文摘
金黄色葡萄球菌拥有三个MsrA酶(MsrA1、MsrA2 MsrA3),减少S-epimer蛋氨酸亚砜(我)和一个MsrB酶,减少R-MetO。这四个msr从三个不同的启动子基因表达。的msrA1 / msrB基因是coexpressed。确定的表达模式msr基因,建立了三个独立的记者菌株msr启动子克隆在promoterless前面lacZ以及由此产生的构建集成的染色体。使用这些菌株,这是确定的msrA1 / B表达显著更高金黄色葡萄球菌相比msrA2或msrA3。的表达msrA1 / B在固定相的增长最高,但表达的吗msrA2和msrA3最高midexponential增长的早期阶段。的表达msrA1 / B苯唑西林被诱导的表达msrA3调节了盐。的表达msrA2在所有的测试条件下保持不变。
1。介绍
金黄色葡萄球菌是一个多才多艺的和侵略性的病原体负责引起广泛的疾病从轻微的皮肤感染,如毛囊炎、菌血症等危及生命的条件、肺炎、心内膜炎(1- - - - - -3]。为了应对金黄色葡萄球菌入侵宿主的免疫系统招募中性粒细胞和巨噬细胞,引发高度活性氧的释放如过氧化氢、羟自由基、单线态氧和次氯酸。这些高活性物种导致DNA的氧化脂质,蛋白质(4]。
在蛋白质氧化损伤通常会导致蛋白质功能的丧失,扰乱细胞过程和代谢5,6]。这种氧化损伤包括氧化蛋氨酸生产蛋氨酸硫原子的亚砜。蛋氨酸氧化结果在两个diastereomic形式的我(R-MetO和S-MetO)。这两个立体异构的我产品减少了两种不同的Msr enzymes-MsrA MsrB。同行特别是减少S-MetO,而MsrB特别减少R-MetO [7- - - - - -9]。微软和MsrB蛋白质分享没有同源性主序列或结构的水平。直接同源的同行和msrB存在于大多数生物(10,11]。在细菌中,基因的组织同行和msrB显示了巨大的变化。在许多情况下,同行和msrB被转录为独立单元和位于不同的染色体区域12]。然而,在许多细菌,这两个基因是位于彼此相邻,cotranscribed [12- - - - - -14]。在少数情况下奈瑟氏菌属,同行和msrB是转录融合(12,15- - - - - -17]。的拷贝数同行和msrB直接同源在细菌种类也不同。例如,大肠杆菌包含每一个副本同行和msrB;金黄色葡萄球菌,3同行和1msrB;霍乱弧菌,2同行和3msrB;所有出现在染色体(12,15,16]。根瘤菌meliloti拥有3同行和3msrB基因和每个之一是位于一个质粒12]。遗传冗余被认为是一个策略,生物特定基因表达在特定的环境(12]。此外,同行和MsrB蛋白质是最保守的蛋白在原核和真核生物表明重要的细胞功能(11,12,18]。在许多研究中,细菌物种缺乏Msr蛋白质已被证明是敏感的氧化应激的情况下许多致病菌,Msr淘汰赛衍生产品证明是减毒的毒性(12,15- - - - - -17,19- - - - - -22]。
以前,在蛋白质组学研究中,在接触积极成长金黄色葡萄球菌苯唑西林细胞(细胞wall-active抗生素),MsrA1和MsrB蛋白质被观察到的产量高(23]。随后基因融合,分析,北部和转录分析实验证明表达的增加msrA1和msrB苯唑西林基因的存在以及其他几个细胞wall-active抗生素如头孢菌素、D-cycloserine,杆菌肽(24,25]。
这是推测的表达不同msr基因在金黄色葡萄球菌监管的不同在不同生长条件下更好的生存策略的一部分。三个独立的记者菌株构建测试这种假设。在这些记者菌株,msrA1 / B,msrA2,msrA3启动子克隆promoterless面前lacZ介绍了基因和由此产生的结构的染色体金黄色葡萄球菌应变SH1000。本研究的结果表明msr基因位点不同的监管金黄色葡萄球菌可能有重要的生理意义。
2。材料和方法
