评估通过麦克风化验测定进行了一式三份(如前所述14通过高效液相色谱纯化lacticin 3147,准备,再次如前所述14]。万古霉素是来自西格玛奥德里奇。

2.2。剂制备

金黄色葡萄球菌Xen 29(来自父母的胸膜孤立金黄色葡萄球菌12600;公司创建Xenogen Almeda, CA)拥有一份修改luxABCDE操纵子的p . luminescens集成在一个站点染色体。金黄色葡萄球菌Xen 29是培养在脑心浸液肉汤(BHI)耗氧在37°C从一个孤立的殖民地日益BHI琼脂包含200μ克/毫升卡那霉素。审判的那天,在一夜之间文化是亚文化(1:100稀释)到新鲜的BHI和成长记录阶段(OD_600海里0.5)。这种文化被稀释,以促进文化的终极管理的形式1×10⁶cfu / 100μL剂量0.5%猪胃粘蛋白(西格玛奥德里奇)。

2.3。小鼠腹膜炎模型

老鼠一个标准的啮齿动物的饮食随意和所有动物研究动物实验伦理委员会批准的。13雌性BALB / c小鼠(7周大,15克重量±2 g)被分为3组(A, B, c;、5、5、职责)。在T₀老鼠在a - c组收到了1×10⁶cfu剂量(100μL体积)通过IP路由在0.5% gastic猪粘蛋白(西格玛奥德里奇)。在T_1.5小时,老鼠在C组接种lacticin Ltn 3147(50.85毫克/公斤α和Ltn 43.8毫克/公斤β,对应于30.76毫米lacticin 3147 /公斤)在单剂量和第二次剂量T_3小时(25.425毫克/公斤Ltnα和21.90毫克/公斤Ltnβ;15.382毫米lacticin 3147 /公斤)。万古霉素(50毫克/公斤;33.6毫米/公斤)在T_1.5小时和T_3小时小鼠的B组小鼠在A组收到PBS(一旦)作为控制。100年抗菌素和PBS adminisitered皮下注射μL剂量。在活的有机体内成像在两个时间点进行,postinfection 3小时和5小时。生物荧光成像小鼠麻醉通过的雾化吸入异氟烷与氧气混合。老鼠被转移到新室腹侧,和发光测量3到5分钟的曝光时间。成像系统测量的光子数量达到每个探测器的电荷耦合装置摄像头,和新软件将这些数据转换为假彩色图像显示区域的发光用红、温和的黄色和绿色发光和温和的蓝色发光。这里包含的图片摄影的生物发光图像的叠加使用这个电脑颜色范围(31日]。postinfection小鼠安乐死大约6小时。肝脏、肾脏和脾脏中提取。这些器官被机械破坏,连续稀释在100年,随后被镀μL卷板块以列举葡萄球菌出现在每一个器官。

2.4。量化的发光

发光图像量化与新成像软件。光子的总通量(数量/ s /厘米²)是由一个用户定义的区域计算(感兴趣的区域)的感染。每个各自的平均通量是所有小鼠组。减少发光和发光的量化和比较小鼠注射磷酸盐控制在同一时间点。

2.5。统计分析

均值和标准平均误差(SEM)发光的最后时间点和细菌数量的老鼠被计算为所有组。差异生物发光和细菌数量通过单向方差分析分析,其次是Holm-Sidak期末测验(σ统计,版本3.5)。

3所示。结果/讨论

3.1。的评估在活的有机体内活动Lacticin 3147对金黄色葡萄球菌Xen 29使用小鼠腹膜炎模型

皮下注射的能力lacticin 3147控制系统金黄色葡萄球菌感染病原体引入后小鼠腹腔被调查。这涉及到在活的有机体内成像检测水平的病原体在老鼠和发射光通过后期的微生物分析器官。正面和负面的形式控制了老鼠与PBS和糖肽抗生素万古霉素治疗,分别。目标菌株金黄色葡萄球菌Xen 29是一个甲氧西林敏感隔离之前一直使用促进急性展开调查在活的有机体内感染(32- - - - - -36]。在研究开始之前,在体外灵敏度的Xen 29 lacticin 3147年评估。相应的MIC值分别为1.013 mg / L和19.1 mg / L对万古霉素和lacticin 3147,分别(表1)。为在活的有机体内研究中,老鼠收到1×10的剂量⁶cfu postinfection 1.5小时,是管理lacticin Ltn 3147(50.85毫克/公斤α和Ltn 43.8毫克/公斤β),万古霉素(50毫克/公斤),或PBS。在T_3小时老鼠受到新成像,第二剂lacticin 3147(25.425毫克/公斤和21.90毫克/公斤)和万古霉素(50毫克/公斤)管理相关的老鼠。新分析的进展金黄色葡萄球菌Xen 29显示,感染病原体传播系统,最终也占据了小鼠胸腔注射PBS 5小时(T_5小时)后注入的病原体。一个重要的()减少RLU测量胸lacticin区域对应3147治疗组相比明显的PBS对照组(图(负)1)在这个时间点突出的能力lantibiotic防止系统性的传播金黄色葡萄球菌Xen 29感染。相比之下,3147年lacticin不显著降低RLU值对应于腹膜腔相对控制。也许3147年lacticin缺乏渗透腹膜腔(图1)。进一步确定lacticin 3147功效,培养葡萄球菌在器官水平的分析确定后,老鼠牺牲。这种分析进一步强调lacticin 3147年的成功控制全身感染。Lacticin 3147治疗导致显著降低(在所有情况下;图1)病原体数量在肝脏、脾脏、肾脏和治疗的老鼠相对于接受pbs控制(图1)。

