文摘

黄曲霉毒素是强有力的致癌物质和由几乎所有曲霉属真菌寄生隔离和大约35%的黄曲霉隔离。化学方法用于食品和饲料中黄曲霉毒素的检测。这些方法不能检测样品中的aflatoxinogenic真菌,其中包含检测不到大量的黄曲霉毒素。本研究的目的是确定分子和微生物方法检测的重要性aflatoxinogenic真菌答:寄生在食品和饲料样品在约旦。特定的媒体对黄曲霉毒素的检测显示的患病率答:寄生(6 - 22%)受污染的食品和饲料样品。高效液相色谱方法证实的存在黄曲霉毒素B1, B2, G1和G2食品污染的样本答:寄生。引物组OmtBII-F OmtBII-R放大DNA片段基因组DNA的611个碱基对aflatoxinogenic答:寄生远离食品和饲料样品但不能放大nonaflatoxinogenic的DNA片段答:flavus。这项研究的结果显示aflatoxinogenic的患病率答:寄生在食品和饲料样品在约旦,给微生物和分子方法的适用性的进一步证据在黄曲霉毒素的检测,这是可靠的低成本的方法来确定食品和饲料生物安全。

1。介绍

黄曲霉毒素是已知的真菌代谢物的强有力的致癌特性。黄曲霉毒素的能力生产不同物种的报道曲霉属真菌属,内外Flavi集团(1]。然而,有多种研究表明,黄曲霉毒素主要是由曲霉属真菌寄生和黄曲霉隔离。此外,这些研究表明,绝大多数的答:flavus隔离(60 - 70%)atoxigenic [1- - - - - -3),而几乎所有的隔离答:寄生aflatoxinogenic,潜在的黄曲霉毒素农产品的生产者(3- - - - - -5]。

化学方法用于食品和饲料中黄曲霉毒素的检测。这些方法不能检测aflatoxinogenic真菌污染样品,含有检测不到大量的黄曲霉毒素。另一方面,微生物和分子检测方法被用来确定的aflatoxinogenicitya . flavus和寄生。在过去的二十年里,聚合酶链反应(PCR)方法开发了即使真菌的检测。在这方面,一些引物设计几个黄曲霉毒素的生物合成途径的基因;例如,澳式足球联盟,也没有,omt奥德,浴缸,版本,1,5- - - - - -8]。微生物方法被发现强大aflatoxinogenic真菌的检测。答:寄生殖民地显示米色戒指什么时候生长在特定的黄曲霉毒素检测媒体,这些戒指真菌菌落周围被确认为黄曲霉毒素生产指标(9]。本调查的目的是确定的流行答:寄生在食品和饲料样品在约旦通过使用化学,分子和微生物方法。

2。材料和方法

2.1。真菌菌株

答:寄生BS23(黄曲霉毒素)的生产商答:flavusBS48(黄曲霉毒素)的非生产者得到的真菌菌株生物安全部门集合,皇家社会科学。这些菌株被用作微生物标准菌株和分子实验。

2.2。样本收集和隔离的真菌

食品和饲料样品收集当地市场在安曼,约旦的从2010年1月至2011年11月23个月。真菌分离得到食品和饲料后,粮食及农业组织(粮农组织)标准方法(10]。马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)板使用十进制稀释接种测试样本。板块是耗氧孵化25°C 5天。菌落的数量(CFU)的模具产品计算每克从殖民地获得的数量在盘子里选择在稀释的水平(10]。

2.3。形态特征

指定数量的真菌孢子悬浮液接种在9厘米直径的培养皿中含有20毫升的CZ(蔗糖30 g / L, K2HPO41 g / L, NaNO32 g / L,氯化钾0.5 g / L, MgSO4h·72O 0.5 g / L, FeSO4h·72O 0.01 g / L, ZnSO4h·72O 0.01 g / L, CuSO4h·52O 0.005 g / L,琼脂20 g / L)。文化是培养14天,在黑暗中,在25°C,然后对真菌的分离形态对策进行分析根据克利赫,200211]。殖民地色彩和分生孢子的形态。

2.4。黄曲霉毒素检测
2.4.1。微生物方法

黄曲霉毒素的产生答:寄生和答:flavus方法报道后确定了Jaimez奥达et al。9]。酵母蔗糖琼脂(是的)和YCSD由是的补充0.3%的环糊精和0.6%的钠脱氧胆酸盐用于检测黄曲霉毒素的生产能力答:寄生和答:flavus。aflatoxinogenic真菌隔离可见的菌落周围形成一个米色环不需要暴露于紫外线(365海里);但是戒指没有观察到任何nonaflatoxinogenic真菌隔离。此外,它可以可视化的蓝色荧光环周围aflatoxinogenic殖民地紫外线照射下(9]。

