文摘

内生植物的Sporosarcina aquimarinaSjAM16103隔绝红树植物的呼吸根的内部组织矮小随着芽孢杆菌sp.和肠杆菌属sp。内寄生的美国aquimarinaSjAM16103克变量,能动的细菌量0.6 - -0.9μ1.7 - -2.0米宽μ米长,光橙棕色颜色在为期3天的文化中在胰蛋白胨肉汤26°C。这一毒株的核苷酸序列已经存入基因库加入GU930359数量。这植物内生细菌产生2.37μ摩尔/毫升的吲哚乙酸和含铁细胞代谢物。这一毒株可以溶解磷酸分子和修复大气氮。内生植物的美国aquimarinaSjAM16103接种到四个不同的植物在体外方法分析其刺激经济活动和在寄主植物的作用。内生的增长美国aquimarinaSjAM16103接种外植体比未经变质处理的控制外植体非常重要。根头发和早期根发展内生植物的观察美国aquimarinaSjAM16103接种外植体。

1。介绍

属Sporosarcina属于家庭芽胞杆菌科,是由Kluyver和范尼尔1)以适应球形或椭圆形的细菌细胞,DNA G + C含量低(40-42摩尔%),和MK-7为最主要的甲基萘醌类。Sporosarcina物种可以从其他成员的分化芽胞杆菌科,球菌样的或杆状细胞,能动性,孢子形成,拥有MK-7作为主要的甲基萘醌类和A4α肽聚糖变体。属Sporosarcina最初由两个物种,美国ureae和美国halophila(2,3]。然而,三个属的物种芽孢杆菌,即芽孢杆菌globisporus(4),b . psychrophilus(5),而b .巴氏(6),属于rRNA组2 (7),在他们的细胞壁含有赖氨酸,最近被转移到属Sporosarcina(8]美国globispora,美国psychrophila,美国巴氏还发现了一个新物种,美国aquimarina隔绝海水。然而,没有发表内寄生的报告美国aquimarina孤立的活细胞。因此,本研究旨在调查内寄生的的作用和影响美国aquimarina孤立的呼吸根答:滨。

植物内生细菌生活在植物组织内没有引起疾病的症状,常见的大量植物物种。植物内生细菌可以促进植物生长和产量和可以作为生物防治剂(9]。近年来,已经受到了人们足够的重视自然作物生长的方法的预期转向农业和环境可持续发展10]。植物内生菌促进植物生长由于固氮能力(11),植物激素的生产(12),增溶磷(13),和疾病控制14,15]。

植物内生微生物接种物,主要是细菌,被用作繁殖体启动代理,都一样在体外cocultures和移植16]。这是一个新兴的趋势在生物技术方法旨在减少化学工厂投入生产,同时增加植物健康、生产力,和抵抗疾病的可持续的园艺。

在目前的研究中,内生细菌分离得到的表面消毒呼吸根答:滨。隔离是确定表型和遗传型的。的隔离美国aquimarina被进一步调查。这种植物内生细菌接种到四个不同的植物,两个淡水植物(一种monnieri和泽兰属植物triplinerve)和两个红树林植物(Excoecaria agallocha和答:滨)分析其刺激经济增长的内生植物功效和作用。这些植物在社会选择根据他们的需求,因为他们有很高的药用和经济价值。用药物,用于治疗皮肤疾病,即使对麻风(17],艾滋病毒[18),真菌疾病(19),精神障碍(20.,21),和经济作为薪柴,火柴盒,纸浆17),用作饲料在印度和澳大利亚。

2。材料和方法

2.1。分离菌株和生长条件

内生细菌分离的内部组织健康的呼吸根。部分呼吸根约1厘米的直径与70%乙醇和0.1%升汞消毒(22]。消毒与无菌手术刀切除部分叶片。片(0.1厘米厚)放置在营养琼脂板和孵化26°C 48 h。细菌生长与呼吸根部分被反复镀在营养琼脂,纯化和文化被保持为孢子悬浮液通过冻结在20% (V / V)甘油。

2.2。表型特征

隔离Gram-stained,检查显微镜下的形态特征。一些生理特征包括酸生产糖(TSI),柠檬酸钠利用率、脲酶生产、淀粉、明胶水解,voges-proskauer反应进行了使用标准协议所描述的戈登et al ., (23]。酪蛋白水解后发现3天的孵化营养琼脂补充2%脱脂奶。增长的生理盐水(2%,3%,5%,7%,和9%)决定在营养肉汤基础培养基在孵化28°C 3天。也估计在选定的温度下(2、4、6、8、10、26日,32岁,40岁和50°C)和pH值(4.5,5.5,7.0和9.0)在琼脂偏孵化28°C 3天。

