抗菌素耐药性和毒力因素的多样性铜绿假单胞菌与新鲜蔬菜

文摘

与增加的关注健康饮食,食用生蔬菜,本研究评估了新鲜蔬菜的污染程度铜绿假单胞菌在牙买加和研究了抗生素敏感性概要文件和各种毒性相关的因素的存在铜绿假单胞菌。分析表明,蔬菜零售市场和超市被广泛污染铜绿假单胞菌;从市场更频繁的被污染的产生,但并没有显著的差异。生菜和胡萝卜是最常被污染的蔬菜,而西红柿最少。绿脓菌素,色素生产(Pyoverdine pyomelanin和pyorubin),荧光素和海藻酸在这些隔离是很常见的。Imipenem、庆大霉素、环丙沙星是最抑制抗菌药物。然而,分离株耐药或显示敏感性降低氨苄青霉素,氯霉素,sulphamethoxazole /甲氧苄氨嘧啶和aztreonam,高达35%的隔离4抗菌药物产生了抗药性。多达30%的隔离是积极的fpv1基因,13%有多个基因。百分之六十四的隔离怀有一种胞外酶基因(挂式,exoT,exoU或exoY),和多个挂式基因很常见。我们得出这样的结论:铜绿假单胞菌是新鲜蔬菜的主要污染物,它可能是一个敏感的人在社区内的感染源。

1。介绍

铜绿假单胞菌oxidase-positive, nonfermentative、运动型和革兰氏阴性细菌无处不在,用途很广。而铜绿假单胞菌被认为是一个投机取巧的病原体,一些报告显示,机体也会导致感染健康的主机(1- - - - - -4]。进一步的证据表明,没有主要的毒性差异的临床和环境隔离,例如,克隆和pilin-type分布(5),菌毛蛋白基因(6),鞭毛蛋白基因(7),基因治疗多射流和III型分泌系统,孔蛋白的基因oprD(8)、溶血性和蛋白水解活动和入侵上皮细胞(9]。因此,食用生蔬菜已经被这种生物污染会严重影响人类的健康。

尽管许多生物与食品相关的植物是不致病的,许多人,包括蔬菜,可以通过insufficiently-treated污染水和肥料或可能受到杀虫剂的使用期间种植。污染可能发生,在收获、加工、分布,甚至在使用10,11]。

的内在和获得性耐药铜绿假单胞菌许多structurally-unrelated抗生素是由于一些改编,包括主动流出系统、细胞壁通透性降低,质粒收购,各种酶的表达,或通过生物膜的形成12,13]。发病机制涉及生产细胞外和细胞相关毒性的因素(14]。许多毒性因素表达通过细胞密度制约的机制称为群体感应(14]。这些额外的毒性因素包括弹性蛋白酶、脂肪酶、蛋白酶、和一些细胞毒素,编码挂式基因。弹性蛋白酶和碱性蛋白酶降解多种组织成分如蛋白质的元素结缔组织和分裂细胞表面受体的中性粒细胞(15]。

