文摘

客观的。我们假设HMGB1与细菌在复杂的组件,如鞭毛蛋白、CpG-ODN,有限合伙人,促进hiv - 1复制。此外,我们研究了在HIV-1-infection antiflagellin抗体的水平。方法。长期HIV-1-infected U1和坏死细胞被刺激提取/重组HMGB1在复杂与TLR配体或孤独。hiv - 1复制估计通过p24抗原在文化上层清液刺激后48 - 72小时。的存在系统性anti-flagellin 51 HIV-1-infected患者免疫球蛋白决心和19控制通过免疫印迹或内部ELISA。结果。鞭毛蛋白、有限合伙人和CpG-ODN诱导较强的hiv - 1复制当一起孵化坏死提取或重组HMGB1比任何激活的化合物。此外,坏死的刺激效应提取抑制HMGB1的损耗。高浓度的anti-flagellin抗体存在于血浆从HIV-1-infected病人和明显降低在2年的抗逆转录病毒治疗。结论。我们的研究结果暗示可能HGMB1-bacterial复合物的作用,由于微生物易位和细胞坏死,hiv - 1免疫激活的发病机理。我们建议鞭毛蛋白是一种重要的微生物产品,调节病毒复制和诱导适应性免疫反应在活的有机体内。

1。介绍

高效抗逆转录病毒疗法(ART)抑制复制人类免疫缺陷病毒1型(hiv - 1)与标准技术检测水平在大多数病人治疗,但仍有一个持续的低级复制在大多数或所有的病人1]。此外,免疫激活的进步hiv - 1感染(2- - - - - -4),虽然在艺术免疫激活的程度却降低了,这不是规范化(5]。持久的免疫激活的致病机制仍进一步确定。这是特别重要的,因为研究表明,剩下的免疫激活可能引起器官损伤,例如,增加心血管疾病的风险和可能的神经认知功能障碍(5,6]。

胃肠道(GI)免疫系统似乎发挥核心作用的免疫发病机制的激活(7]。CD4 + T细胞的早期戏剧损耗从肠道粘膜免疫激活,因为这粘膜免疫损害损害正常屏障功能,允许从肠道细菌易位增加产品内腔进入循环(8]。我们和其他人已经表明,微生物易位在hiv - 1感染通过增加血浆LPS水平与进步的疾病和学科,艺术水平下降了(9- - - - - -11]。

此外,我们和其他人暗示alarmin高机动组绑定1蛋白质(HMGB1)调节hiv - 1复制在体外和对免疫系统的激活12- - - - - -14]。因此,等离子体HMGB1含量升高HIV-1-infected患者,减少有效的艺术(11,15]。HMGB1从损坏或坏死细胞释放到细胞外环境,它可以作为一种强有力的促炎标记通过刺激细胞因子表达单核细胞和内皮细胞16,17]。HMGB1本身似乎并没有炎性活动(18,19),但具有高度的亲和力与其他分子形成复合物,如有限合伙人和CpG-DNA [20.]。这些复合物可能绑定到不同的受体,包括TLR4和TLR9识别,促进多种炎症和免疫反应(20.,21]。

我们研究的目的是探讨是否复合物HMGB1 TLR配体,如鞭毛蛋白,可以实现协同诱导hiv - 1复制promonocytic细胞系。

2。方法

2.1。道德的声明

所有的研究涉及人类参与者根据表达的原则进行了《赫尔辛基宣言》。病人给他们通知书面同意和批准的研究协议区域伦理委员会在斯德哥尔摩,瑞典医嘱2005/3:10)。

2.2。试剂

脂多糖(LPS)和(phorbol-12-myristate-13-acetate)得到了PMAσ(美国密苏里州圣露易丝),il - 1β从研发系统(明尼阿波利斯,美国),和CpG-ODN B型(ODN2006),纯化鞭毛蛋白(S.typhimurium),anti-flagellin(警察)抗体InvivoGen(美国圣地亚哥,CA和Abcam,剑桥,英国)。重组HMGB1 (hm - 116)从HMGBiotech购买(意大利米兰)或从研发系统(明尼阿波利斯,美国)。我们还利用重组HMGB1 (19]是一种礼物教授海伦娜Erlandsson-Harris CMM / KI,斯德哥尔摩。

2.3。细胞培养

U1细胞,subclone来自U937细胞,通过艾滋病研究和参考试剂项目(NIAID, NIH)。U1细胞长期感染hiv - 1和特点是本构水平低的病毒由几个细胞因子表达式,可以调节和佛波醇酯。这些细胞被维护在RPMI介质(Gibco)补充10%胎牛血清,谷氨酰胺和抗生素。细胞被播种在200 000 /毫升96 -孔板和复合物/ TLR-ligands /控件被添加和孵化48或72小时。