2.1。菌株、质粒、抗生素和生长条件
在这项研究中使用的菌株和质粒如表所示1。金黄色葡萄球菌细胞生长在大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB)或大豆胰蛋白酶的琼脂(TSA),和大肠杆菌细胞生长在Luria-Bertani肉汤(磅)或Luria-Bertani琼脂(LBA)。质粒在大肠杆菌通过添加氨苄青霉素100细胞被维护μ克毫升−1红霉素在15μ克毫升−1,在需要时。一夜之间的文化金黄色葡萄球菌msr记者紧张准备在10点红霉素的存在μ克毫升−1。
2.2。DNA操作
质粒DNA分离使用QIAprep Miniprep工具包(试剂盒)。限制和修饰酶都是购自Promega (Promega)。使用珀尔帖PCR进行热循环- 200系统(MJ的研究)。DNA操作进行描述(26]。从σGenosys寡核苷酸引物了。
2.3。建设一个msrA1 / B启动子-lacZ记者菌株在金黄色葡萄球菌应变SH1000
一个msrA1 / B启动子-lacZ记者之前在构造金黄色葡萄球菌应变RN450 [13,23)被转移到金黄色葡萄球菌使用噬菌体菌株SH1000转导过程(13,23和由此产生的构造是由PCR验证。
2.4。建设一个msrA2启动子-lacZ记者菌株在金黄色葡萄球菌应变SH1000
引物MsrA2P-1 (5′-TCTAGACAAGCAATTCACGTTG-3′)和MsrA2P-2 (5′-GAATTCCTTTCATTAGACCTTAG-3′)被用来放大使用基因组DNA从1281个基点的DNA片段金黄色葡萄球菌SH1000作为模板。这个扩增子代表上游和8元的5′端msrA2基因。克隆扩增子是在正确的方向promoterless的上游lacZ向量pAZ106的基因(27),被引入的染色体金黄色葡萄球菌RN4220通过电穿孔选择红霉素。噬菌体80α溶菌产物的转化株用于转换msrA2启动子-lacZ融合到应变金黄色葡萄球菌SH1000。集成的一个副本msrA2P- - - - - -lacZ证实了染色体的印迹分析。
2.5。建设一个msrA3启动子-lacZ记者菌株在金黄色葡萄球菌应变SH1000
构建msrA3记者紧张,两个引物MsrA3P-1 (5′-GATCCAGCGACACCTCATCATTTGC-3′)和MsrA3P-2 (5′-GAATTCACCCTCCTGCTACATAAAC-3′)和基因组DNA金黄色葡萄球菌应变SH1000模板用于PCR扩增1427 bp的DNA片段。扩增子代表上游和39元的5′端msrA3基因。克隆扩增子是在正确的方向promoterless的上游lacZ向量pAZ106基因,引入的染色体金黄色葡萄球菌RN4220通过电穿孔,随后到压力金黄色葡萄球菌使用噬菌体SH1000转导过程。集成的一个副本msrA3P- - - - - -lacZ证实了染色体的印迹分析。
2.6。生长动力学msr记者的菌株和表达msr基因在金黄色葡萄球菌
一夜之间的文化msr P-lacZ (A1 / B),msrA2P-lacZ,和msrA3P-lacZ记者结构在金黄色葡萄球菌应变SH1000稀释100倍在新鲜TSB flask-to-medium体积比为6:1和生长在37°C与曝气220 rpm。这些文化是通过测量记录OD的增长600年每30分钟。个人的表达msr基因位点确定在这些记者通过分析结构在不同的时间点β牛乳糖使用O-nitrophenyl -β-D-galactopyranoside (ONPG)作为底物如前所述[13,23]。
2.7。的表达msr基因在金黄色葡萄球菌在压力条件下
