耐甲氧西林适应性差金黄色葡萄球菌对串行在体外通过Daptomycin:进化Daptomycin阻力和膜类胡萝卜素含量的作用和流动性

文摘

先前的研究显示,连续20 d在体外在亚致死的MRSA菌株通过对象daptomycin (DAP)导致不同的扰动在细胞膜(CM)和细胞壁(CW)特征,包括增加CM刚度;连续波厚度增加;“gain-in-function”单核苷酸多态性(snp)mprF轨迹(即。,increased synthesis and translocation of lysyl-phosphatidylglycerol (L-PG)); progressive accumulation of SNPs inyyc和rpo位点的基因;降低了类胡萝卜素生产;天生的宿主防御肽抗力移转。目前的研究旨在描述这些表型和基因型的修改后的再现性在体外串行通道相同的父母的压力。后第二个20 d系列在体外通过父母的对象,出现DAP-R与几个表型的进化密切镜像之前通过的结果。然而,在最初的串行通道应变组相比,我们观察到(i)适度增加L-PG合成和不增加L-PG外厘米易位;(2)显著增加(类胡萝卜素合成);(3)不同的SNP积累的顺序();(iv)不同的干部和地点的snp。因此,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株表型上不是“天生”和/或遗传型的诱导过程中以相同的方式适应DAP阻力。

1。介绍

侵入性的金黄色葡萄球菌感染是全球迅速增长。收购multiantibiotic抗性,特别是在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株,给临床医生带来了一个大问题(1- - - - - -3]。Daptomycin (DAP)有很大的功效在体外和在活的有机体内对许多革兰氏阳性菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(4]。DAP可以绑定到细菌厘米,calcium-dependent的方式,最终扰乱CM和消散CM电化学梯度,导致细胞死亡(4,5]。我们和其他人已经确定了几个基因位点,关联到DAP-resistant (DAP-R)表型,包括mprF vraRS,标签,和dltABCD(6- - - - - -9]。在这些场景中,基因型超表达和/或表型gains-in-function这些位点都观察,通常以单核苷酸多态性(snp) [2,6,10]。相比之下,在极少数情况下,其他DAP-R金黄色葡萄球菌隔离没有可识别的在任何上述位点单核苷酸多态性(2]。同样,许多,但不是所有DAP-R金黄色葡萄球菌隔离具有增厚细胞壁(CW)表型(11]。因此,这些调查强烈建议DAP-R表型可能是多因子的毒株特异性。

弗里德曼et al。5)以前描述的一组连续DAP-passaged耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离株(对象背景)顺序DAP-R的进化在体外在陪伴渐进积累的snpmprF,yycG,和rpoB / rpoC。这三个基因位点编码的蛋白质参与维持积极的表面电荷(MprF),细胞信封应激反应(YycG)和RNA聚合酶功能(RpoB / RpoC),分别。使用这个相同的应变,我们最近报道的表型相关进化DAP-R系列在体外通过在亚致死的DAP [6]。我们演示了截然不同的变化在许多表型比较父母对象应变postpassage隔离,包括厘米流动性,CM磷脂档案、CW厚度,抗力移转宿主防御阳离子肽从多形核白细胞和血小板6]。

本研究的目的是检查特定的假设金黄色葡萄球菌隔离可能不是“天生”适应DAP曝光;因此,这些菌株可能,事实上,唤起不同的反应和多因子的机制DAP为了抵制其staphylocidal效果。因此,我们测试了相同的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌亲代菌株(对象),再通过在亚致死的DAP前(类似协议后5)和recatalogued密钥和相关的系列基因型和表型的扰动。(这部分工作提出了在第113届美国微生物协会大会,旧金山,CA;美国6月16 - 19,2012)。

请注意。虽然术语“daptomycin-nonsusceptibility”通常是使用(因为没有正式的出版CLSI断点),我们将使用术语“daptomycin-resistance”(DAP-R)为了便于演示。

2。材料和方法

2.1。菌株:最低抑制浓度(麦克风)

我们使用相同的对象父母的应变之前报道(6),然后经历了一场类似的20 d串行通道协议在亚致死的DAP所描述的其他地方(5)(表1)。选择调查(例如,类胡萝卜素量化),前面DAP-passaged应变测试集与当前DAP-passaged应变,因为这样的分析并不表现在我们之前的研究6]。衣冠楚楚,新青二(牛),万古霉素(VAN)麦克风由标准E以及(AB Biodisk, Devagen,瑞典)Mueller-Hilton琼脂(尼古拉斯)板(补充了50μ衣冠楚楚的g / mL氯化钙E测试)。