在目前的研究中,我们研究有机体的患病率和病人资料和各种毒性因素的存在铜绿假单胞菌隔绝蔬菜获得从不同市场和超市在牙买加。

2。材料和方法

2.1。微生物的分离和鉴定

17个人零售市场和超市网点,包括两个食堂提供午餐,位于几个教区在牙买加被选作研究。共有95个蔬菜样品包括生菜()、包心菜()、红球甘蓝()、胡萝卜(),甜辣椒(),黄瓜()、西红柿()和混合蔬菜沙拉()在塑料样品袋收集和存储4°C最多48小时。从每个出口大约7个样本收集。测试之前,样品袋是用70%的酒精擦拭,无菌刀被用来减少样品在无菌托盘。样本削减任何被宠坏了的部分,他们的叶子。样本被切成块,和25 g部分放入无菌225毫升大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB)。进一步十进制稀释使用生理盐水,整除被镀到溴棕三甲铵基琼脂。盘子在42°C 48小时,孵化和生物净化血液琼脂和MacConkey琼脂板上。此外,革兰氏染色剂,运动性、氧化酶和过氧化氢酶进行了测试。识别一个隔离的标准铜绿假单胞菌氧化酶积极性,过氧化氢酶积极性,增长42°C,和色素的生产(16]。铜绿假单胞菌PAO1和PAOR1 (b . Iglewski礼物),写明ATCC 27853(礼物r·汗)被用作参考菌株在所有测试完成。铜绿假单胞菌隔离是生长在血琼脂和MacConkey琼脂板来评估Mueller-Hinton平皿上纯洁和评估色素生产。Pyoverdine和绿脓菌素生产评估假单胞菌B和假单胞菌分别一个媒体。大肠杆菌分离纯化在MacConkey琼脂,然后接种三铁琼脂,琼脂尿素,席梦思床品公司柠檬酸琼脂,运动性Indole-lysine媒体。隔离显示相似的生化反应大肠杆菌标准菌株ATCC25922选择深造。除非特别指出,细菌生长在Luria-Bertani介质(Oxoid,贝辛斯托克,英国、美国)或在Mueller-Hinton肉汤或琼脂(马里兰州,正欲Cockeysville) 37°C 18 h。

2.2。抗菌药物敏感性试验

磁化率测试是由CLSI标准(原名NCCLS)磁盘扩散法17)使用普通antipseudomonad抗生素:氨苄西林(10μaztreonam(30克)μg)、头孢他啶(30μ氯霉素(30克)μg)、环丙沙星(5μg)、庆大霉素(10μimipenem (10 g)μg), sulfamethoxazole-trimethoprim (1.25/23.75μg),四环素(30μg) (BD生物科学,医学博士,美国)。接种物被暂停增长从磅肉汤准备开始5×10的浓度⁵cfu /毫升。Mueller-Hinton板块在35°C孵化16至18小时后接种生物和磁盘的位置,和抑制测量区域。

2.3。毒力基因的多重PCR检测

八个引物被用来评估III型分泌的分布(TTS)基因,挂式,exoT,exoU,和exoY(18]。一夜之间,细菌被种植在十二烷基胰蛋白示肉汤37°C,使用向导和DNA提取的基因组DNA净化设备(Promega corp .)根据制造商的指示。PCR成立如下:1μL的DNA模板(100 - 200 ng), 1μ美国每个PCR引物的L (IDT),每个引物(最后一个200毫米的浓度),10μL (GoTaq MasterMix (Promega), 1μL无菌水。消极的控制包含1μL无菌水而不是DNA。PCR进行如下:最初在94°C 2分钟变性;36个周期94°C的30年代,58°C 30年代,68°C, 1分钟;最后在68°C扩展步骤7分钟。在2%琼脂糖凝胶和反应产物分离和0.5毫克/毫升的溴化乙锭染色。

2.4。多重PCR鉴定的fpvAI, fpvAII, fpvAIII

6个引物被用于不同的同步放大fpvA三种类型的基因,这代码pyoverdine受体所产生的铜绿假单胞菌(19]。PCR成立如下:1μL的DNA模板(100 - 200 ng), 1μL的PCR引物(IDT),(最后一个200毫米的浓度每个引物),10μL (GoTaq MasterMix (Promega),和3μL无菌水。消极的控制包含1μL无菌水而不是DNA。使用下列条件:初始变性在94°C 3分钟,紧随其后的是30个周期在94°C与变性30年代,退火55°C 30年代和72°C 30年代,伸长和终止与最后一个周期在72°C 10分钟。

2.5。统计分析

使用执行统计分析测试。差异被认为是重要的。

3所示。结果

从市场的蔬菜样品(72.3%;范围50 - 100%)更频繁的污染比从超市(55.6%;14 - 86%范围)。然而,这种差异是不显著。生菜(89%在超市;100%市场;在超市)和胡萝卜(67%;100%市场;)是最常受污染的蔬菜(表1),而西红柿有污染的最低水平(22%在超市;50%市场;)与1.5×10项为零³cfu / g。一个超市在东部地区生菜作为唯一的样品被污染铜绿假单胞菌数> 3.0×10²cfu / g。除了西红柿和生菜,其他所有样本含有高水平的铜绿假单胞菌。样品混合蔬菜沙拉都是污染,数量为2.6×10²cfu / g和> 6.0×10³cfu / g。

