多样性在可耕种的季节假单胞菌从一个干燥湖四弦吉他Cienegas(墨西哥

文摘

四弦吉他Cienegas盆地(建行)是一种生物多样性在奇瓦瓦沙漠水库,包括几个水系统受到明显的季节性。虽然一些研究主要集中在生物多样性库存,这是第一个研究描述了盆地季节性变化的多样性。我们抽样假单胞菌人群从四个不同的季节性变量水系统取样日期(2003年8月,2004年1月,2005年1月和2005年8月)。总共有70假单胞菌在季节得到隔离,由指纹(BOX-PCR)基因分型,分类学的16 s rDNA测序的特征。我们发现35个独特的基因型,和两个数值占主导地位的血统(16 s rDNA序列),占样本的64%:p . cuatrocienegasensis和p . otitidis。我们没有在赛季恢复基因型,但血统跨季节复发;p . cuatrocienegasensis孤立的只在冬季,而p . otitidis在夏天才恢复。我们统计表明,分类隔离的身份不是独立的采样季节,冬季和夏季的数量是不同的。除了基因的描述种群,我们显示增长率在不同的温度下的探索性的措施,表明种群之间的生理差异。,结果显示季节性变化在独立生存的水生的多样性假单胞菌人口从建行。

1。介绍

的四弦吉他Cienegas盆地(建行),在墨西哥,被描述为一个重要的生物多样性在奇瓦瓦沙漠水库。盆地由小(< 840公里²包含不同的水系统)山间的峡谷。大多数水生栖息地是短暂的,而不是永久性的或明显的季节性波动(1]。此外,大多数水生系统极其贫瘠地区由于磷水平(几乎可以忽略不计2]。尽管如此,建行是仅有的两位北美的沙漠生态系统的特点是高水平的物种特有现象包括脊椎动物、无脊椎动物(1,3),以及最近相当的底栖微生物,浮游,或部分叠层石和微生物垫(4- - - - - -7]。通过文化无关的方法,在建行出现gammaproteobacteria水生环境中占主导地位的集团(4,8]。在变形菌门,假单胞菌本身就是一个占主导地位的集团与充足的分布和新流行血统或物种描述盆地内(5,9),以及一个明确的优势在某些微生物垫(7]。生物多样性和特有现象导致的不寻常的水平描述建行以及一个时间机器(10)或“微生物加拉帕戈斯群岛”(1,4,11],并优先保护的努力(comision nacional para el conocimiento uso y de la biodiversidad) CONABIO,世界野生动物基金会(wwf),湿地和湿地公约》的人,和生物圈(MAB) /联合国教科文组织。

先前的研究在建行试图描述微生物多样性的不同寻常的水平在环境或地理梯度(6,12,13),以及理解观察到的起源进化和生态多样性(4,10,14,15]。然而,什么也没有做跨季节描述细菌多样性,尽管(1)分析模型表明,季节性波动的存在会影响多样性的起源和维护(16)和(2)明显季节性的许多盆地水生系统(1,17]。

评价微生物多样性的变化与季节性建行的供水系统,我们描述,第一次,微生物多样性跨季节的季节性变量淡水系统(干燥湖)。研究系统是相对较小的,证据的强烈影响,其季节环境变化的遗传变异的鱼(17]。在这种背景下,我们分析了一小部分总微生物多样性,可耕种的假单胞菌微生物种群的数量,假设季节性变化应该追踪干燥泻湖的季节性变化。

我们统计表明,分类隔离的身份不是独立的采样季节,冬季和夏季的数量是不同的。除了基因的描述种群,我们显示增长率在不同的温度下的探索性的措施,表明种群之间的生理差异。,结果显示季节性变化在独立生存的水生的多样性假单胞菌人口从建行。

2。材料和方法

2.1。研究网站

我们选择季节性的水生生态系统内建行受标记跨季节(化学和物理参数的波动18)温度就是其中之一,如图1 (b)(0-38°C范围;(17])。该网站在当地被称为“拉古纳格兰德”(LG)和位于水文系统的Churince建行的西边(图1(一))。温度测量每小时每隔大约两周的两个站点(LG1和LG3)使用iButton温度传感器(美国Maxim集成、达拉斯、TX)。