2.2。宿主防御肽(黄芪丹参滴丸)脆弱的感情

人类嗜中性粒细胞α-defensin-1 (hNP-1)从肽购买国际(路易斯维尔)。hNP-1杀死试验进行修改基本媒体(BHI 1% + 10毫米磷酸钾缓冲)。最后一个细菌培养液的10³固定相CFU受雇。两个hNP-1浓度被用于这些化验(10到20μg / mL),代表最高的肽浓度范围,没有造成完整的父母杀害对象隔离在试点研究。2 h肽曝光后,获得的样本和定量培养评估hNP-1杀人的程度。最终的数据被表示为代表(±SD)百分比幸存的CFU /毫升。由于没有善意的“抵抗”断点黄芪丹参滴丸,我们利用平均生存(±SD)百分比统计比较的亲代菌株postpassage隔离与弹跳增加中等收入国家。至少三天实验运行在单独的。

2.3。厘米的流动性

金黄色葡萄球菌菌株生长在BHI肉汤到固定相(18 - 20 h) 37°C。CM流动性被荧光偏振荧光光谱测定法确定详细的其他地方(2,6),用荧光探针1 6-diphenyl-1 3 5-hexatriene(衰变时)。之间存在反比关系极化指数和CM顺序(即的程度。,降低极化指数(PI值)等同于大厘米流动性)(2,6]。这些化验进行至少6倍为每个菌株在不同天。

2.4。量化的类胡萝卜素

张伯伦等修改后的协议。12量化后的类胡萝卜素。金黄色葡萄球菌细胞生长在BHI肉汤到固定相(18 - 20 h) 37°C以上,然后收获,清洗和颗粒状在离心PBS。多余的液体从最后一个球被倒置至少2分钟,然后颗粒湿重。一毫升甲醇被添加到0.5克金黄色葡萄球菌颗粒类胡萝卜素的提取。类胡萝卜素含量测定波长为450纳米,spectrophotometrically [13]。实验至少重复三次菌株在不同的日子。

2.5。CM磷脂(PLs)和Amino-PL (L-PG)不对称

PL的提取和fluorescamine标签的详细程序外厘米amino-PLs(确定L-PG易位)之前详细描述(4,5]。简而言之,主要的CM请的金黄色葡萄球菌(phosphatidylglycerol (PG)、lysyl-PG (L-PG)和双磷脂酰甘油(CL))是由二维薄层色谱法分离使用硅60 F254效果板块(默克公司)。第一个维度chloroform-methanol 25%氢氧化铵(65:25:6,按体积)在垂直方向和二维氯仿:甲醇:水:冰醋酸:丙酮(45:4:8:9:16日,按体积)在水平方向被用于分离磷酸请进一步定量的估计。为定量分析,孤立的PL斑点消化在180°C 3 h 0.3毫升70%高氯酸和量化spectrophotometrically OD_660年(6,13,14]。

2.6。脂肪酸组成

脂肪酸的提取是由皂化,甲基化,随后转化成甲基酯形式如前所述[6,13,14]。由此产生的甲酯混合物分离的安捷伦5890 dual-tower气相色谱仪。脂肪酸是由微生物鉴定系统,使用已知的标准(夏洛克4.5;由微生物ID Inc .,纽瓦克,德)。

2.7。表面电荷

相对表面电荷由细胞色素c结合试验如前所述[14]。简单地说,一夜之间的文化金黄色葡萄球菌是生长在嗨肉汤,用20毫米拖把缓冲区(pH值7.0)和resuspended在同一个缓冲区。细胞被孵化为0.5毫克/毫升细胞色素c10分钟,细胞色素的量c剩下的在上层的决心spectrophotometrically OD_530年nm。越多的细胞色素c检测到的上层清液,相对细菌表面的正电荷。数据被表示为代表(±SD)游离细胞色素c。至少有三个独立的运行进行单独的天。

2.8。细胞壁(CW)厚度

连续波厚度由透射电子显微镜测量如前所述[11]。100个细胞的平均(±SD)厚度确定菌株组在放大190000×(JEOL,模型# 100 cx,东京,日本)使用数字图像捕捉和地貌形态示量测量(先进的显微镜技术v54,丹弗斯,MA)。

2.9。测序的mprF, yycF和yycG,rpoB和rpoC单核苷酸多态性

先前的研究相关的DAP通道的应变对象表示连续积累的四个基因的snp位点,乙酸- coA连接酶,mprF,yycFG,和rpoB / rpoC(5]。为了测试这些基因改造的重现性,在这些位点被重新测序新strain-set DAP串行通道。PCR扩增,测序引物集,和识别特定突变的菌株集之前发表(5]。

