首先初步报告在隔离和表征的小说不动杆菌种虫害在套管的土壤用于种植蘑菇,双孢菇Imbach (Lange)

文摘

尽管评估大量的农业的和工业的废物作为外壳材料双孢蘑菇(Lange) Imbach栽培,一直很少关注套管材料的生物属性的重要性。在目前的研究中,描述了一次由菌群在壳层,即农场院子里肥料(施厩肥)和花花蘑菇基质/堆肥(短信/ SC)(施厩肥+ SC, 3: 1)施厩肥和Vermi堆肥(VC)(施厩肥+ VC, 3: 1),采用部分16 s rDNA测序。可用的数据显示显著的各种生物,包括不动杆菌和假单胞菌的γ变形菌门,是最常遇到的属。这是第一个初步报告套管土壤微生物多样性和演示的存在不动杆菌种虫害没有先前描述的外壳材料。

1。介绍

种植蘑菇,双孢蘑菇Imbach (Lange)是一种生物加工工艺,回收lignino-cellulosic废物(花了基质),和花底物可以用于不同的方式(1,2]。一致的成功的蘑菇作物的生产是建立在科学知识和实践经验。答:孢Imbach (Lange)是最广泛种植的食用菌,它是最受欢迎的品种的人工培养的真菌中世界贡献约31.8%的全球蘑菇栽培和在印度生产总数的85%3]。答:孢需要两种不同的基质形成果实的身体,也就是说,它生长的肥料营养生长地土壤养分缺乏套管在合适的物理化学/生物条件刺激钉头的起始过程形成子实体生产(2]。

壳层的一个重要参数和来源的变化在生产、质量、均匀性的商业种植。各种套管材料的使用在世界范围内,其中,使用农场院子肥料(施厩肥),套管的蘑菇栽培媒介,已经在印度次大陆的时尚,因为它简单的可用性和nonavailability泥炭苔藓通常用于套管在欧洲和美国。使用施厩肥作为外壳材料的优点超过其他农业的和工业的废物已经强调了在最近的报告4,5]。花蘑菇基质(SMS)是残余的堆肥蘑菇生产和几个重要的角色已经被描述6]。尽管评估大量的农业的和工业的废物作为外壳材料答:孢培养,一直很少关注生物壳层的属性的重要性(7]。细菌在壳层的生长和形态发生显著的影响答:孢生产。它支持有益的微生物种群,释放增长刺激物质,据说参与刺激引发的销。有几种报告套管的有利影响土壤微生物,尤其是假单胞菌putida和粪产碱杆菌属在答:孢(8]。

没有多少信息是可用的文学角色相关的微生物群落在壳层以及居民微生物群落在壳层的营养菌丝体进行交互答:孢。有两个生产相关问题需要套管土壤微生物学的研究人员的注意,即(i)土壤微生物在套管的构成和(2)对蘑菇生产的影响原位。现在可以使用几种方法和方法生成的信息驻留在壳层微生物,使更好的评估微生物菌群,其中微生物的分子识别的工具现在常用的,和16 s rRNA基因分析集中用于系统发育调查。此外,16 s rDNA序列输入方法现在允许识别的生存和可耕种的细菌种类,基于雇佣高度保守的16 s rDNA寡核苷酸引物与干预高变的真细菌基因序列,可以用作签名序列有助于物种鉴定(9,10]。本研究的目的是描述壳层的菌群和蘑菇套管对生产的影响。

2。材料和方法

2.1。采样地点

在目前研究套管材料包括花蘑菇基质/堆肥(短信/ SC)和vermicompost (VC)。材料都是修改与农场院子肥料的比率(施厩肥)3:1。这些套管材料的收集,从蘑菇(MRTC)研究和培训中心,GB裤子农业科技大学Pantnagar,印度。每个套管的样本来自连续的阶段,即0-day套管(套管应用在菌丝浸渍堆肥时,也就是说,套管)时,菌丝体浸渍阶段(MIS)套管,套管在原始阶段(PS)和收割阶段(HS)套管。