正如所料,万古霉素带来了显著减少金黄色葡萄球菌水平相对于接受pbs控制由bioimaging和文化分析。值得注意的是,数量的金黄色葡萄球菌脾脏的lacticin 3147 -和vancomycin-treated老鼠统计漠不关心。然而,万古霉素治疗更成功地降低了金黄色葡萄球菌数字在肝脏和肾脏。虽然lacticin 3147和万古霉素脂质结合二世(10,37,38存在的差异对他们的作用机制。万古霉素结合c端D-Ala-D-Ala主题的五肽脂二世(10]然而,Ltn之间相似性的基础上αmersacidin,提出lacticin 3147结合糖磷酸二组脂质(39]。此外,lacticin 3147也能形成毛孔在靶细胞的细胞膜37,38]。应该指出,虽然类似lacticin 3147毫克/公斤剂量和万古霉素使用在这项研究中,我们的在体外的调查证实,万古霉素是19倍lacticin 3147 Xen29 (MIC值;1.013 mg / L和3147年万古霉素和lacticin 19.1 mg / L,职责)。因此,万古霉素注射的剂量在活的有机体内与100倍的在体外3147年麦克风而lacticin大于其管理水平8倍在体外麦克风。这也许可以解释万古霉素对间隙的增强能力的Xen 29腹膜腔。这是第一次在lacticin 3147对系统性感染的影响评估,因此它也是第一个实例的管理皮下注射。也许lacticin 3147不能前往腹膜根除感染但可以防止感染扩散的整个血液。如前所述,mersacidin已成功被证明能够抑制系统耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染小鼠通过皮下路线(当管理20.]。然而,mersacidin单组份lantibiotic也是球状可能提供的交付通过皮肤。如万古霉素,相当一个小肽的分子量1,825 Da (40]。Lacticin 3147由2肽的分子量3305 Da (Ltnα)和2847 Da (Ltnβ),这可能是因为个人的大肽或特定困难相关的运输腹膜腔的组件可能是一个问题。Mutacin B-Ny266也已被证明能够防止金黄色葡萄球菌在腹膜,但这lantibiotic腹腔内管理,从而转移(感染的网站并不是一个问题16]。

3.2。结论

总之,在这里,我们提供了证据表明lacticin 3147可以用来治疗系统性感染。文化——和bioluminescence-based分析显示,lantibiotic显著减少的数量金黄色葡萄球菌Xen29相对于消极的控制,防止病原体的传播。虽然这些结果更有前途比当乳酸链球菌肽F是用于描述类似的方式(19),不同的菌株金黄色葡萄球菌雇佣、lantibiotic浓度和其他因素意味着直接比较的结果是不可能的。虽然需要进一步的调查,在很长一段时间,更广泛的评估的临床潜力lacticin 3147年,值得注意的是,3147年lacticin拥有许多物理化学性质,有利于其在活的有机体内应用程序。这些包括优秀的活动在一个广泛的pH值范围内,特别是在生理pH值(酸碱度7),没有细胞毒性对真核细胞(41在摩尔浓度),其广泛的活动(42),它替代的行动模式38)、(甲基)lanthionine桥梁的存在赋予结构刚度lantibiotics和减少蛋白水解攻击(43]。这些属性,伴随着其抑制系统的能力金黄色葡萄球菌感染,使lacticin 3147潜在的应用在人类医学有前途的候选人。

承认

作者感谢伊恩和尚有益的讨论。这项研究是由一个健康研究委员会(HRB)爱尔兰研究项目拨款和爱尔兰政府根据国家发展计划,通过一个爱尔兰科学基金会研究员奖:c·希尔,r·保罗·罗斯和p .销(06 / IN.1 / B98)。