2.4。病人

患者()给艺术,跟着的传染病,卡罗琳斯卡大学医院,包括斯德哥尔摩,19名健康对照组。病人的招聘是根据样品的可用性以及病毒学反应经过2年的艺术。33个人检测不到病毒载量和18检测病毒血症(nonresponders)治疗后2年。这组51例(42)前面描述的(11]。患者的年龄和性别分布和控制相似(平均年龄38年,52%的女性)。

2.5。坏死细胞的提取做好准备

坏死提取得到如前所述[22]。短暂,坏死引起的外周血单核细胞(PBMCs)健康献血者(30×10⁶细胞/毫升)通过暴露6冰冻和解冻周期。细胞碎片被离心分离,上层清液是通过一个0.2μ膜和收集。HMGB1在坏死提取物的浓度是40μ估计的g / mL,免疫印迹(数据没有显示)。此外,250年μL坏死的提取与多克隆抗体anti-HMGB-1孵化(Abs)从ABCAM(英国剑桥)。样本为16个小时在4°C的环境。控制、非特异性Abs(兔多克隆免疫球蛋白)是利用。通过添加25免疫复合物被移除μL / G的琼脂糖的提取、孵化为1.5小时在4°C,和离心机。上层清液的收集和25的过程再次重复μ在4°C L琼脂糖1小时。

2.6。HMGB1复合物的制备

坏死提取或拌HMGB1was TLR-ligands,有限合伙人,CpG-ODN, il - 1,在PBS鞭毛蛋白在不同浓度和孵化16小时在4°C。给出了浓度数据1- - - - - -3。次优刺激浓度(U1细胞能够引发艾滋病毒复制)的坏死提取以及有限合伙人,鞭毛蛋白,CpG-ODN, il - 1β估计在一系列的实验中(数据不包括)。复合物也混合并加热变性的95°C五分钟来验证复杂的刺激效应形成U1细胞。

2.7。表征HMGB1与免疫印迹

相同体积的坏死细胞提取物,HMGB1-depleted坏死细胞提取物,以及重组HMGB1蛋白被解决在10 - 20%三羟甲基氨基甲烷/甘氨酸凝胶和液转移到硝酸纤维素(美国卡尔斯巴德表达载体)。细胞膜在一夜之间被孵化与anti-HMGB1 Abs 1: 2000稀释。第二天,膜被孵化1 h和辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(通用电气、医疗),提出对兔免疫球蛋白1:10000稀释。蛋白质终于可视化使用ECL试剂(通用电气、医疗)。

2.8。免疫印迹Antiflagellin抗体

大约1.88μg重组鞭毛蛋白的双重的连续稀释系列(4),在预制10 - 20% SDS - page凝胶电泳凝胶(英杰公司)三羟甲基氨基甲烷/甘氨酸/ SDS缓冲液。同样,细菌鞭毛的提取大肠杆菌应变O126: H2和aflagellate大肠杆菌O21: H - (CCUG目录编号11425和11326年,什么样的礼物Andrej Weintraub教授临床微生物学/ KI,斯德哥尔摩),准备新鲜一夜之间从一个接种也决定sds - page凝胶如前所述。蛋白质被electroblotted到iBlot凝胶转移栈硝化纤维膜,使用iBlot印迹干燥系统(表达载体),制造商推荐的。阻塞后1小时的硝化纤维膜阻断缓冲区(PBS补充0.05%渐变和含有10%脱脂牛奶),探讨了这些墨迹与初级抗体在一夜之间在4°C缓慢的搅拌。作为主要抗体,血清HIV-1-infected或对照组稀释1:1000年,单克隆或多克隆anti-flagellin Abs是使用。第二天,包含0.05%的膜是用PBS(卷/期)渐变,然后结合抗体被发现通过使用HRP-conjugated二级Abs(皮尔斯)对人类免疫球蛋白1:10000稀释。蛋白质的乐队是由化学发光可视化(热科学)。确认蛋白带,两个免疫印迹膜HIV-1-infected患者和对照组被脱光衣服,reprobed鼠单克隆抗体针对鞭毛蛋白。然后结合抗体被发现通过使用HRP-conjugated二级抗体,提高对鼠标(DAKO;1:4.000)。

