文摘
Lactococcus garvieae鱼是一个主要的病原体。两个完整(写明ATCC 49156和Lg2)和三个草案(UNIUD074, 8831年和21881年)的基因组序列l . garvieae最近被释放。我们这里现在比较基因组分析的结果对这些鱼和人类的分离l . garvieae。1542 pangenome由核心和1378个可有可无的基因。的测序l . garvieae菌株共享最可能的毒性基因,但基因簇胶囊被发现只有在Lg2 fish-pathogenic压力。胶囊的缺失基因簇在其他不致病的病毒隔离乳腺炎和蔬菜也证实了PCR。鱼和人类的分离l . garvieae包含特定的两个和四个adhesin基因,分别,这表明这些粘附蛋白可能参与宿主特异性的差异l . garvieae。发现了pangenomic分析可能的生物学提供重要的见解l . garvieae。
1。介绍
属Lactococcus目前由七种:l . lactis,l . garvieae,l .双鱼座,l .杆菌,l . raffinolactis,l . chungangensis,l . fujiensis(1]。在属Lactococcus,只有l . garvieae是一个主要的病原体的鱼,导致致命的出血性败血病等鱼的地方和鳟鱼(2]。此外,这种细菌也被孤立的从水牛乳腺炎(3),甚至人类血液的临床标本,尿液和皮肤(4- - - - - -6]。此外,l . garvieae也被隔绝各种食品包括牛奶(7),奶酪8- - - - - -11),肉类产品(12- - - - - -14),和发芽15]。因此,l . garvieae被认为是一种新出现的人畜共患病原菌越来越在兽医和人类医学的临床意义。尽管的致病机制l . garvieae知之甚少,几项研究已经表明,胶囊多糖在细胞表面是鱼的毒性因素之一(12,16,17]。胶囊包裹的l . garvieae菌株毒力更强的鱼比noncapsulated [12,17,18]。Nonvirulentl . garvieae从发芽也non-capsulated菌株分离15]。
l . lactis是研究最多的lactococcal物种作为一个通常被认为是安全的”(GRAS)”的物种,和六的基因组l . lactis菌株(IL1403、KF147 MG1363、NZ9000 SK11,和CV56)已经完全测序。相比之下,基因组的特点l . garvieae没有被描述,但我们最近决定强毒株的完整基因组序列l . garvieaeLg2 nonvirulent应变l . garvieae写明ATCC 49156鱼的病原体19]。两种共享序列高度的身份,但Lg2 16.5 kb写明ATCC 49156胶囊中缺席的基因簇。胶囊的八个基因基因簇在几个也是守恒的l . lactis菌株和人类微生物组19]。大约在同一时间,基因组序列的其他三个草案l . garvieae菌株(UNIUD074, 8831年和21881年)也发表(20.- - - - - -22]。l . garvieaeUNIUD074 Lg2, 8831人被隔离病鱼,而l . garvieae21881年从人类的血液。在目前的研究中,我们比较了基因组测序的组织l . garvieae株,还讨论了基因可能参与了宿主的特异性l . garvieae。
2。材料和方法
2.1。信息学
基因注释进行了为每个基因组序列草案l . garvieae菌株UNIUD074、8831和21881(表1)。一组初始的预测蛋白质编码基因被确定使用线3.0 (23]。包含重叠基因组成的< 120 bp和那些被淘汰。预测蛋白质都是搜索对nonredundant蛋白质数据库(nr (NCBI)使用BLASTP bit-score截止的60。蛋白质域被HMMER确认。Orthology在全基因组已经决定使用BLASTP互惠的“所有人针对所有最好的点击率比较的胺基酸序列。
2.2。细菌
l . garvieae写明ATCC 43921株(类型),写明ATCC 49156从美国获得类型文化集合(写明ATCC)。写明ATCC 43921和写明ATCC 49156乳腺炎中分离的患病的黄。l . garvieaeLg2孤立于2002年从黄24]。l . garvieaeNRIC0607和NRIC0611从萝卜发芽和西兰花发芽,分别为(15]。这些菌株被培养在Todd-Hewitt肉汤(Becton, Dickinson和公司)20 h在25°C,悬浮在10%脱脂奶(Becton, Dickinson和公司)的解决方案,然后储存在-80°C,直到他们被使用。
2.3。殖民地聚合酶链反应(PCR)