2.10。统计分析

双尾的学生t以及用于统计分析的定量数据。P≤0.05的值被认为是“重要的”。

3所示。结果

3.1。中等收入国家

衣冠楚楚的麦克风,范,牛表中列出1。如上所述,父母的对象应变(prepassage;CB1118) DAP-S VAN-S,但OX-R。在亚致死的DAP 20 d串行通道后,DAP麦克风逐步上升到16μg / mL,到达DAP-R范围(3μ天6 g / mL)的通道。同样,VAN麦克风展出期间逐步上升通道进入签证范围(3 - 6μg / mL)。有趣的是,减少牛麦克风到OX-S范围也观察到连续通过菌株,同时开始的6天。这个事件代表了所谓的跷跷板效应,逐步提高DAP-R都伴随着连续减少OX-R概要文件(15,16]。

3.2。单核苷酸多态性

除了前面的抗生素药物敏感性的变化,串行通道DAP诱导连续积累的snp随着时间比亲代菌株在四个关键目标基因位点查询在这个调查,乙酸- coA连接酶,mprF yycFG,和rpoB / rpoC(表1)。因此,在比较当前串行通道SNP与弗里德曼等人的结果。5),以下结果随之而来:(i)在以前和目前的研究中,单核苷酸多态性乙酸- coA连接酶发生在1 d DAP通道;(2)单核苷酸多态性mprF出现在这两项研究第一个5 - 6 d DAP通道;和(3)感兴趣的,虽然网站的mprFSNP(氨基酸位置345)是守恒的在这两个调查,具体SNP并不是(T345I以前的研究与T345A在当下研究);(iv)相对于之前的研究,下一个SNP,rpoB发生在14 d衣冠楚楚的通道,在当前通道strain-set,单核苷酸多态性在两种yycG和rpoB通过这个节骨眼上发生;(v)的位置和性质这些后两个snp位点也截然不同的两个调查;(vi)在当前的研究中,但不是在前面的一个,20 d通道的SNPrpoC被观察到。

3.3。黄芪丹参滴丸脆弱的感情

连续通过菌株显示hNP-1增量减少杀害。白天6通道,postpassage隔离已经少得多容易hNP-1杀死比亲代菌株(表2)。通过13 d的DAP通道,高层DAP-R已经诱导(8的中等收入国家μg / mL),这种隔离是高度cross-resistant hNP-1比亲代菌株(P <0。05)。

3.4。表面电荷

没有可观察到的变化相对表面电荷通过应变设置配置文件,与细胞色素的所有菌株表现出类似的模式c绑定(数据未显示)。

3.5。PL成分和Amino-PL不对称

带负电荷的PG PL在所有研究菌株主要是厘米,从~ 78请(表的85%3)。总数的比例(内部+外部厘米)带正电的PL, L-PG,适度增加两个早期的postpassage DAP-R隔离(CB2207和CB2208)紧张,虽然这并不是一个持久的修改在以后postpassage菌株。L-PG的相对比例,转移到外CM传单没有应变组内差异。strain-set CL的量很低,而不是隔离(表中明显不同3)。

3.6。脂肪酸组成

脂肪酸的组成相似在应变的iso -和迷人(支链)脂肪酸(BCFA),以及直链饱和脂肪酸(SCFAs)和不饱和脂肪酸(ufa)(数据未显示)。

3.7。厘米的流动性

有显著和显著增加的趋势在20 d CM刚度DAP通道持续时间(表4)。

3.8。类胡萝卜素厘米内容

有显著增加在CM中类胡萝卜素含量年初DAP通道后大致平行于进步增加DAP麦克风(表4)。相比之下,在最初DAP-passaged strain-set [6),未发现类胡萝卜素合成的增加20 d通道段OD(例如,父母的压力_450年= 0.413±0.016和0.351±0.09,0.333±0.084,13和20 d通道隔离、职责)。

3.9。连续波厚度

DAP-R菌株表现出明显比父母的更厚的水煤浆应变如表所示4(P< 0.0001)。

4所示。讨论

扩大知识库DAP-R的潜在机制,以及一般的葡萄球菌对阳离子peptide-induced压力,我们检查了基因型和表型适应串行的再现性在体外耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株DAP曝光,对象(例如,具体金黄色葡萄球菌压力应对衣冠楚楚的压力在一个可预测的和“天生”的方式吗?)。因此,我们利用以前发表的数据编目表型和基因型的修改在连环发生在体外通过在衣冠楚楚的5,6)和一个独立但平行通道研究进行对比使用相同的父母的MRSA菌株。表型,我们专注于几个厘米,连续波的特点,已被证明在许多DAP-R摄动金黄色葡萄球菌CM秩序和CW厚度等菌株。此外,我们研究了细胞表面电荷与进化之间的抗力移转DAP和一个典型的反金黄色葡萄球菌黄芪丹参滴丸分子包含在哺乳动物的白细胞(hNP-1)。遗传型的,我们集中在识别和积累的顺序在四个目标基因位点的单核苷酸多态性显出良好的突变研究:在前面的通道mprF,yycFG,rpoB / rpoC,乙酸- coA连接酶(5]。