一夜之间的文化msr P-lacZ (A1 / B),msrA2P-lacZ,和msrA3P-lacZ记者构造在新鲜的TSB和允许稀释100倍增长37°C与曝气和颤抖。在OD600年= 0.3,细胞从10.0毫升的文化是收获和resuspended 10.0毫升新鲜TSB或TSB修改实施各种不同的压力条件。苯唑西林抗生素使用压力为1.2μ克毫升−1;氧化应激,H2O2在15毫米;碱性压力,TSB pH值9.0;酸性压力,TSB pH值5.0;渗透压力,TSB补充1.5 M氯化钠。细胞被允许种植1 h。随后,收获和细菌细胞β牛乳糖活动测量。的msr记者构造pre-grown OD600年= 0.3也暴露1 h化学药剂:肼(5毫米),N-ethylmaleimide(0.05毫米),甲基紫罗碱(百草枯,20毫米),甲萘醌(0.05毫米),氢过氧化枯烯(0.0125%),和硝普酸钠(5毫米)。细菌细胞随后被用来确定β牛乳糖活动。
2.8。统计分析
所有结果报告为均值±SD至少三个试验。数据分析与Dunnett单向方差分析的方法或Student-Newman-Keuls方法双向方差分析使用统计分析计算机程序(SigmaPlot对于Windows, 11.0版本,Systat软件,Inc .)。统计学意义是。
3所示。结果
3.1。生长动力学msr P-lacZ (A1 / B),msrA2P-lacZ,msrA3P-lacZ记者结构在金黄色葡萄球菌
个人的融合msrA1 / B,msrA2,msrA3启动子与promoterlesslacZ基因及其随后的融入金黄色葡萄球菌染色体是由PCR验证和印迹分析(数据未显示)。随后,上述构造记者菌株的增长率进行分析,看看这种启动子-lacZ集成的葡萄球菌的染色体对增长造成任何影响。结果表明,金黄色葡萄球菌msrA2和msrA3记者菌株几乎以同样的速度增长,而msrA1 / B记者应变增长速度略有放缓(图1)。
3.2。的表达msr基因在不同的发展阶段金黄色葡萄球菌
细菌细胞的文化msr P-lacZ (A1 / B),msrA2P-lacZ,和msrA3P-lacZ记者收集菌株在不同的生长阶段调查期间,如果这些基因的表达是依赖于经济增长阶段的。在这些研究中,表达式的msrA1 / B基因位点低,mid-exponential早期增长阶段,但明显高于后期指数和平稳增长阶段(图2(一个))。的表达msrA2和msrA3基因,另一方面,在早期,mid-exponential阶段更为明显的增长,并在平稳增长阶段(数字低很多2 (b)和2 (c))。这些实验还显示,msrA2和msrA3基因表达水平明显降低的表现msrA1 / B在所有阶段的增长轨迹(数字2(一个),2 (b),2 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.3。的表达金黄色葡萄球菌msr基因在压力条件下
的表达msr基因在金黄色葡萄球菌考察了在不同压力条件。在这些研究中,的表达msrA1 / B基因位点显著增加(~ 6.5倍(图)3(一个)苯唑西林)的存在,一个观察与之前的结果一致(23- - - - - -25]。的表达无显著变化msrA1 / B观察基因位点在氧化,碱性、酸性、渗透压力条件(图3(一个))。这些压力条件增加引起的msrA2表达式(图3 (b))。的表达msrA2事实上,明显压抑下酸性pH值(图3 (b))。研究利用msrA3记者紧张了一个大约增加5.5倍msrA3表达下的渗透压力。其他压力条件没有明显影响msrA3表达金黄色葡萄球菌(图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.4。的表达金黄色葡萄球菌msr化学诱导氧化应激条件下基因