2.2。物理化学和营养分析套管的混合物

加工外壳(v / v)福尔马林处理,2%被用于理化分析使用方法建议由不同的工人:体积密度(11),持水量(12),孔隙度(13)、导电性和pH (TPS Smartchem实验室分析仪),总有机物质和C (14],可用N [15],可用P [16),可用K (17]。宏观和微量元素(钙、镁、铜、锌、锰、铁)经脉的分析过程18)是就业。

2.3。细菌隔绝外壳

套管样品(10克)是悬浮在90毫升0.85%的生理盐水(pH值7.0)和动摇大力在150 rpm 18°C 1 h。由此产生的泥浆连续稀释(100μL)到900μL 0.85%的生理盐水在每个埃普多夫管,和适当的稀释(10⁻⁴悬挂(100)μL)传播镀一式三份,在国王的B中(19]。文化是孵化20°C±2 2天。实验使用,隔离是在需要的时候转移到国王的B媒介,是储存在4°C。

2.4。形态特征

共有38个隔离是随机挑选的,形态从土壤套管的所有四个连续的阶段。细胞的形态和生化特征确定基于Bergey手册(http://www.bergeys.org/)。

2.5。复苏的基因组DNA, PCR

总DNA,从细菌隔离,由Bazzicalupo准备过程概述后,范尼(20.]。提取基因组DNA是运行在0.8%琼脂糖凝胶在80 V与定量标记在一个45分钟巷(低DNA质量阶梯、MBI Fermentas)。凝胶在紫外线透照器可视化。DNA是量化spectrophotometrically,通过测量OD在260 nm和280 nm。DNA纯度检查测量的灭绝_260年/一个_280年DU 640 B贝克曼分光光度计。放大16 s rRNA基因被PCR扩增获得每个细菌分离,采用eubacterial通用引物(21]:fDI (5′-AGAGTTTGATCCTGG-3′)和rP2 (5′-TACCTTGTTACGACTT-3′),这是针对普遍保守区域和允许放大约1500 - bp片段。PCR扩增在ptc - 100进行thermocycler (m . j .研究)。反应管包含25 ng (5μL)的DNA提取、1 UTaq聚合酶(Genei), 1 X缓冲区(10毫米Tris-Chloride pH值9.0,1.5毫米MgCl₂500毫米氯化钾)(Genei), 10毫米核苷酸(Genei)和0.25毫米底漆(Genei)。初始DNA-denaturation和酶激活步骤在95°C进行了7分钟,其次是25周期在94°C的变性1分钟,退火在51°C 1分钟1分钟和扩展在72°C,和最后一个扩展在72°C 10分钟。的存在和产生特定的PCR产品(16 s rRNA基因)监测在0.8%琼脂糖(wt. /卷)(生命技术公司。);凝胶电泳是在100 V 30分钟1 X Tris-acetate-EDTA缓冲和可视化的溴化乙锭染色,观察紫外线透照器(Biosystematica)。

2.6。16 s rDNA部分测序

PCR产品获得了来自38个菌株纯化EXO-SAP。组件与金补充缓冲(应用生物系统)和测序应用生物系统310遗传分析仪(ABI棱镜310基因分析仪),使用大染料终结者循环测序设备(实验室印度)做好准备。部分序列,放大fDI底漆,被用来确定相似之处。菌株的同源性分析,基于部分序列,与DNA的序列数据库,和类似的序列显示95%以上是由核苷酸基本局部比对检索搜索工具(爆炸)计划在国家生物技术信息中心(NCBI)爆炸服务器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。多序列比对的序列是由EBI ClustalW检索服务器http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/。同源树是由使用大型4.0.2软件引导值集群算法,Phylip格式,拓扑算法。提交的序列确定在本研究在讨论的基因库的NCBI数据库和加入数字:ay961042 - 61, AY 967718 - 967724, DQ074744-53/58。

3所示。结果

3.1。套管的物理化学性质

套管样本施厩肥+短信(3:1)最小体积密度(BD)(0.60克/厘米³),而套管施厩肥+ VC(3: 1)显示BD值为0.68克/厘米³。孔隙度是相当高的(92.0%)为施厩肥+短信。持水量出现孔隙度和体积密度直接相关,可能直接影响微生物建立和产量答:孢。这是高(191.19%)施厩肥+短信。显著增加电导率(EC)观察施厩肥+ VC (570.33 deci-simen⁻),而低价值(398.00 deci-simen⁻)获得了施厩肥+短信。持水量出现孔隙度和体积密度直接相关。这是最大(191.19%)施厩肥+短信(3:1)(表1)。