2.2。抽样和隔离细菌菌株

我们取样四个网站在干燥湖“拉古纳格兰德”:LG1 (26°50.830′N, 102°09.335 W′), LG2 (26°51.199′N, 102°09.009 W′), LG3 (26°51.146′N, 102°08.964 W′),和LG4 (26°51.222′N, 102°09.040 W′)。在一个时间点,没有显著的温度采样站点(图之间的区别1和[6]),多个站点每个时间点取样做是为了覆盖尽可能多的区域。温度变化主要是通过季节,气温达到低点接近0°C和高位近40°C(图1;(17])。采集标本在夏天(2003年8月和2005年)和冬季(2004年1月和2005年)。没有进一步抽样可能自2006年以来,因为过度开采与农业相关的建行含水层干涸的水生环境“拉古纳格兰德。”

一式三份样品15毫升的水取自地表水(15 - 20厘米深度)的四个样本网站使用无菌BD猎鹰瓶(美国BD生物科学,MA)。每个复制样品镀200年蔓延一式三份μ每个瓶的L。文化板块包含GSP文化媒体(假单胞菌- - - - - -气单胞菌属选择性琼脂基地):10.0 (g L⁻¹谷氨酸钠L (+), 20.0 (g L⁻¹可溶性淀粉,2.0 L (g⁻¹磷酸二氢钾),0.5 (g L⁻¹硫酸镁),0.36 (g L⁻¹酚红,12.0 L (g⁻¹)琼脂19]。属于属的菌株气单胞菌属降解淀粉和产生酸,导致颜色(红,黄)的变化。属于属的菌株假单胞菌没有产生酸;因此,我们选择了殖民地,不使脱色媒体变成黄色。盘子被孵化根据指令的充实假单胞菌- - - - - -气单胞菌属(19]。殖民地被接种在同一介质净化和维护在GSP媒体−80°C和15% (w / v)甘油。

2.3。DNA提取和BOX-PCR基因指纹图谱分析

DNA提取利用DNeasy血液和组织工具包(试剂盒、钙、美国)根据制造商的指示。重复基因外回文PCR (rep-PCR)基因组指纹进行隔离的BOX-A1R引物(5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′)的协议(20.]。以下使用PCR条件:7分钟在95°C,紧随其后的是30 94°C的周期为1分钟,1分钟53°C, 65°C 8分钟,最后在65°C扩展8分钟。PCR分析了产品1.5% (w / v)琼脂糖凝胶含有0.5 x TAE-buffer(200毫米trisacetate, 0.5毫米EDTA, pH值8)。5小时的电泳进行v 180 mV(5厘米⁻¹)。1 kb + DNA阶梯大小(英杰公司)是运行在双方在中央巷的凝胶。的凝胶和溴化乙锭染色。

2.4。计算机辅助分析BOX-PCR基因组指纹

凝胶图像数字化与charge-couple设备摄像头(100年凝胶逻辑,柯达)和作为TIFF文件存储在磁盘上。这些数字化图像转换,与上述DNA标记大小归一化,分析了GelCompar软件(版本4.0;应用数学、yves gijarth,创立比利时)。“滚动磁盘”背景减法应用方法。分析BOX-PCR模式、相似矩阵的整个凝胶光密度曲线跟踪计算通过使用成对皮尔逊积差相关系数(值1相当于100%相似)。这种方法比较整个光密度曲线的指纹21,22]。集群分析相似矩阵进行减重对集团使用算术平均法(UPGMA)。我们进行了聚类分析的DNA梯子选择相似度值定义隔离属于同一组基因型。

2.5。16 s rRNA基因测序和分析

我们选择一个孤立的基因型(rep-PCR所定义的分析,由至少90%的相似性条带模式)获得16 s rDNA序列。以前的研究已经表明克隆BOX-PCR指纹非常相似(值超过0.8)相同的16 s rRNA基因序列(23]。16 s rRNA基因放大使用27个f - 1492 r引物条件下前面描述的(24)100年μL最后的体积。PCR产物纯化使用QIAquick凝胶萃取工具包(试剂盒、希尔登,德国)。16 s rRNA基因测序(ca。1450个基点)引物27个f, 357 r, r, 530 530 f、790 f、981 r, 1492 r使用(25]。测序反应有总量的15μL组成的2μL大染料终结者排序缓冲区(美国应用生物系统公司,培育城市,CA), 1.6μM底漆,5μL-purified放大产品。放大条件如下:一个周期95°C的5分钟和45周期10 s在95°C, 10 s 50°C和4分钟60°C。在毛细管测序完成测序仪(ABI-Avant 100)。序列组装和修正使用缺点软件(26]。