总共88的隔离铜绿假单胞菌和三个分离的大肠杆菌从95年蔬菜样品中恢复过来,两个蔬菜沙拉包括在这项研究(表吗2)。隔离从所有蔬菜样品中恢复过来,几个样品显示细菌活菌数高(2.6×10²> 1.2×10⁶cfu / g)。

Imipenem(100%)、庆大霉素(97%)、环丙沙星(93%)、头孢他啶(79%)是最抑制抗生素发现在这项研究中基于敏感性结果(图1)。然而,所有隔离耐氨苄青霉素,84%和83%的人耐氯霉素和磺胺甲恶唑/甲氧苄氨嘧啶,分别。然而,这是担心减少脆弱的感情被观察到aztreonam(41%)和四环素(29%),考虑到这些环境隔离。对于后一种抗菌药物,这些价值观除了电阻观测频率的55%。耐多药耐药性(定义为三个或更多抗菌药物)在隔离的区域:23%,35%,和20%的隔离是对三个,四个,分别和五个抗菌药物。两个分离株耐六抗菌素。这两个隔离来自生菜样品在东部地区。胡萝卜,卷心菜,黄瓜,生菜是蔬菜经常与耐药相关的隔离。抗氯霉素、氨苄青霉素和磺胺甲恶唑/甲氧苄氨嘧啶是最频繁。

隔离产生pyoverdine pyorubin、绿脓菌素pyomelanin,荧光素色素。然而,很明显,更多的色素分离的来源在西方牙买加。有些颜料发生于所有区域隔离(pyoverdine pyomelanin,和荧光素),其他人只发生在中部和西部的隔离(pyorubin)或西部和东部地区(绿脓菌素)。在所有,42%隔离产生荧光素而68% pyoverdine产生隔离。几个隔离()nonpigmented和黏液状的海藻酸的生产过剩,观察到在所有地区,与所有蔬菜样品有关。一个隔离的蔬菜沙拉non-pigmented,而另一个产生pyoverdine和荧光素。

pyoverdine受体基因的分布见图2。而隔离的一大部分fpvI基因只(22%),很大一部分(13%)有多个基因。的总频率隔离包庇fpv1,fpv2,和fpv3基因分别为30%、20%和23%,分别。这相关的观察隔离pyoverdine色素生产的68%。Pyoverdine受体基因被确定在所有地区,和多个基因与卷心菜和胡萝卜样本。两个隔离所有三个废票受体是白菜样本:一是从包心菜样本从中部地区和东部地区的另一个是红球甘蓝。

七十三(64%)隔离为胞外酶基因pcr阳性:6%呈阳性挂式(图3);exoT,exoU,和exoY被确定在40%,33%,和30%的隔离。虽然没有隔离表示挂式结合其他胞外酶基因,14%的隔离是积极的exoT,exoU,和exoY。这些挂式基因发生于所有区域隔离,更频繁地与胡萝卜、生菜、白菜样本。

我们确定了19个隔离与多药耐药性、多种胞外酶的基因,和至少一个废票受体基因。之间没有明显的协会指出色素生产和多重耐药性。然而,non-pigment生产商(海藻酸生产商)不太可能有胞外酶基因或废票受体基因,除了两个隔离。一个来自一个红球甘蓝在东部地区,是抵抗五抗菌药物,exoT和U和fpv1,fpv2,和fpv3。另从西部地区的甜辣椒,对四种抗菌素,exoU,exoY fpv2,和fpv3。一个孤立的蔬菜沙拉样本对四种抗菌素,是色素exoT,exoU,和exoY除了fpv3基因。