2.4.2。高效液相色谱法

测定黄曲霉毒素进行了实验室的生物安全单位的皇家科学社会,安曼,约旦990.33采用AOAC公认的官员表示方法。简而言之,测试样本细碎,提取与甲醇0.1 M盐酸和过滤紧随其后。滤液混合10%氯化钠溶液加入己烷紧随其后。然后用CH水层不一2Cl2和CH的洗出液2Cl2收集和蒸发在蒸气浴温柔的氮。然后纯化样品derivatized三氟乙酸。黄曲霉毒素(B1, B2, G1和G2)反相液相色谱分离和检测到的荧光。荧光检测器是在360 nm励磁过滤和440海里排放过滤器。高效液相色谱系统(日本岛津公司20)被用来执行测试。

2.5。分子实验
2.5.1。基因组DNA的提取

从真菌的菌丝提取的基因组DNA分离获得7天旧文化生长在是的液体媒体。菌丝在液态氮冷冻,磨成细粉和DNA提取试剂盒的Mini-Kit DNeasy工厂。提取DNA的浓度和纯度测定据报道方法(12,13]。

2.5.2。引物

引物及其序列(表1),它被用于PCR扩增实验报道在以前的工作1,5,14]。引物是来自阿尔法DNA /加拿大。

表1
目标基因的引物序列和预期产品长度的碱基对(bp) PCR扩增DNA片段。
2.5.3。DNA扩增条件

报告的DNA片段扩增的PCR扩增条件规定OmtBII和Nor1底漆对进行根据拉希米et al ., 20085)和Criseo et al ., 20017),分别。

2.5.4。凝胶电泳

放大DNA片段和DNA标记的阶梯100个基点(试剂盒)分离使用1.5%琼脂糖凝胶和可视化紫外线照射下与溴化乙锭染色后的分子大小决定碱基对(bp)的DNA片段(15]。

3所示。结果

3.1。食品和饲料中普遍存在的真菌样本

共有四十七的食品和饲料样品商用在安曼,约旦获得从2010年1月至2011年11月期间。真菌的发病率在食品和饲料样品由CFU /克显示宽的范围内变化 CFU /克(表2)。

表2
真菌中发现受污染的食品和饲料样品分析在2010年1月至2011年11月。
3.2。Aflatoxinogenic真菌的微生物特性

在目前的研究中,可以确定属于属的两个物种曲霉属真菌根据菌落颜色CZ和分生孢子的形态。这两个形态特征被认为是真菌分离株的形态特征。隔离了深绿色殖民地和粗略的分生孢子被归类为显示答:寄生。然而,另一个隔离的形态特征答:flavus黄绿色的殖民地和光滑的分生孢子(图中1)。每个物种的标识隔离已从食品和饲料样品受到进一步检测aflatoxinogenic真菌的微生物特性,通过使用特定的黄曲霉毒素检测媒体(是的,YCSD)。可以观察米色戒指周围答:寄生菌落生长时是的和YCSD媒体。这个观察表明,aflatoxinogenic殖民地。戒指是可见的和没有紫外线答:寄生殖民地,但没有观察到任何测试答:flavus隔离。结果还表明,黄曲霉毒素产生隔离(答:寄生)在坚果和饲料样品相比(表与其他样品2)。


图1
答:flavus和答:寄生殖民地种植在CZ板隔绝坚果样本。
3.3。高效液相色谱法

的这一研究获得的色谱图如图黄曲霉毒素检测的高效液相色谱方法2。结果表明四种黄曲霉毒素的发生(B1, B2, G1和G2)在样本污染的坚果答:寄生。另一方面,测试样品污染答:flavus显示检测不到大量的黄曲霉毒素。在这项研究中,22个食品和饲料样本存在黄曲霉毒素的高效液相色谱方法研究;结果证实,所有测试样品含有黄曲霉毒素总量≤4磅。测试样本坚果、面粉、玉米、太阳花朵,咖啡豆,饲料。


图2
黄曲霉毒素的高效液相色谱(B1, B2, G1和G2)获得坚果样品污染答:寄生。
3.4。分子基因组分析

差异中提取基因组DNA的浓度和纯度真菌菌丝获得食品和饲料样品进行测试。中提取DNA的最低收益率是37岁μ克/毫升,而最高产量是57μ克/毫升。提取的DNA纯度显示在1.57和1.81之间变化。PCR实验的结果检测放大DNA片段的引物对指定的测试(OmtBII-F和OmtBII-R)显示611个基点的存在扩增片段基因组DNA提取答:寄生BS23(黄曲霉毒素)的生产商,这个乐队不是观察的基因组DNA答:flavusBS48(图3)。611个基点的DNA片段也观察到在其他三个测试的隔离答:寄生从受污染的食物样本中恢复过来。另一方面,未发现乐队代表了放大611 bp的DNA片段的其他三个测试答:flavus隔离(图4)。Nor1引物给了负面结果的集合。