2.6。核苷酸加入数字

获得的16 s rRNA基因序列已经提交给数据库在加入数字EU791282和FJ976048-FJ976083基因库。

2.7。系统发育分析

爆炸2.0.6算法的基因库和SIMILARITY_RANK工具核糖体数据库项目二世(RDP-II)是用来寻找最接近的匹配RDP-II和基因库。序列对齐使用CLUSTAL_W程序(27]。模型生成器(0.84版本,28])是用来确定最优核苷酸替换模型。Neighbor-joining (NJ)算法用于生成一个家谱中实现PAUP(4.0版本,29日GTR]),通过进化模型与伽马校正0.40和1500引导程序复制序列。

2.8。增长率

作为探索性方法对潜在的差异在生理反应的冬季和夏季人口,增长曲线建立了在不同的温度下,最大增长率决定隔离的一个子集。隔离的子集的总样本代表冬季和夏季人口。组装这个子集的标准寻找一个公平的代表基因型多样性在个体层面,以及夹杂物的分离获得的在不同采样日期和属于观察到的主要血统(p . otitidis和p . cuatrocienegasensis)。通过应用这些标准,导致冬天6基因型的样本子集(p . cuatrocienegasensis)和11夏天样本的基因型(p . otitidis)。我们确定个人最大增长速度在5种不同温度下(28日,32岁,26岁,40岁,和44°C),很可能在夏天的经历时间,实验一式三份。Biotek协同标(协同2多模标模式,Biotek)是用来测量光密度的个体文化每10分钟。光密度的措施被用来构造增长曲线,确定最大增长率。

2.9。统计分析

2.9.1。计算和基因型多样性

基因型多样性得到BOX-PCR指纹。我们计算了指数,在那里是隔离的数量相同的BOX-banding模式和隔离的总数。香农多样性指数计算使用公式:(30.]。每个基因型的丰度计算的每个基因型组的分离数量除以总数量的隔离。确定抽样工作如何影响这些估计,稀疏曲线建立了比较孤立的数量与观察到的基因型使用ECOSIM(7.72版)(31日]。

2.9.2。计算和Phylotypes多样性

由于小样本大小,为了评估夏季和冬季种群多样性差异修正,我们构造稀疏曲线(32)的丰富phylotypes(血统)使用ECOSIM(7.72版)(31日]。我们也估计血统的实际数量(phylotypes)可能出现在示例中,通过非参数Chao1丰富性估计量的计算使用估计8.2.0 [33,34]。

统计上确定两个种群的存在(夏季和冬季),我们构建了一个列联表和血统的频率不同的采样季节和使用测试评估的重要性我们血统的频率分布35]。最后,我们进行了一个概括的确切概率法使用中提供的费舍尔测试例程统计软件包,利用模拟值= TRUE国旗。

2.9.3。增长率的比较

经济增长率的差异在不同的温度下观察夏季和冬季之间的数量(p . cuatrocienegasensis和p . otitidis、职责)。评估这些差异的统计学意义,我们进行了单向方差分析的实现统计软件包,使用函数单向测试。

3所示。结果

描述自然的多样性假单胞菌隔离及其变化与季节性在建行水系统中,我们取样干燥泻湖显著的季节性波动。文化来源于地表水样品在四个采样事件(两个夏天,两个冬天)。个人隔离(70)基因分型和时间结构的总样本分析。

3.1。种群的遗传结构(基因型多样性)

基因型多样性测定通过基因组指纹为每个孤立使用BOX-PCR技术,允许单个克隆的识别,每个独特的模式被认为是一个不同的基因型。我们选择一个相似度值的90%或更多指示菌株相同(或相似)的基因型。非常相似或相同的条带模式被证明有相同的基因型和相同的16 s rRNA基因序列23]。聚类分析导致共有35个代表基因型(图2)。我们确定了9基因型(15隔离)从2003年8月,7基因型(31隔离)从2004年1月,7基因型(12隔离)从2005年1月和12基因型(12隔离)从2005年8月。

的基因型多样性计算总样本(70假单胞菌隔离)和所有估计来自这个示例应该谨慎对待小样本大小。据说标准描述的示例表明,香农多样性指数(H)是3.14。额外的分析包括基因型多样性的观察是不均匀分布在不同的样品。2004年1月,我们观察到最低的多样性()和最多的隔离具有相同基因型的模式(12株拥有相同的基因型)。,2005年8月,我们观察到最高的多样性与12隔离出12独特的基因型()。所有基因型被发现是惟一的一个示例(图2)。即使我们应用80%的截断值定义集群,大部分的基因型(92.9%)只收集一次,除了两个基因型,其中包括从不同的采样情况下隔离。稀疏分析表明,需要更多的采样来获得信心在基因型多样性(数据未显示)。因此,这些观察只是暗示不复发每年的基因型。