2.3。16 s rRNA基因序列分析

基因组DNA分离纯培养(24]。大片段(800 - 1100个基点)放大16 s rRNA的PCR使用引物5′TGA GGA AGA TAA TGA CGG-3′, 5′有条件现金援助CTA太极拳TCT TTC CAA CC-3′。50L混合物含有100 ng DNA提取、PCR反应1×聚合反应缓冲区,20 pmol的引物,200年μM核苷酸,1.5 U的Taq DNA聚合酶(Promega)。热循环条件下由一个初始变性在94°C 3分钟,30放大周期1分钟的94°C(变性),57°C 1分钟(退火),72°C 2分钟(扩展),在72°C和最终聚合4分钟。PCR产物纯化和测序。搜索的基因库/ EMBL / DDBJ / PDB数据库进行使用爆炸(blastn)搜索算法25)为了建立隔离的身份。

2.4。测定细胞脂肪酸组成

植物内生细菌的细胞脂肪酸组成进行了分析使用夏洛克系统(MiDi公司、美国),根据制造商的指示。

2.5。植物生长促进活动

2.5.1。IAA生产

吲哚乙酸(IAA)由细菌化验使用FeCl colorimetrically₃-HClO₄(26]。细菌生长在修改营养肉汤M26上24小时旋转搅拌机(150 rpm)在室温下种子文化。中包含(1000毫升蒸馏水)5克氯化钠,10 g蛋白胨、牛肉膏和10 g。在孵化后,100年L文化是接种10毫升最小盐(MS)中修改5 mML色氨酸(27),再次增长48小时在瓶上。中包含女士(1000毫升蒸馏水)1.36克KH₂阿宝₄,2.13 g Na₂HPO₄,0.2 g MgSO₄h·7₂O和微量元素。女士介质的pH值调整到7.0在高压灭菌法。色氨酸的解决方案是准备作为股票的解决方案包含(100毫升蒸馏水)10克葡萄糖,葡萄糖1 g, 1 g—l -色氨酸和0.1 g酵母提取物。股票的解决方案是通过无菌过滤0.2m膜滤器(微孔)。1.5毫升细菌肉汤培养在12000转离心5分钟。1毫米的上层清液加入2毫升FeCl₃-HClO₄试剂。25分钟后(后颜色密度达到最大值),混合物在紫外分光光度计在530 nm吸光度。IAA的含量产生每毫升文化估计使用一个标准曲线。人口数量的细菌中表达的文化集落形成单位(CFU)估计的英里,Misra板的方法。

2.5.2。磷酸溶解

磷酸溶解试验进行了定性电镀细菌的琼脂包含沉淀磷酸三钙。媒介是一个修改Pikovskaya介质(28]。

2.5.3。固氮作用

大气氮固定的细菌测试定性使用伯克的摘要中28]。

2.5.4。减少硫

减少硫的细菌被硫酸定性测试API琼脂(28]。

2.5.5。含铁细胞生产

含铁细胞生产测试定性使用chrome azurol年代(CAS)琼脂如亚历山大和zuber所述29日]。中科院琼脂板上的细菌文化传播有三个复制。橘色晕在殖民地隔夜孵化后表示含铁细胞生产。

2.6。与植物内生细菌接种的外植体

节段(长度:0.5厘米)的四个不同的植物(一种monnieri,泽兰属植物triplinerve, Excoecaria agallocha,矮小)被用在水里20分钟消毒,在70%的乙醇浸渍1分钟,其次是25分钟的次氯酸钠(25%)/渐变80(0.01%)解决方案和蒸馏和无菌水冲洗3次30.]。

的无菌外植体一种monnieri和泽兰属植物triplinerve在无激素Murashige-Skoog培养(MS)介质(31日的200年L(内寄生的Sporosarcina aquimarinaSjAM16103。的无菌外植体Excoecaria agallocha和矮小X在无激素培养基培养(M S Swaminathan研究基金会、印度)的200L(内寄生的Sporosarcina aquimarinaSjAM16103。

然后,这些外植体培养的光周期下16 h的光和8 h的黑暗下的辐照度52更易与m⁻²赛格⁻¹。没有内寄生的外植体Sporosarcina aquimarinaSjAM16103被标记为外植体的控制。

2.7。统计分析

整个实验是建立在随机设计的10个副本。所有收集到的数据从这些实验受到一个方差分析(方差分析)使用SPSS统计工具。显著水平(各种增长之间)是评价参数(拍摄长度、根数和根长)。