美国没有。	套管的土壤	属性
美国没有。	套管的土壤	体积密度(g / cm³)	孔隙度(%)	持水量(%)	pH值	电导率(deci-simen⁻¹)

(1)	施厩肥+ SC;3:1	0.60	92.00	191.19	7.21	398.00
(2)	施厩肥+风险;3:1	0.68	82.00	95.97	7.13	570.33

3.2。套管的宏观和微量元素分析

双孢蘑菇是生长在wheat-straw-based蘑菇堆肥(巴氏杀菌/长方法)。两个套管混合物准备从三个套管材料:农场院子肥料(施厩肥),花蘑菇基质(SMS),和Vermi堆肥(VC)为他们的营养状况进行评估。为了评估套管混合物的营养状况(施厩肥+短信,施厩肥+ VC)在种植的不同阶段,状态可用性宏观和微量元素进行了分析(表2)。最大程度的有机物质被记录的两个套管混合物(28.91%±26.42%和0.2±0.08)收集在mycelium-impregnated阶段,其次是把阶段(0.2±27.76%和25.82%±0.3)。最低有机质施厩肥+短信和施厩肥+ VC是记录在样品收集在收割阶段(0.08±26.06%和25.02%±0.6);0天阶段套管土壤混合物显示相对较小的有机质含量,即25.38%±0.11和0.2±24.81%。显著变化记录施厩肥+短信套管准备显示不同营养状况比施厩肥+ VC。微量元素估计(ppm)包括铜、锌、锰、铁。营养状况的相对顺序(宏观和微量元素)对套管混合物的不同阶段mycelium-impregnated阶段>固定状态>收获阶段阶段(表> 0天2)。


特征	施厩肥+ SC (3: 1)				施厩肥+ VC (3: 1)
特征	0天阶段	Mycelium-impregnated阶段	把舞台	收获阶段	0天阶段	Mycelium-impregnated阶段	把舞台	收获阶段

有机质(%)	25.38±0.11	28.91±0.20	27.76±0.20	26.06±0.08	24.81±0.20	26.42±0.08	25.82±0.30	25.02±0.16
营养素
有机C (%)	14.10±0.14	16.06±0.16	15.42±0.14	14.47±0.23	13.78±0.07	14.67±0.01	14.34±0.01	13.9±0.2
N (%)	0.92±0.02	1.41±0.05	1.32±0.04	1.09±0.09	1.02±0.04	1.33±0.08	1.21±0.02	1.15±0.40
P (%)	0.78±0.01	1.2±0.09	1.05±0.01	0.98±0.04	0.8±0.05	1.08±0.02	0.94±0.04	0.90±0.02
K (%)	0.9±0.02	1.21±0.01	1.01±0.02	1.06±0.19	0.83±0.12	1.16±0.01	1.04±0.06	0.94±0.11
Ca (ppm)	11.51±0.18	13.72±0.08	13.8±0.16	12.91±0.07	7.99±0.14	11.76±0.04	10.16±0.01	9.69±0.16
毫克(ppm)	5.23±0.02	5.01±0.02	4.98±0.02	4.84±0.02	6.33±0.01	7.89±0.18	7.56±0.05	5.8±0.01
微量元素
铜(ppm)	0.025±1.65	0.037±1.03	0.032±0.97	0.028±1.04	0.016±0.01	0.023±0.96	0.019±1.43	0.017±1.36
锌(ppm)	0.128±0.04	0.416±0.01	0.329±0.01	0.282±0.01	0.067±0.11	0.269±0.08	0.188±0.01	0.221±0.01
Mn (ppm)	1.01±0.01	1.2±0.02	1.16±0.03	1.10±0.01	0.86±0.02	1.04±0.16	0.98±0.05	0.91±0.02
铁(ppm)	0.059±0.01	0.088±0.02	0.076±0.03	0.063±0.01	0.034±0.02	0.056±0.01	0.048±0.01	0.041±0.02