的表达msr基因决定积极成长金黄色葡萄球菌细胞受到1 h各种化学物质诱导氧化应激。利用浓度选择显示的能力相对比未经处理的文化对待文化的增长放缓。在这些实验中,与预期相反,化学诱导氧化应激并没有引起任何的表达msr基因(数据4(一),4 (b),4 (c))。许多这些化学物质,最值得注意的是,氢过氧化枯烯、甲基紫罗碱,二酰胺,NEM,压抑的表达msr基因显著水平(数字4(一),4 (b),4 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
的生存金黄色葡萄球菌在各种环境压力是一个关键因素的致病性。在殖民和主机的入侵,葡萄球菌持续不断地暴露在有毒的环境。后金黄色葡萄球菌入侵,主机响应通过招聘网站的多形核白细胞和巨噬细胞的感染,这样他们就可以摄取葡萄球菌。吸收细菌引起氧依赖性的杀菌剂的通路的吞噬细胞产生活性氧(ROS)如过氧化氢、羟自由基、单线态氧和次氯酸[4]。退化也方便了吞噬细菌细胞的溶酶体酸性环境(28]。抵抗氧化应激的ROS从中性粒细胞,金黄色葡萄球菌有几个策略,使得它能够成功地开拓殖民地和在宿主体内生存。金黄色葡萄球菌产生超氧化物岐化酶等抗氧化酶超氧化物阴离子转化为过氧化氢,过氧化氢酶,过氧化氢转化为水和氧气,烷基氢过氧化物还原酶,解毒过氧化氢过氧亚硝基和氢过氧化物,类胡萝卜素色素staphyloxanthin也参与活性氧的解毒29日,30.]。此外,金黄色葡萄球菌还包含蛋氨酸亚砜还原酶酶系统,已被证明是保护从氧化应激28]。
金黄色葡萄球菌产生四个Msr酶。在这项研究中,我们调查了三个优势msr启动子:msrA1 / B启动子驱动的转录msrA1和msrB的基因,msrA2启动子驱动的转录msrA2基因,msrA3启动子驱动的转录msrA3基因。β牛乳糖活动分析msr记者透露,的表达msr在金黄色葡萄球菌是依赖于增长阶段的。的表达msrA1 / B在固定相的增长轨迹是最高的,而表达的msrA2和msrA3在early-to-mid更高的指数增长阶段。类似stationary-phase-induced表达msr基因已经被记载在大肠杆菌(20.),幽门螺杆菌(19),而黄定pv。phaseoli(31日]。总的来说,的表达msrA1 / B轨迹的金黄色葡萄球菌被观察到的相比高得多吗msrA2和msrA3基因。在指数增长阶段,高水平的抗氧化酶减少氧化剂的胞内积累(31日),从而提供一个可能的解释为低表达的更加活跃msrA1 / B在这个阶段的增长轨迹金黄色葡萄球菌。在静止阶段,营养限制,积累的有毒代谢副产品,如ROS、和减少抗氧化酶的活性,过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等,增加对细胞氧化损伤的可能性(31日,32]。表达的增加msrA1 / B将有助于缓解oxidant-induced损害在固定相。这种现象类似于固定相同行的感应中观察到大肠杆菌(20.]。
的表达msr基因也在不同的压力条件下进行了研究。本研究表明,新青二和渗透压力诱导的表达msrA1 / B基因位点和msrA3分别表达。除了新青二(msrA1 / B)和盐(msrA3),其他的压力条件下进行本研究没有对表达的影响msr基因。表达的增加msrA1 / B为了应对新青二曾被证实金黄色葡萄球菌(23- - - - - -25]。金黄色葡萄球菌是一种最osmotolerant病原体能够生长在培养基含有高达3.5 M氯化钠(33]。渗透压力导致收缩,在细菌细胞膨压下降。作为回应,细菌恢复膨压通过积累osmoprotective溶质,如甜菜碱、胆碱、脯氨酸、牛磺酸。之前它已经表明,指数增长的风险金黄色葡萄球菌细胞2.5 M氯化钠显著增加细胞大小,随后恢复正常细胞大小,添加甜菜碱。此外,muropeptide分析显示显著的形态结构改变细胞壁的存在氯化钠(34]。在正常情况下,肽聚糖层金黄色葡萄球菌细胞壁是通过pentaglycine交联桥提供强有力的结构框架(3]。然而,细胞暴露于氯化钠展出改变pentaglycine和甘氨酸含量降低交联。这些结构性异常纠正了甜菜碱(34]。因此,合理的表达增加msrA3渗透胁迫可能与维持细胞壁的完整性金黄色葡萄球菌。这种反应似乎是类似的表达msrA1 / B在细胞wall-active抗生素。然而,需要做更多的工作来完全理解的意义msrA3和它的渗透压力下诱导表达金黄色葡萄球菌。