4所示。讨论

观察显示相当大的细菌负荷由蔬菜样品总可行的数量从10²超过10⁶cfu / g。存在大量的可行的细菌,预期的指标蔬菜的保质期,增加腐败的可能性,以及创建联合暴发的可能性(20.]。近几十年来,公共健康促进健康的生活方式导致了增加对新鲜农产品的需求在许多国家,包括发展中国家像牙买加。因为这些产品通常生吃或很少做饭,消费者面临污染微生物感染的风险增加。尽管风险管理战略制定了在许多国家,报告疾病与污染产生的数量增加了在美国(21)和欧洲(22]。虽然大多数报告已经确认沙门氏菌和大肠杆菌作为主要创建联合病原体,我们必须保持警惕潜在的风险等铜绿假单胞菌。

在这项研究中,我们试图确定的流行铜绿假单胞菌污染新鲜蔬菜在市场和超市在牙买加。我们注意到蔬菜市场和超市受到了污染,生菜和胡萝卜是最常见的污染。大量研究调查了在供应链的潜在的污染来源和采后阶段。例如,在收获前的阶段,病原体可以建立自己在种植庄稼,收割后的风险可以被放大通过进一步直接污染或现有病原体的扩散种群在处理和采后的处理过程。水可能是一个重要的污染来源,包括径流从附近的动物牧场和灌溉污染来源(23,24]。此外,使用水采后加工也起到了一定的作用,例如,在试图阻止进口果蝇(25]。已是不争的病原体可能传播环境中通过使用堆肥或生动物肥料不足或污水26,27),通过野生动物的粪便28),或通过果蝇(29日,30.]。收获后的流程,从存储和冲洗到切割,也可能的污染源(31日),在水冷却器和不当的使用纯净水,用于存储和处理大量的新鲜农产品,可能导致污染的全部(32]。鉴于几乎没有隔离大肠杆菌相对于铜绿假单胞菌,我们得出的结论是,从nonmanure来源污染的可能性更大,尤其是土壤、苍蝇、蟑螂、或啮齿动物。换句话说,在环境和生物体的存在增加了温度和湿度,比如那些通常在热带国家,可能诱发因素增长或殖民的蔬菜。事实上,弗兰克不卫生的条件下没有观察到在市场上包括在这项研究中,所以很可能选择使用的生长介质铜绿假单胞菌而不是大肠杆菌。社长和同事(茂晴,33)指出,污染不明显降低与次氯酸钠消毒后,共同代理用于提供防止致病菌。从历史上看,科雷亚et al。34)报道,19%的新鲜蔬菜喂给肿瘤患者的样本被发现被污染铜绿假单胞菌尽管1%的次氯酸盐被用作消毒剂。类似的研究中,那些作者报道,生菜是蔬菜,取得最高频率的隔离。进一步,作者报道,一些蔬菜pyocin打字和血清型的分离被发现是相同的那些从临床来源中恢复过来。

生菜和胡萝卜是相关的两个主要的蔬菜铜绿假单胞菌各地区的污染分析研究。这种生物的生长增加生菜可能由于其广泛的表面积。多种因素可能是导致高污染所产生的来自所有超市和市场在岛建议之前。没有隔离的主要区别铜绿假单胞菌从不同地区评估似乎都被这同样涉及有机体。没有主要蔬菜之间的数量差异。

蔬菜的内在组织应该是免费的微生物35]。在这项研究中,尽管外面的树叶从白菜和生菜,复苏的铜绿假单胞菌仍然相当高。市场样品预计是相对更多的污染铜绿假单胞菌比超市。考虑到贫穷的人买生产市场,很可能这些往往在风险增加额外负担的不足或健康保险。除了超市和市场,认为消费者可能进行更多的在使用前清洗。通过清洗,可用更多的营养和潜在致病菌传播从受污染部分未受污染地区36]。此外,即食什锦蔬菜沙拉是经常被污染和可能的质量直接关系到投入市场或超市来源。

尽管健康个体需要> 10⁵cfu /毫升铜绿假单胞菌的摄入,< 10³cfu / g可能寄生易感个体的肠道中,并可能导致胃肠道感染,菌血症,造血的传播(37]。假单胞菌败血症婴儿表现为坏死性肠损伤史的腹泻也可能(38]。细菌在胃肠道被视为重要的免疫功能不全的患者,如接受抗癌化疗,直接关注的是来自社区的病原体也可以感染人,可能导致致命的菌血症(2)和社区获得性肺炎(1]。其他报告显示社区感染的发生率假单胞菌胃肠道感染导致婴儿腹泻(39]。