3所示。结果

3.1。形态

在这项研究中,13呼吸根的细菌菌株一个。玛丽娜L。其中,4个菌株(SjAM16101, SjAM16102、SjAM16103 SjAM16104)是遗传型的分析芽孢杆菌sp。肠杆菌属sp。Sporosarcina aquimarina,蜡样芽胞杆菌,分别。应变SjAM16103克变量,能动的细菌量0.6 - -0.91.7 - -2.0米宽米长(图1在为期3天的文化)和黄褐色的彩色光胰蛋白胨肉汤26°C。

3.2。表型特征

表型特征应变SjAM16103表1。最佳生长温度为32°C。应变SjAM16103增长26-50°C,但不是在2 - 10°C。增长的最佳pH值为7.0,经济增长被抑制在pH值低于5.0。应变SjAM16103增长2 - 9%氯化钠的存在。明胶水解,表明过氧化氢酶、脲酶和氧化酶的活动。酸是生产的三糖铁测试。脂肪酸成分的应变SjAM16103表3。气相色谱甲酯的应变SjAM16103图2。

3.3。16 s rRNA基因序列

应变SjAM16103直接测序的16 s rRNA PCR扩增后,及其部分核苷酸序列测定。16 s rRNA的应变SjAM16103序列长971个基点(表2),并被确认为Sporosarcina aquimarina最高相似度值的98%。的核苷酸序列美国aquimarinaSjAM16103已经存入基因库/ EMBL / DDBJ / PDB下加入GU930359数量。

3.4。植物生长促进活动

内生植物的美国aquimarinaSjAM16103生产2.37摩尔/毫升的IAA。这一毒株可以溶解磷酸分子和修复大气氮。橙色有光晕美国aquimarinaSjAM16103殖民地被观察到。这证实了美国aquimarinaSjAM16103是含铁细胞产生细菌(表4)。

3.5。接种的外植体美国aquimarinaSjAM16103

生长参数测量评估内生的增长促进功能美国aquimarinaSjAM16103在四个不同的外植体。根的数量计算。拍摄长度和根长度单位是厘米。测量记录;30天在淡水植物B。monnieri和E。triplinerve在红树林植物和35 - 45天E。agallocha和一个。玛丽娜。

3.5.1。在b . monnieri L。

接种外植体的拍摄长度和根长度增加一天相比,控制外植体。拍摄的长度和根接种的外植体孵化后30天高于控制外植体(图3)。最大显著()值在接种外植体(图的拍摄和根长度4)。无意义的值观察控制外植体。观察到的生长美国aquimarinaSjAM16103接种外植体比控制外植体(表非常重要5)。根的数量计算的美国aquimarinaSjAM16103接种外植体比控制外植体(图非常重要4)。

3.5.2。在大肠triplinerveVahl

增长的拍摄接种外植体逐渐增加,和它的长度确定5天后孵化。根是3天后孵化,他们的长度是决定5天后孵化。拍摄和根的长度美国aquimarinaSjAM16103接种外植体高于控制外植体(图5)。接种外植体的拍摄和根长度决定是非常重要的(比控制外植体的价值(表)5)。

根的数量被数的二次根。根的数量美国aquimarinaSjAM16103接种外植体是非常重要的(比控制外植体)。根头发观察孵化后10天美国aquimarinaSjAM16103接种外植体(图6),而根头发缺席控制外植体。这对进一步研究观察提供了特殊的浓度。

3.5.3。在大肠agallocha

的拍摄长度美国aquimarinaSjAM16103接种外植体,控制外植体,测定10天后孵化。拍摄接种外植体的长度是非常重要的(比控制外植体(图)7)。早期根发展观察美国aquimarinaSjAM16103接种外植体(图8)。根是在孵化后15天,而在控制外植体根发达孵化后30天。根的长度和根数美国aquimarinaSjAM16103接种外植体是非常重要的(比控制外植体(表)5)。

3.5.4。在答:滨Vierh

拍摄的增长美国aquimarinaSjAM16103接种外植体观察5天后孵化,孵化后测量了10天。然而,在控制外植体,观察拍摄增长10天后孵化,孵化后测量了15天。拍摄的长度美国aquimarinaSjAM16103接种外植体是非常重要的(比控制外植体(图)9)。根生长观察孵化后20天美国aquimarinaSjAM16103接种外植体(图10)。早期的叶子是观察到的美国aquimarinaSjAM16103接种外植体。根的长度美国aquimarinaSjAM16103接种外植体显著()高于根控制外植体(表的长度5)。