3.2。季节性变化(p . otitidis和p . cuatrocienegasensis)

系统发育多样性是由物种的鉴定或血统独特16 s rDNA序列。确定血统的季节性的结构,所有的16 s rDNA测序独特的基因型是通过指纹识别。Neighbor-joining家谱16 s rDNA序列代表估计BOX-PCR发现的35个基因型的系统发育关系,如图3。使用97%的序列相似性截止16 s rDNA序列,数据显示两个数值占主导地位的集群。第一个集群(8序列占总样本的24株)密切相关p . cuatrocienegasensis(5)和孤立的只在冬天样本(2004年1月和2005年1月),而第二个集群(15序列代表总样本的21株)密切相关p . otitidis和孤立的只在夏天样本(2003年8月和2005年8月)。phylotypes的季节性再现,由16 s rDNA序列,没有观察到BOX-PCR指纹,因为所有的模式都是不同的从一个样本场合(图2)。这些结果表明,有季节性的重现特定血统在这个网站,但定义它们的人群有不同的基因型组合从一年到下一个。

我们还分析了两个截然不同的群体的可能性(夏季和冬季)并没有统计上的不同方面观察到的多样性,通过纠正取样大小使用稀疏曲线。抽样饱和度和由此产生的曲线显示,这两个种群多样性水平不同(图4)。按照稀疏的结果,Chao1丰富指数表明,血统的观察值不会改变显著更多的采样(表1)。

此外,我们进行了广义费雪的测试和一个独立测试。费雪的测试是为了评估统计学意义的季节性影响phylotypes的分布,基于列联表。我们观察到强统计上显著的结果(的概率),表明观察血统/季节的特定安排的机会非常小。的测试是为了评估phylotypes采样季节和协会表示,找到一个特定的概率phylotype是高度依赖于季节(;;)。这些结果表明,血统的观察季节性分布是统计学意义,不可能由于随机事件。

最后,我们探索的可能性p . cuatrocienegasenesis和p . otitidis数量可能会有不同的最大增长率在不同的温度下可以有经验在夏天期间(28日,32岁,36岁,40岁,和44°C)。我们都遵循着相同的方法36]。我们发现,平均而言,人口统计上显著的差异只在40°Cp . otitidis“夏季血统”生长速度比p . cuatrocienegasensis“冬天血统”(图5)。

4所示。讨论

在建行有一个非凡的微生物多样性,和每个网站似乎是唯一的5- - - - - -7,14,37- - - - - -39]。在其他地方,即使多样性高,大部分由传统文化仍然是遥不可及的方法。一些可耕种的组织等假单胞菌,杆菌、Exiguobacterium等壁厚菌门(6,13)是一个例外。我们发现这些组织被大量克隆库和从环境样品基因组38,39),还能够培养实验室。建行的微生物多样性的信息主要来自水系统和池塘的研究,其中大部分属于季节性的波动(1),没有什么是已知的生物多样性与这些环境发生的变化周期。目前的研究是探索的一部分关注属假单胞菌和季节性。

4.1。种群的遗传结构(基因型多样性)

BOX-PCR指纹分析和16 s rDNA序列的独特BOX-PCR基因型被用来确定抽样数量的时间结构。我们的研究结果显示,一半的基因型的总数是独一无二的()。这种多样性值相比,报道值相对较低大肠杆菌(;(40])。然而,欠采样,通过稀疏曲线(数据未显示),呼吁谨慎的解释计算atat基因型多样性水平。

4.2。季节性变化(p . otitidis和p . cuatrocienegasensis)

描述的系统发育多样性导致季节性结构的发现两个数值占主导地位的血统:p . cuatrocienegasensis和p . otitidis。虽然多样性可能低估了在基因层面上由于减少了样本容量,我们能够测试统计遗传结构之间的相关性和季节性独立测试,一个广义费舍尔测试,通过取样大小校正通过稀疏曲线分析和估计的预期与非参数估计Chao1丰富丰富。测试的独立性和广义费舍尔测试表明phylotype(物种或血统)身份不是独立的采样季节(;;),观察血统的特定安排的概率/季节的机会非常小()。稀疏曲线(41)冬季和夏季人口显示两者之间的分化和多样性的饱和夏季样品,提供证据,人群在他们的多样性水平(图方面有显著的差异4)。最后,将丰富度指数(Chao1)不显著偏离血统(表的观察值1)。实际上,这些测试表明,冬季和夏季人口统计上的不同在他们的组成和多样性水平。