3.3。恢复隔离的种群动态

几乎没有变化(6.02±0.81,5.87±0.81)总细菌的数量()在壳层施厩肥+短信和施厩肥+ VC在裁剪(图的连续的阶段1)。壳层施厩肥+ mycelium-impregnated阶段的VC显示人口略高(6.02±0.81)相比,施厩肥+短信(5.92±1.69)。最低的人口在固定阶段观察到施厩肥+ SC (5.87±0.81)。

3.4。16 s rRNA基因部分序列

部分16 s rDNA序列测定38隔离并与DNA数据库的序列和类似的序列显示95%以上是由核苷酸基本局部比对检索搜索工具(爆炸)计划在国家生物技术信息中心(NCBI)爆炸服务器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。大多数菌株组合在一起,并接近属假单胞菌和不动杆菌分别的家人假单胞菌科和Moraxellaceae,除此之外,其他人与参考株显示,55%相似Sphingobacterium(图2)。这种细菌(Sphingobacteriaceae家庭)显示革兰氏染色阴性,没有展出₃还原酶和过氧化氢酶活性以及柠檬酸的利用率。总共有11株(假单胞菌科的家庭),38岁的展出近属假单胞菌。所有的11株显示相似,参照菌株95 - 99%假单胞菌putida(AY785244)。大量的菌株分布在家庭Moraxellaceae他们靠近属展出不动杆菌和显示革兰氏染色阴性,没有展出₃还原酶和过氧化氢酶活性以及柠檬酸的利用率。

4所示。讨论

考虑国家和蘑菇生产的意义,然而,有限的可用性的信息套管土壤微生物区系,一个表示的细菌多样性分析表征这一独特的材料。套管材料被选中,其营养状况的堆肥相比非常低,因此将营养压力创造条件。如果套管材料富含有机质,它可能会扰乱堆肥的选择性,从而提供持续支持营养生长的真菌,从而阻止果期。典型,微生物带来的物理和化学变化他们的栖息地22]。持水量出现孔隙度和体积密度直接相关。这些因素直接影响微生物积累和产量答:孢。这是最大(191.19%)施厩肥+短信(3:1)。一般来说增加电导率(EC)几乎是减少的笨蛋(数量成正比23]。目前的调查EC(表的数据1)表现出的高EC套管施厩肥+ VC(3: 1),产量越低。结果表明,欧盟蘑菇的生产中起着重要的作用,但它不是唯一的控制因素。这些研究结果一致的发现Bhatt et al。24]。此外,印度套管材料的物理化学性质也被报道了辛格et al。25]。宏观和微量营养素水平增加和减少相应的(表2)。这些修改,是否临时或持久的,改变环境,这样一些物种能够生存和发展,而另一些可能的小说改编,进化到占据栖息地,同时还有一些被淘汰或未能成长22]。

分子工具使用套管土壤细菌的鉴定和16 s rRNA基因分析集中用于理解的同源关系。与爆炸序列比较分析显示,85%的细菌分离株属于γ变形菌门组和其它分离株杆菌。一个隔离在这项研究中被发现属于属Sphingobacterium。两个属,不动杆菌和假单胞菌,是占主导地位的,是唯一代表的γ变形菌门。属的优势不动杆菌早些时候的意义,因为这并没有被报道的蘑菇套管的生态系统。的存在不动杆菌作为一个主要属细菌并不意外,因为这是自然生态系统的重要组成部分,特别是参与木质素含有化合物的降解和外源性物质及其清除财产其他有毒化合物。基于部分16 s rRNA基因扩增和测序,Watabe et al。26)检查几个属的物种,包括地衣芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,Paenibacillus lentimorbus,假单胞菌mevalonii,Sphingobacterium multivorum,和Stenotrophomonassp.除了在属两种潜在的小说小细菌属和Stenotrophomonas。

5。结论

在这个初步研究,16 s-rdna PCR,扩增子的直接自动测序只是进行可耕种的生物隔离在非选择性国王中B(九巴)。总之,这是第一个初步报告的套管土壤微生物多样性和演示的存在Sphingobacteriumsp.和不动杆菌sp.以前没有描述的外壳材料。

确认

作者想感谢博士r·k·白肢野牛和先生Avinash Marwal使同源树的基于多序列比对。一种支持教授的生命力Baijal高度认可。

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