2.9。具体和总抗体测定

麻疹抗体滴度与鞭毛蛋白和免疫球蛋白水平评估ELISA。内部anti-flagellin-specific免疫球蛋白ELISA开发使用纯化鞭毛蛋白单体美国沙门氏菌感染(InvivoGen)。之前它已经表明,人类血清有类似的识别模式的鞭毛蛋白单体是否与鞭毛大肠杆菌或美国沙门氏菌感染(23]。短暂,microwell板块(MWP)与纯化鞭毛蛋白涂在一夜之间美国沙门氏菌感染(25 ng /)。第二天,等离子体HIV-1-infected和对照组样本稀释1:1000年应用于井与鞭毛蛋白涂层。孵化和洗涤后,mwp孵化HRP-conjuggated反人类免疫球蛋白。总免疫球蛋白ELISA,制造商的过程之后(MABTECH, Nacka,瑞典)。的Enzygnost Measeles病毒免疫球蛋白酶联免疫试剂盒(贝林、德国)是用于量化antimeasles抗体。

2.10。血浆hiv - 1 RNA量化和CD4 + / CD8 + t细胞数量

血浆hiv - 1 RNA水平(COBAS Amplicor测试罗氏分子系统;美国;检测极限40拷贝/毫升)和t细胞计数(流式细胞术)进行评估,作为临床常规的一部分。

2.11。hiv - 1复制试验

上层清液收集在表示时间点检测艾滋病毒p24抗原的存在和建筑师i2000 HIV - 1 Ag / Ab组合检测系统(美国雅培诊断,艾伯特公园,IL)。p24浓度计算的几个标准稀释p24蛋白质包含在每次运行。

2.12。统计数据

数据作为中位数、四分位范围和范围。与Mann-Whitney组之间的差异进行分析U以及和社会团体内部的变化从基线到研究结束时被Wilcoxon测试评估。Jonckheere-Terpstra测试是用于趋势分析和相关性分析采用斯皮尔曼法。使用小动物——一张长有显著性水平为0.05。与SPSS统计分析软件,版本15.0(美国芝加哥SPSS公司)。

3所示。结果

3.1。在U1细胞坏死细胞提取上调hiv - 1复制

确定一个内源性信号的影响,与细胞损伤有关,在hiv - 1复制,我们生成的可溶性健康捐献者PBMCs坏死的摘录。免疫印迹证实存在大量HMGB1的提取物。此外HMGB1-depleted提取得到免疫耗竭利用特定anti-HMGB1抗体(图1(一))。在最初的实验中,U1细胞暴露在坏死提取、HMGB1-depleted提取,分别和PMA。HIV p24抗原在细胞上清液浓度测量后72小时(图1 (b))。病毒复制的水平高出约2倍刺激后坏死提取相比,模拟细胞()。与PMA刺激了高10倍比刺激与坏死提取病毒复制。值得注意的是,除了坏死提取枯竭的HMGB1并未导致增加病毒复制,而控制,表明HMGB1至关重要的是导致坏死提取的刺激效果。

3.2。TLR配体相互作用效应和坏死在hiv - 1复制U1提取细胞

之后,我们刺激U1和坏死细胞提取物,TLR配体(有限合伙人,鞭毛蛋白,CpG-ODN)和il - 1β单独或与坏死提取和TLR配体的配合物或il - 1β。值得注意的是,与所有TLR配体刺激,结合坏死提取,导致病毒复制高于刺激与坏死提取或TLR配体(图2)。因此,与LPS刺激,CpG-ODN和il - 1β复合物与坏死提取导致1.5 2-fold-increased病毒复制单独每个组件相比,而鞭毛蛋白结合坏死提取了7倍增加复制比独自鞭毛蛋白,13-fold-increased复制比坏死单独提取。复合物孵化前的预热细胞导致废除刺激信号,暗示活性化合物依靠完整的蛋白质结构(数据不包括)。

3.3。TLR配体相互作用效应和HMGB1在hiv - 1复制U1细胞

为了探索如果HMGB1可能模仿坏死extract-TLR配体的协同效应,我们挑战U1细胞复合物HMGB1和细菌组成的物质。事实上,刺激微生物产品(有限合伙人、鞭毛蛋白或CpG-ODN)结合HMGB1导致更高的病毒复制比刺激HMGB1或TLR单独配体(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。与LPS刺激、鞭毛蛋白和CpG-ODN结合HMGB1导致1.5 2-fold-increased病毒复制单独每个组件相比,虽然刺激效应并不突出与TLR配体结合坏死提取。