诱导表达msr基因被观察到在许多细菌在不同压力条件下。在大肠杆菌葡萄糖或氮的消耗增长媒体导致同行活动3至4倍增加(20.]。细胞暴露于过氧化氢、过氧硝酸盐或联吡啶(iron-chelator)压力显示三倍msr感应的幽门螺旋杆菌(19]。各种氧化化学物质如甲萘醌(10倍),叔丁基氢过氧化物(留学生),H2O2(三倍),N-ethylmaleimide(2倍)诱导同行表达黄定pv。phaseoli(31日]。在链球菌gordonii,pH值增加(6.2 - 7.3)诱导同行表达式[35]。苯酚和氯酚诱导的化学应力同行表达式由4倍和5倍,分别在土壤细菌Ochrobactrum人为(22]。在杆菌细小百草枯,过氧化物生成化学诱导同行表达式的3.5倍(36]。
缺乏整体的msr感应的金黄色葡萄球菌氧化应激是令人惊讶的考虑,这样的条件下可以诱导的表达msr在其他生物的基因。然而,它一直猜测,即使msr基因不诱导氧化应激反应在某些物种,这些基因产物仍然需要确保适当的生存压力下(12]。这是说明大肠杆菌,氧化剂,H2O2百草枯,未能引起同行表达式。然而,disk-inhibition固体培养基的研究显示显著增加抑制增长同行突变体在H2O2(20.]。同样,一个突变msrA1呈现金黄色葡萄球菌更容易H2O2压力,但没有感应msrA1 / B注意到在暴露于H2O2(13,16]。
在金黄色葡萄球菌,的基础水平msr表达可能是足以保护细胞免受氧化损伤。或者,其他逆境应答基因也许能够更有效地应对压力条件下测试在这项研究中,从而绕过需要的感应msr基因。在微阵列实验中,至少25与压力相关的基因调节金黄色葡萄球菌在接触ROS。这些基因编码的酶如过氧化氢酶、硫氧还蛋白,硫氧还蛋白还原酶、超氧化物歧化酶、烷基氢过氧化物还原酶,谷胱甘肽过氧化物酶(37]。一氧化氮产生的硝普酸钠与氧气或过氧化物反应生成活性氮物种攻击硫醇,金属中心,和大分子。蛋白质组学分析表明,以应对一氧化氮的压力金黄色葡萄球菌,共有35个蛋白质合成高含量(38]。另一项研究显示,一个微分调节638葡萄球菌基因响应nitrosative压力引起的亚硝酸钠(39]。转录组分析金黄色葡萄球菌针对氢peroxide-induced氧化应激显示差10分钟后343个基因的表达和20分钟曝光(40]。总之,这些结果表明,额外的氧化应激反应基因的诱导防止ROS-induced损伤金黄色葡萄球菌。
综上所述,本研究的结果建议的表达msrA1 / B轨迹是最高的在平稳增长阶段的表达msrA2和msrA3最高的增长——mid-exponential早期阶段。的msrA1 / B轨迹相比是一个更强大的启动子的控制下msrA2和msrA3基因启动子。的表达msrA1 / B苯唑西林轨迹明显引起的,而表达的msrA3在响应渗透压力显著增加。氧化应激条件并不影响msr感兴趣的基因表达,这将是在未来,看看金黄色葡萄球菌msr突变体(msrA1,msrB,msrA1:msrB,msrA2,msrA3,一个完整的同行,或一个完整的msr突变体)显示任何微分对氧化应激的敏感性或其他压力条件下,目前正在接受调查。
确认
作者感谢简·c·约翰逊她宝贵的援助与统计分析。这项工作的部分支持由华纳/ Fermaturo & ATSU董事会研究基金和格兰特1从美国国立卫生研究院r15ai090680-01 Vineet k·辛格和格兰特KCOM生物医学科学研究生项目Kuldeep辛格。