此外,我们注意到,这些孤立的几个多个pyoverdine受体基因。Pyoverdine作为含铁细胞和支持铜绿假单胞菌获得更多的铁从宿主细胞进行代谢功能,因此会增加这种生物的毒性。Pyoverdine也有细胞毒性效应,因为它刺激活性氧的生产能力,已被确定为一个重要的组成部分在生物膜生产14]。绿脓菌素也促成了这种生物的毒性。像pyoverdine一样,它是有毒的细菌和真核细胞,这是由于活性氧中间体生物生成(40]。在一项研究41),我们注意到隔离产生pyoverdine或绿脓菌素更有可能产生额外的毒性因子。因此不足为奇观察多个的程度挂式基因和/或废票受体基因在这些生物。这些基因的表达是由群体感应42),是参与的发病机制铜绿假单胞菌(43]。

海藻酸生产铜绿假单胞菌是一个重要的毒力因子的表达式允许细菌抵抗吞噬作用。这个表达式有助于发展和持久性的细菌在慢性肺部感染患者,包括囊性纤维化患者(44- - - - - -46]。这些海藻酸生产菌株有多个挂式和废票基因。

许多隔离被发现有几个基因表达和分泌3型分泌系统(tts)。在这项研究中,我们指出挂式基因并不会出现在任何其他胞外酶基因和建议挂式可能是互斥的挂式基因。胞外酶抑制ρGTPase家族信号,麻痹巨噬细胞,抑制吞噬作用[47,48]。挂式和ExoT是高度相关的,双重功能。ExoT导致肌动蛋白细胞骨架破坏和抑制内化的细菌(49,50]。ExoU能溶解宿主细胞膜和细胞毒性的影响(51),而ExoY充当腺苷酸环化酶,增加细胞内营的水平(52]。

铜绿假单胞菌是医院的主要原因之一,由于其能力和社区获得性感染引起各种各样的疾病及其高层一些抗生素的耐药性。人们最初认为,这种能力是由于外膜(OM)渗透率较低。然而,现在已知结果的共同作用的多药耐药性泵与OM渗透率(53]。然而,作物灌溉和应用的农药污染的水可以耐药细菌的主要来源,和抗菌素耐药性也可能来源于细菌适应重金属和植物代谢产物,导致耐多药流出系统的形成(54]。这些适应性也可能会导致增加现有射流系统的表达。孤立的研究,许多显示多个抵抗抗菌素的测试。虽然大多数的分离株对头孢他啶敏感,环丙沙星,庆大霉素,imipenem,担心这些环境的隔离方面表现出显著的频率的阻力或减少脆弱的感情很多抗菌药物包括氨苄青霉素、氯霉素、四环素、磺胺甲恶唑/甲氧苄氨嘧啶,和aztreonam。值得注意的是,许多这些隔离表示pyoverdine色素和荧光素也alginate-producing菌株。虽然抗菌素耐药性似乎没有与色素的生产(41),可能需要更多的工作在环境隔离,尤其是那些与生产有关。已经表示,受污染的蔬菜可能是一个重要的储层或社区和医院的来源铜绿假单胞菌。

5。结论

铜绿假单胞菌生蔬菜的污染被发现在牙买加流行污染观察收集的样本中,从市场和超市在所有地区(东部、西部和中部的位置)。许多这些分离株耐药或多个抗菌药物敏感性降低,产生色素或海藻酸,有多种胞外酶或pyoverdine受体基因。因为增加的关注健康饮食和蔬菜的消费,这是一个重大的健康问题的可能性无害的致病菌的传播可以毫无戒心的和脆弱的个人来完成。因此,适当的卫生习惯的应用在食品生产/供应链是至关重要的。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的资助标准局牙买加(k . Allydice-Francis)。作者感谢加勒比海北部大学和西印度群岛大学莫娜,牙买加促进这个研究和其他一些人的建议。

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