3.4。剂量依赖性抑制Anti-TLR5鞭毛蛋白

众所周知,鞭毛蛋白的免疫反应是由TLR5。调查anti-TLR5抗体能否阻止鞭毛蛋白的诱导效应,我们首先preincubated U1和anti-TLR5抗体和细胞随后坏死提取与鞭毛蛋白补充道。鞭毛蛋白结合HMGB1-depleted提取了3-fold-increased病毒复制而耗尽单独提取,而鞭毛蛋白结合坏死提取增加了4倍而坏死提取(图3 (d))。预培养U1细胞的坏死extract-flagellin之前与anti-TLR-5抗体复合物导致剂量依赖性抑制这种刺激效果(P对于趋势< 0.001)。单独添加anti-TLR5抗体并不影响病毒的复制。

3.5。检测Antiflagellin HIV-1-Infected患者的抗体

鼓励的在体外我们旨在评估数据是否鞭毛蛋白是一个潜在的重要的抗原在活的有机体内在hiv - 1感染。因此,HIV-1-infected患者和对照组的血清样本被用来测量flagellin-specific抗体水平的免疫印迹分析。当稀释1:1000年,所有的HIV-1-infected患者的血清样本分析,表现出很容易被承认前两个乐队的鞭毛蛋白来源于稀释美国沙门氏菌感染(图4(一)上面板)。相对增加flagellin-specific免疫球蛋白在观察艾滋病患者如果血清样本稀释1:500。相比之下,只有一个控制主体(CS # 2)鞭毛蛋白检测微弱的最高稀释(图4(一)、较低的面板)。虽然半定量的分析发现乐队没有执行,flagellin-specific观察免疫球蛋白的水平在所有情况下HIV-1-infected患者明显升高。类似的模式anti-flagellin观察免疫球蛋白等离子体代替血清时使用。为了解决鞭毛蛋白的特异性免疫球蛋白,我们从鞭毛和aflagellate受到细菌溶菌产物大肠杆菌蛋白质sds - page凝胶上分离。与hiv - 1血清蛋白免疫印迹(作为主要抗体)显示出类似的模式时使用了多克隆抗体anti-flagellin确认的特异性抗体并不局限于重组蛋白(图4 (b))。

此外,我们使用了anti-flagellin ELISA评估水平的鞭毛蛋白免疫球蛋白的等离子体HIV-1-infected病人之前和之后两年的艺术。基线含量严重超标的鞭毛蛋白抗体被发现HIV-1-infected患者相比控件()(图5(一个))。这种差异坚持()当鞭毛蛋白抗体总免疫球蛋白(图进行调整5 (b)),这表明鞭毛蛋白抗体的高度并不是由于hypergammaglobulinemia。此外,分析antimeasles抗体在10严重免疫缺陷患者CD4 + t细胞计数(≤200)支持的海拔鞭毛蛋白抗体并非由于多克隆激活网上补充表1(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2012/263836)。鞭毛蛋白的水平免疫球蛋白、免疫球蛋白总量和比例鞭毛蛋白免疫球蛋白/总免疫球蛋白显著降低整个集团(经过两年的艺术,,,分别地。数据5(一个)- - - - - -5 (c))。此外显著减少的鞭毛蛋白免疫球蛋白水平观察也当患者分为那些成功的艺术和剩余的nonresponders低水平的病毒复制两年后开始艺术(;、职责)。艺术后总免疫球蛋白水平不降低nonresponders一样成功治疗患者()(数据未显示)。

我们没有发现鞭毛蛋白的水平之间的相关性免疫球蛋白和病毒载量和CD4 / CD8 t细胞数量。相比之下,42个病人的子群中我们此前分析HGMB1血浆LPS,显著水平之间的相关性被发现鞭毛蛋白免疫球蛋白和有限合伙人(;鞭毛蛋白之间)以及免疫球蛋白/总免疫球蛋白比例和有限合伙人(;)(数据未显示)。

4所示。讨论

微生物易位被描述在炎症性肠病等不同条件下,嗜中性白血球减少症,慢性病毒感染(6,24]。在hiv - 1感染,细菌易位的证明产品是主要基于有限合伙人数据(9,11,25,26]。然而,最初的观察增加LPS水平与记忆CD8 + T细胞激活和增强干扰素-α水平意味着其他因素的参与(9]。