4所示。讨论

植物内生细菌是众所周知的在农作物9,32),但基本上没有在红树林植物调查。在目前的研究中,13个菌种从呼吸根孤立和四种(SjAM16101, SjAM16102、SjAM16103 SjAM16104)被选为进一步研究基于形态学和殖民。SjAM16103被确认为Sporosarcina aquimarina使用16 s rRNA,证实了使用生化测试和脂肪酸分析。这一研究获得的结果完美配合报道内生菌与其他主机通常大量物种可以孤立的从一个给定的主机,但是只有很少的物种存在在大量33]。美国aquimarina在韩国被隔绝海水(8]。然而,这是第一个报告美国aquimarina孤立的内部组织。

应变SjAM16103,美国aquimarina可能会产生含铁细胞和IAA。含铁细胞铁螯合配体,可以有利于植物通过增加溶解度的三价铁(Fe III),这对植物营养(否则不可用34]。IAA的生产提高了根系生长的植物通过刺激植物细胞伸长或细胞分裂35]。内生植物的呼吸根的殖民化美国aquimarinaSjAM16103提高整个工厂的增长。

结果表明,天然植物内生细菌在组织文化的恢复会导致改善植物生长和产量。目前的研究表明,植物内生美国aquimarinaSjAM16103孤立的呼吸根一个。玛丽娜没有主机特定的。然而,一些植物内生属展览没有宿主特异性和总是从属于不同组的植物,生长在不同的地理位置(36,37]。

在目前的研究中,另一个有趣的观察是内生植物的根的生长毛发发达美国aquimarinaSjAM16103接种外植体,根头发可以修复大气氮(38]。内生植物的N₂解决细菌似乎只占总额的一小部分内生细菌(39,40),并增加N₂解决人口植物已被视为可能提高固氮。这是第一个报告美国aquimarina孤立的活组织,可能产生IAA和修复大气氮。

这项研究已经直接找到内寄生的美国aquimarinaSjAM16103可以显著提高产量在四个不同的植物(B。monnieri,E。triplinerve,E。agallocha,一个。玛丽娜接种后)。的增长美国aquimarinaSjAM16103接种的外植体B。monnieri E。triplinerve E。agallocha,一个。玛丽娜比他们的控制外植体是非常重要的。叶子的发展美国aquimarinaSjAM16103接种外植体比控制外植体的更早。叶子是开发的美国aquimarinaSjAM16103接种的外植体一个。玛丽娜5天后孵化,而控制外植体,叶子是孵化后13天。变质剂似乎是成功的在这个micropropagated植物,有很少或根本没有其他微生物的竞争。可能会有巨大的好处是通过微生物的接种无污点的混合植物的移植在生长的早期阶段。植物的自然条件似乎与内生菌密切互动。

根是早些时候美国aquimarinaSjAM16103比控制外植体接种外植体。美国aquimarinaSjAM16103接种的外植体E。triplinerve显示根头发的生长,而这种特征是控制外植体的缺席E。triplinerve。早期的根源是观察到的美国aquimarinaSjAM16103接种的外植体E。agallocha。内生植物的美国aquimarinaSjAM16103似乎承诺增加作物产量,IAA和含铁细胞,产生固定的氮,可溶性磷酸盐。植物内生细菌的分布和生物活性值得探索,充分利用他们的居所内的植物。目前的研究表明,内生植物的美国aquimarinaSjAM16103可以用作生物肥料,随后可以使用的植物,从而提高植物的生长。

5。结论

在目前的研究中,红树林被选中,是因为红树林生态系统以高生产率。同时,呼吸根被选为本研究由于其机制(无氧呼吸),直接从大气中吸收气体和其他营养物质,如铁,从荒凉的土壤。这份报告指出,内寄生的美国aquimarinaSjAM16103促进植物生长和生产植物生长促进物质可能通过类似于促进植物生长rhizobacteria (PGPR)。植物生长促进细菌环境友好替代化肥和农药,使用的监管,有时是被禁止的,bioinoculants市场仍在扩大。因此,一个更好的理解植物内生美国aquimarinaSjAM16103可能有助于阐明其功能和潜在作用更有效地在发展可持续的系统在农业领域。

缩写

:	测微计
摩尔/ mL:	微摩尔每毫升
摩尔%:	硅藻土的百分比
吴:	纳克
pMol:	Pico摩尔。

确认

作者感谢Balasubramanian t博士,主任,海洋科学学院,Annamalai大学,印度,提供所需的研究设施。作者还要感谢大学拨款委员会的财政支持。