确认胶囊基因簇的存在l . garvieae写明ATCC 43921 Lg2, NRIC0607 NRIC0611,采用菌落PCR。这些菌株培养在Todd-Hewitt琼脂(Becton, Dickinson和公司)20 h在25°C。殖民地被挑选,悬浮在PCR混合物(50μL)含有400μ每个核苷酸的米,2.5毫米MgCl20.05单位LA-Taq(豆类),0.5μ美元的远期(5′-TGCTGTCATCATATTGTGTCCA-3′)和反向(5′-GGCTATGGCATTAGTCAGGAAG-3′)质数。PCR循环条件如下:95°C 3分钟,其次是30 95°C的周期为30秒,30秒62°C, 68°C 5分钟,10分钟72°C。放大后,PCR产品和λ-EcoT14I消化在1.0凝胶电泳。这种凝胶是孵化15分钟在0.5μg / mL溴化乙锭染色。
3所示。结果
基因预测管道在这项研究中,因为使用我们自己的注释基因组数据的三个草案l . garvieae菌株(UNIUD074, 8831年和21881年)只包含重叠群序列。的基因组的一般特征l . garvieaeUNIUD074菌株(写明ATCC 49156, Lg2, 8831年和21881年)总结表1。属Lactococcus包括在家庭中链球菌科。我们构建的系统树连接的核糖体蛋白质测序序列链球菌科,然后l . garvieae和l . lactis从血统不同(补充图1网上吗http://dx.doi.org/10.1155/2012/728276)。
确定直接同源共享l . garvieae压力,我们制作了四维恩图(图1)。pangenome由2920个蛋白编码基因的1542个基因(53%)的核心。总共935个基因被发现是特定于Lg2 (204), UNIUD074(312), 8831(118), 21881(301)的基因组。大多数的独特基因,在所有菌株,被注释为编码(守恒)假设的蛋白质。8831年和21881年基因组共享大多数基因(1730),这个结果与系谱树协议获得连接序列(补充图1)。1542年的核心基因,1130(73%)也被保存在六个测序l . lactis基因组,这表明这些基因可能构成的核心基因组lactococci从他们的共同祖先,可能继承了。
的基因组的比较分析l . garvieaeLg2,写明ATCC 49156显示,Lg2有16.5 kb胶囊基因簇中没有写明ATCC 4915619]。Lg2-specific 204个基因中含有胶囊中的所有15个基因编码的基因簇,表明UNIUD074, 8831年和21881年也缺乏胶囊基因集群(表2)。这一发现是一致的报告扫描电子显微镜观察到l . garvieae8831是一个non-capsulated应变(Alicia Gibello、个人通信)。比较基因位点的测序与相应的轨迹l . garvieae基因组显示胶囊基因簇显然是插入位点syntenic测序l . garvieae(图2)。评估毒性之间的关系和胶囊基因簇的存在,我们下一个调查是否不致病的l . garvieae写明ATCC 43921株,NRIC0607 NRIC0611胶囊基因簇。写明ATCC 49156可以证实的PCR产品约750个基点,其大小是如图3通过琼脂糖凝胶电泳(数据没有显示)。没有观察到胶囊l . garvieae写明ATCC 43921年NRIC0607 NRIC0611,乳腺炎隔绝,萝卜,和花椰菜芽,分别15,24),他们是不致病的鱼。写明ATCC 43921,身份证0607,身份证0611,和他们的PCR产品减少了约400个基点,也没有胶囊基因簇中发现三个菌株在该地区(图4)。胶囊- - - - - -特定的引物用于图4设计的基础上Lg2,写明ATCC 49156之间的保守序列,和这些引物结合位点UNIUD074被发现,8831年和21881年基因只有一个或两个基地不匹配(图3)。
除了胶囊基因簇,我们有其他可能的毒性报道Lg2基因组中的基因(19]。最可能的毒性基因,如溶血素、UNIUD074也是守恒的,8831年和21881年(表2)。然而,两种adhesin基因(LCGL_1585和LCGL_1672)守恒UNIUD074和8831年,但是21881年缺席。LCGL_1585蛋白质包含collagen-binding域(PF05737包含),和mucin-binding LCGL_1672蛋白质包含域(PF06458)。另一方面,特定于21881 - 301个基因包含四种可能adhesin基因(补充表1)。四个丰富包含一个LPxTG-type主题,其中包含两个mucin-binding域(PF06458),一人一个域(PF05738) collagen-binding表面蛋白的保守金黄色葡萄球菌。
没有编码在胶囊基因簇l . garvieae21881年从人类分离与败血症(表2),没有检测到胶囊l . garvieae从人类分离与心内膜炎(25]。另一组报道l . garvieae高频隔离从人类包含23个基因中缺席l . garvieaeUNIUD074,使用抑制差减杂交(26]。我们评估的存在23基因测序l . garvieae压力(表3)。的23个基因中,有18个是守恒的l . garvieae21881年,但只有2 - 5被发现在鱼隔离。