因此,我们推测,HMGB1可能微生物产品和hyperinflammation[之间的这种联系27]。越来越多的证据表明,HMGB1不单独行动但形式稳定有效的促炎与其他分子复合物,如细菌产品或单链DNA (18- - - - - -20.,28]。因为我们有单独显示,HMGB1早些时候激活潜在的hiv - 1的复制在体外(12),我们决定我们的分析扩展到HGMB1复合物与细菌的效果的产品。在这里,我们现在,HMGB1与TLR在复杂的配体(有限合伙人,CpG-ODN鞭毛蛋白)和il - 1βpromonocytic细胞系诱导病毒复制,U1细胞。获得的数据与HMGB1源自坏死以及重组蛋白提取取得了类似的结果,尽管与坏死相关的刺激信号HMGB1更有力。这不足为奇,因为其他内源性危险信号应该预期在这个过程20.]。减少损耗的刺激效应HGMB1还支持我们的假设,这些复合物HMGB1的一个重要组成部分。

这些在体外发现了我们的注意力鞭毛蛋白作为一种有效的hiv - 1活化剂复制单独或与HMGB1复合物。细菌鞭毛蛋白存在于所有能动的细菌和发挥着重要的作用在调节肠道炎症跟肠道病原体的感染或炎症性肠道疾病(29日]。促炎的活动是产生主要通过TLR5 [30.,31日]。最近表明,鞭毛蛋白是主要的抗原激活先天和适应性免疫反应在肠道炎症在克罗恩病(32,33]。肠道屏障的破坏促进易位的共生细菌鞭毛,上皮驾驶的激活先天免疫细胞在固有层驻留。这种现象在异常结果还暴露鞭毛蛋白的免疫细胞,这一过程可能影响的平衡和功能不同的免疫系统t细胞存在于内脏相关子集(高尔特)和促进炎症29日,34]。

鞭毛蛋白免疫激活在hiv - 1感染的贡献已经预期[7),但数据稀缺。因此,暴露PBMCs鞭毛蛋白导致激活T细胞主要由中央内存和效应器内存表型(35]。此外,鞭毛蛋白能诱导hiv - 1基因表达在休息的记忆视为一个关键的CD4 + T细胞细胞水库hiv - 1感染者(36]。

我们的在体外和在活的有机体内结果显然是符合假设的一个重要的鞭毛蛋白在hiv - 1发病机理中的作用。因此,我们表明,鞭毛蛋白复合物能够显著刺激hiv - 1复制,至少从细胞单核细胞的来源。此外,我们发现高浓度的anti-flagellin免疫球蛋白出现在HIV-1-infected个人预计,这种观察在活的有机体内的影响。因此,我们不仅显示存在启动前鞭毛蛋白抗体水平升高的艺术也经过两年的减少表明减少暴露于抗原可能由于部分恢复gut-blood障碍(25,37]。hypergammaglobulinemia呈现在hiv - 1感染不能单独负责的鞭毛蛋白免疫球蛋白水平正常化的免疫球蛋白g并不影响结果。

适应性免疫反应升高鞭毛蛋白一直在以前观察到的条件与肠道屏障功能障碍,如克罗恩氏病和短肠综合征(23,24),与克罗恩病的严重程度(38]。同时,令Kamat et al。39)近日报道的子群anti-flagellin抗体(anti-CBir1)在4/26 HIV-1-infected患者CD4 + t细胞计数< 300细胞/ ul和LPS水平高。的CBir1鞭毛蛋白已被确认为免疫主导鞭毛蛋白克罗恩氏病,与梭状芽胞杆菌的物种。有趣的是最近提出的研究表明改变细菌成分的微生物群在hiv - 1感染的比例显著降低粪便从HIV-1-infected获得患者的梭状芽胞杆菌分类单元与控制(40]。虽然我们的分析是基于识别的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白跨越了两个守恒的N -和鞭毛蛋白(c端域的41使我们广泛的鞭毛蛋白抗体的检测,还需要更多的研究来确定抗体的特异性。此外,我们的研究结果值得未来研究自适应鞭毛蛋白的免疫反应在大群HIV-1-infected个人。

总之,我们的研究结果是细菌产品的新颖性和HMGB1形成活性复合物,不仅可以有效地创建一个促炎的环境也直接引发感染细胞的病毒复制。这种协同效应可能需要低水平的相互作用物质在复合物时,所显示别人(19]。我们也报告,鞭毛蛋白被认为是微生物产品,有助于免疫激活在hiv - 1感染。HMGB1 / TLR配体复合物的形成有直接影响的免疫激活,尤其是在疾病的晚期,破坏细胞和CD4 + t细胞坏死主要现象是由于损失,机会性感染和其他病理条件(27]。

确认

这项研究是在瑞典医学研究委员会的支持下,斯德哥尔摩郡议会,瑞典医生对艾滋病、瑞典医疗社会(SLS)和瑞典医学研究学会(彼得亚雷诺瓦克SSMF)。数据包含在本文提出了部分CROI会议2010年和2011年。

补充材料