图3
检测PCR扩增OmtBII序列(611个基点)参考黄曲霉毒素产生应变答:寄生BS23。莱恩L表示100碱基对梯,巷1巷3代表aflatoxinogenic答:寄生BS23巷2代表答:flavusLane BS48 (nonproducer黄曲霉毒素),4代表PCR -控制。1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳和运行3伏特厘米−1。

图4
PCR扩增OmtBII序列(611个基点)3答:寄生这一研究获得的隔离。莱恩L表示100碱基对梯,莱茵1代表PCR -控制,通道2,4,6代表三个答:寄生隔离,车道3、5、7代表了三个答:flavus隔离。1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳和运行3伏特厘米−1。

4所示。讨论

黄曲霉毒素是次要的致癌物代谢产品主要由两种真菌,答:flavus和答:寄生(16]。这项研究的结果表明,食品污染的样本答:寄生黄曲霉毒素是四种类型的生产商(B1, B2, G1和G2)。黄曲霉毒素B1被认为是最有毒的和是由a . flavus和寄生,而黄曲霉毒素G1和G2独家生产答:寄生(16]。本研究的一个重要参数是确定微生物和分子检测的有效性检测黄曲霉毒素。微生物测试发现适合检测产生的黄曲霉毒素答:寄生。可以观察米色戒指周围答:寄生殖民地在黄曲霉毒素检测媒体(是的,YCSD)。Jaimez奥达et al。9能够表明,米色的戒指,真菌菌落周围观察,黄曲霉毒素的生产指标。这些戒指都是可见的不需要暴露于紫外线光。此外,调查显示,戒指没有观察到任何nonaflatoxinogenic菌株。此外,研究人员能够通过高效液相色谱分析证实真菌分离株的aflatoxinogenic性质由微生物检测方法(9]。这一研究报告的结果表明,微生物测试aflatoxinogenic真菌的可靠检测。米色环是aflatoxinogenic可见有或没有紫外线答:寄生殖民地,但没有观察到任何nonaflatoxinogenic测试答:flavus隔离。因此,它是可能的建议的实用性noncostly aflatoxinogenic真菌的检测方法相比,受污染的食品和饲料样品高效液相色谱方法。此外,最近的进步分子分析显示和确认的可能性使用PCR方法检测食品和饲料的污染与aflatoxinogenic真菌在短时间和高的信心。这项研究的结果也表明,答:寄生omt基因的DNA序列,可以通过适当放大PCR引物(OmtBII)。同一组引物不能放大获得的基因组DNA的DNA序列答:flavus。这些结果证实了早些时候报道结果的适用性的omt基因的DNA序列设计特异引物检测aflatoxinogenic真菌(1,5,8]。

更值得注意的是aflatoxinogenic黄曲霉毒素的真菌生产需要一定的环境条件(9,17]。因此,食品和饲料样品不含黄曲霉毒素,但aflatoxinogenic真菌污染可能容易受到黄曲霉毒素的污染,当环境条件在存储适合黄曲霉毒素生产。

本研究的意义也来自报告结果显示,大约25%的全球供应的真菌毒素污染的食物和黄曲霉毒素造成最严重的健康问题18]。此外,还有其他报告强调答:寄生作为最重要的aflatoxins-producing物种污染食品和饮料供人类消费和开发新的具体的必要性高度敏感的PCR检测的分析(18- - - - - -20.]。

在讨论结束的时候,我们想强调的另一个重要的问题关于食品或饲料与黄曲霉毒素污染。黄曲霉毒素的允许数量的总和(B1, B2, G1和G2)在作物如坚果、花生、谷物、和干果是4.0和15.0的范围内μ克/公斤在欧盟(21)和< 20磅(μ克/千克)在美国(22)和约旦哈希姆王国(23]。在目前的调查,发现数量总黄曲霉毒素的检测样本低于20磅的食物。然而,重要的是要注意,长期慢性暴露于低剂量的黄曲霉毒素可以增加肝癌的风险24,25]。

5。结论

本研究首次提供了有用的信息的流行答:寄生食品和饲料中在约旦。受污染的食物和样品答:寄生包含四种类型的黄曲霉毒素(B1, B2, G1和G2)。的高发病率答:寄生在受污染的食品和饲料强调需要使用快速、低成本、可靠的微生物和分子检测方法的真菌。研究提供了进一步的证据支持微生物和黄曲霉毒素的分子检测方法,低成本的方法与高效液相色谱方法相比食品和饲料产品的连续监测。

确认

作者要感谢皇家科学学会Sumaya公主工业大学的约旦和技术支持相关的研究发表。