4所示。讨论
的基因信息l . garvieae已被报道,但完整的基因组序列的两个l . garvieae菌株(Lg2,写明ATCC 49156)和基因组序列的三个草案l . garvieae菌株(UNIUD074, 8831年和21881年)最近被释放。在这项研究中,比较基因组分析的三个鱼和一个人类隔离l . garvieae显示pangenome结构。
的致病机制l . garvieae也不太清楚。只有被证明毒性l . garvieae鱼,在某种程度上,取决于它能够形成一个胶囊(9]。我们之前的研究显示,一个胶囊基因簇在Lg2基因组岛(19]。支持这些发现,胶囊基因簇被发现只有在fish-pathogenic应变Lg2,显然是插入位点syntenic测序l . garvieae(图2)。写明ATCC 49156原本孤立的从患病的地方,经历了表型的变化在其后裔从祖先的应变,现在是不致病的地方(12,16,17]。因此我们试图推测,写明ATCC 49156的一个共同的祖先和Lg2收购胶囊基因簇在分歧之前,然后写明ATCC 49156可能已经失去了胶囊基因簇在接种。
几个可能的毒性基因,如溶血素,在UNIUD074 Lg2也是守恒的,8831年,而胶囊基因簇(表2)。一项研究显示,接种的l . garvieae在合成媒体导致的损失胶囊(15]。进一步,我们之前已经证明了胶囊的毒性基因簇是至关重要的l . garvieae鱼(19]。这些发现表明,UNIUD074和8831年可能noncapsulated和非致病性的鱼。
尽管几例人感染所致l . garvieae已报告(1,24),几乎没有精确的机制和因素的信息l . garvieae导致人类感染和疾病。l . garvieae21881从人类分离败血症缺乏一个胶囊基因簇(表2)。其他研究也表明,没有检测到胶囊l . garvieae从人类分离与心内膜炎(25]。基因的l . garvieae从21881年的人类也更保守高频隔离比鱼隔离。这个结果表明,人类的分离l . garvieae可以共享基因缺失l . garvieae菌株与其他环境,l . garvieae菌株包含这些特定基因,即使non-capsulated,可以显示在人类致病性。此外,鱼隔离l . garvieae共享的两种adhesin基因在人类隔离缺席。这两种蛋白质中都含有一个LPxTG-type主题对肽聚糖共价结合矩阵,这些蛋白质可以被sortase裂解。此外,Lg2, UNIUD074和8831人患病鱼隔绝,而21881年是来自人血。因此,两个丰富可能扮演了一个重要的角色在鱼隔离因为粘附宿主组织代表一个在大多数细菌感染至关重要的第一步。相反,人类的孤立l . garvieae包含四个adhesin基因缺席的鱼隔离和可能参与坚持人类细胞。这些粘附蛋白可能参与宿主特异性的差异l . garvieae。
封装的Lactococcus被发现在发酵乳制品。例如,l . lactis胞外多糖NIZO 3隔绝斯堪的纳维亚黏稠的牛奶有一个基因簇,相似的革兰氏阳性病原体(27]。之前报道,制成胶囊l . garvieae包括Lg2无毒菌株在小鼠15),这表明胶囊不会对哺乳动物毒性因素。
使用胶囊基因的引物特定集群,没有写明ATCC 43921胶囊基因簇,NRIC0607,证实了NRIC0611 PCR(图4)。这三个菌株有地方没有显示急性杀伤力15,24),表明胶囊基因簇的存在之间的关系和毒性l . garvieae一种鲱。的基因组UNIUD074, 8831年和21881年也包含了几乎同样的这些capsule-specific引物结合位点(图3)。这些结果表明,使用capsule-specific引物的PCR分析将是一个有用的方法不同l . garvieae隔离,以确定他们是否都封装。
总之,这项研究提供了洞察的毒性机制的理解l . garvieae在鱼类和人类。l . garvieae也被隔绝蔬菜、奶酪、肉和香肠nonvirulent菌株,从牛和水牛乳腺炎代理。添加其它测序菌株分离从不同的环境中能够完善pangenome结构和预测的新候选基因负责宿主特异性l . garvieae,然后比较基因组分析可能导致食品包含的安全l . garvieae。
确认
作者感谢博士艾丽西娅Gibello博士(动物卫生部门,Complutense大学)和美智子Kawanishi(国家兽医化验实验室、农业部、林业和渔业)的胶囊提供有用的信息l . garvieae8831年,讨论胶囊的存在l . garvieae菌株,分别。本文部分支持的促销和互助公司日本私立学校补助金为私立大学匹配基金补贴。