许多有趣的观察从这项研究。正如预期的那样,有几个明确的相似表型分析结果之间的当前设置和之前的压力在体外通过应变集。因此,衣冠楚楚的中等收入国家增加的顺序,在串行DAP曝光的第一个星期开始。增加DAP麦克风跟踪增量和显著增加cross-R典型的宿主防御肽,hNP-1, CW厚度增加和减少CM流动性。此外,之前通道研究中发现,没有明显的模式在表面电荷改变衣冠楚楚的通道在体外。此外,CM脂肪酸的形象通过集之间的不同和在每个通道设置。

有两个主要表型差异中发现比较原始和目前DAP-passaged strain-sets:类胡萝卜素含量(i)厘米,(ii)厘米磷脂(PL)组成。在前一段的研究中,有一个趋势减少厘米类胡萝卜素含量在20 d通道。相比之下,有一个清晰的、进步的,显著提高类胡萝卜素合成在当前通道strain-set观察。这种表型很好符合后者的顺序在CM中减少流动性观察应变,因为厘米类胡萝卜素可以主要贡献者整体厘米“脚手架”,其刚度特性(12,13]。此外,迫使我们最近研究类胡萝卜素生产过剩金黄色葡萄球菌通过multicopy质粒与表现型的DAP增加麦克风和抗力移转关键宿主防御肽(2]。

而言,这两个strain-sets CM PL成分差异,strain-set在前面的通道,有一个显著增加比例的总L-PG合成和L-PG翻外厘米(即比父母的压力。~请总量的25%,翻转和~请总量的12% ~ 33%,~ 10%翻转,职责。)[6]。这些差异似乎与识别的双官能域中的SNPmprF轨迹中发现post-DAP通道应变(6]。

相比之下,在当前strain-set,总共只有适度增加L-PG任何实质性的增加比例L-PG翻外厘米比较的父母一天20通道隔离。这种缺乏影响L-PG合成或易位发生尽管收购一个SNPmprF。先前记录感兴趣的,我们有一个类似的现象在不同的临床派生DAP-R隔离,一个mprFSNP并不是伴随着表达水平增加或表型gains-in-function,viz-a-vizL-PG合成或翻转7]。

值得注意的是,也有重大区别原始通道strain-set和当前配置文件中设置的snp内积累的关键目标基因位点查询,无论是连续采集的SNPs和观察到的特定氨基酸替换。因此,尽管第一发生突变乙酸- coA连接酶基因,突变紧随其后mprF在这两种系列,通过具体mprFSNP氨基酸替换不同菌株之间集(例如,与、职责)。同样,位置和snp的氨基酸替换rpoB和yycG第一组之间的位点不同(;)和当前集合(;)。此外,snp积累的顺序是不同的;在比较前面的应变和电流通道设置不同(≫≫与≫≫≫、职责)。详细,在之前的研究中(但不是在目前的调查),我们观察到的证据mprF表型gains-in-function(即。,increased L-PG synthesis and flipping), even though nearly identical SNPs were acquired by both strain-sets during DAP passage [6]。这是(我)同义snp, (ii)微妙,但重要的是,MprF蛋白质功能差异取决于氨基酸结构,或(3)参与基因位点或网络之外的mprF影响PL表型。同样,SNP的表型影响的差异yycG和/或rpoB / rpoC,以及时间顺序积累,仍有待确定。感兴趣的,最近的两项研究检查了同基因的DAP-S / DAP-R应变对比较基因组资料。法勒et al。17DAP-R]证明了全基因组测序金黄色葡萄球菌菌株表现出突变基因负责磷脂生物合成,尤其是mprF, cls2(参与心磷脂生物合成),pgsA(参与PG合成)。同样,Boyle-Vavra等人相比临床DAP-R耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株的基因组序列从一个病人表现出治疗失败与最初DAP DAP-S隔离;他们还发现一个点突变mprF(18]。

总之,一个人似乎可以得出合理的结论金黄色葡萄球菌应变可以通过任意数量的自适应响应DAP曝光机制在基因型和/或表型水平。显然,具体金黄色葡萄球菌菌株不是“天生”抵制DAP-induced杀死任何单一的通路。这些衣冠楚楚的适应性,似乎在CM中改变顺序,连续波厚度增加,扰动在CM PL内容是反应的主要机制之一。

确认

这项研究支持部分由美国国立卫生研究院(ai - 39108 - 14)和从立体派制药(ASB)。

引用

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