其他的研究也发现了类似的模式在leaf-associated荧光假单胞菌的数量41]。使用限制性片段长度多态性(RFLP)的叶子样本每月在3年期间,他们发现季节性再现的长期生存ribotypes [41]。在我们的研究中,虽然我们能够辨别季节性模式血统组成、因素造成这种模式很难确定明确。一个显而易见的因素,可以参与维护跨季节是温度的不同人群。是为了检验这一假设,我们测量的最大增长率最丰富的血统(p . otitidis和p . cuatrocienegasensis在不同的温度下。正如所料,p . otitidis增长速度超过p . cuatrocienegasensis在高温下,但这个微分增长只有在40°C具有统计学意义。这个结果提供了一个线索,温度可以是一个有关环境因素影响经济增长和持久性的隔离,增长率远未明确的实验研究和必须被谨慎对待,在实验室条件下总是以多种方式不同于环境之外,被调查42),除了可以与其他环境参数温度变化需要调查。尽管如此,这些实验给出一个好的角度可以进一步做什么调查因素参与观察与季节性相关基因结构。我们考虑到生理反应的详细调查更广泛的温度范围内,使用更多的血统,测量隔离相互竞争,推进知识转化为的原因需要观察研究种群的遗传结构。

另一个潜在的解释观察到的季节性模式可以在某些细菌的记录转换成休眠状态引发的不利的环境条件,如氧气和温度应力或资源限制。最近的一项研究由琼斯和列侬(43]表明,只有一些类群细菌总数的社区各湖泊处于活跃状态,其余的都在休眠状态引发的环境压力。尽管属的成员假单胞菌并不会形成孢子,他们可以输入可逆的减少代谢活动称为可行但nonculturable (VBNC) [44]。因此,休眠/ VBNC状态可以解释观察到的季节性模式,不排除其他生态机制(即。、适应)。这种可能性是限制culture-dependent-techniques可以当微生物多样性特征。然而,一些文化无关技术也发现了类似的模式(45]表明细菌种类或微生物的季节性变化和重现的官能团发生在细菌水生社区和,因此,不是文化相关的技术或微生物过程的产物(46,47]。研究在建行水生栖息地,包括其他可栽培的和nonculturable团体,最近发表的(6]或即将[12,38),将有助于确定观测结果的普遍性。

当我们发现血统或phylotypes (16 s rDNA序列)季节性复发,基因型(隔离指纹)在每个血统并不导致每年不同基因型组成。尽管欠采样验证了在基因水平(稀疏),纠正对样本量在血统层面,它仍然给了夏季和冬季之间的差异的证据样本(图4;表1)。看着季节性phylotype成分和采取谨慎的基因型组合(指纹),我们看到我们的观察三种可能的解释:(1)选择与季节性有关,(2)中性或随机固定每个季节不同的基因型或血统,和(3)人工制品由于样本量有限,在每个采样日期。鉴于强烈phylotypes协会采样季节,selection-mediated可能性是支持在一个纯粹的随机的解释。这一事实我们不恢复相同的指纹有争议的是由于欠采样和不能被解释为选择性扫描的证据(47],或者简单的快速多元化每个季节变化,除非更多的隔离后的细菌进行了分析。第三个可能的解释涉及到第二个和之前“看不见的”意味着基因型存在于低数字;然而,这并不一定矛盾的可能性季节性选择作为一个生态过程发生。

5。结论

我们表明,同时利用系统发育标记和基因指纹图谱可用于描述多样性在季节变化,并制定假设的潜在机制,人口结构。未来的实验,包括多个系统组更大的样本,在较长一段时间,和在实验室控制条件下将需要测试这些假设和进一步研究季节性的作用在维护血统或物种多样性和细菌在建行多样化。

这里给出的结果是第一个时间表征微生物的生物组成和动态的建行网站学习。血统的强烈的季节性相关成分的信息有助于制定未来的实验,测试假设的机制参与微生物多样性的起源和维护。

确认

这项研究支持由SEMARNAT(0237、23459)和CONACyT 9月(44673和57507)诉Souza和l . e . Eguiarte。a·e·埃斯卡兰特被CONACyT-UNAM奖学金支持。作者感谢r . Gonzalez-Chauvet和现代美国学校帮助在样本收集;e·卡森l . Espinosa-Asuar技术援助和m . g .玫瑰花;p . Vinuesa帮助BOX-PCR模式分析;l .猎鹰和m . Travisano思想和修正早期版本的手稿。最后他们感谢r .喜瑞协作和有益的讨论。

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