小说天生Immune-Enhancement策略结合丙种球蛋白救老鼠从致命的金黄色葡萄球菌败血症

文摘

金黄色葡萄球菌(SA)是一个主要的社区获得性病原体。耐药菌株的出现,耐甲氧西林SA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌),对治疗干预构成严峻挑战。被动免疫疗法与特定的抗体正在积极检查治疗暴发性感染有限的成功。在这项研究中,我们将演示P4, 28-amino酸肽,来自肺炎链球菌表面adhesin pathogen-specific抗体(丙种球蛋白;P4疗法)成功提高opsonophagocytic杀死(OPK)金黄色葡萄球菌体外。我们怀疑是否有可能扩大P4疗法治疗葡萄球菌感染在活的有机体内。P4疗法结合丙种球蛋白获救7/10病态生病金黄色葡萄球菌来华的老鼠在对照组幸存下来的可能性只有2/10。

1。介绍

金黄色葡萄球菌,革兰氏阳性细菌,是一种共生的有机体导致广泛的医院和社区获得性感染。也认识到免疫逃避机制和开发multi-antibiotic阻力的能力。葡萄球菌病的负担增加了全球社区获得性耐甲氧西林的出现金黄色葡萄球菌(CA-MRSA) [1,2]。的发病率金黄色葡萄球菌菌血症在美国范围内20至40例每100000例死亡率从19到24%3]。CA-MRSA率在美国从2000年到2006年翻了一倍(4]。主要的威胁是耐药性的增加金黄色葡萄球菌,传播在社区隔离,和有限的新药物与耐药隔离(可论证的有效性3]。为了应对这些挑战,我们需要开发新工具和/或重新调整旧的工具与新技术。治疗性抗体(被动免疫疗法),能增强克服宿主免疫系统的能力金黄色葡萄球菌感染是理想的候选人评估替代对抗这感染(5]。

P4, 28-amino酸肽来自肺炎链球菌表面adhesin,增强在体外opsonophagocytosis pathogen-specific存在的免疫球蛋白和拯救老鼠从致命的肺炎球菌感染(P4-therapy) [6- - - - - -8]。最近,我们已经表明,P4-therapy也可以用来拯救老鼠从严重的继发性肺炎球菌感染甲型H1N1流感病毒感染小鼠后(9]。我们质疑如果可以使用P4疗法治疗葡萄球菌感染在活的有机体内吗?

2。材料和方法

2.1。多肽合成

肽的氨基酸序列指定为P4以前描述(10,11]。P4肽和免费的N -糖基合成和冻干疾控中心核心设施,亚特兰大,乔治亚州。P4肽用于本研究合成在一个法案(高级化学技术)396多个多肽合成仪的使用标准和修改fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)协议(12- - - - - -14为富达的合成和分析基于前文所述的协议(15]。冻干肽在diethylpyrocarbonate resuspended——(DEPC)处理过的水,用近3分钟解散和存储−70°C。我们推导出2肽、P6和/或P7 P4序列,这些肽没有真核细胞活化的影响(11]。这些肽作为消极的控制在体外实验。

2.2。种特异的抗体用于这项研究

金黄色葡萄球菌您多克隆和单克隆抗体用于这项研究如下:(1)gammaglobulin(丙种球蛋白,Gamunex、Telecris、数控),汇集人类血清反应与多种病原体包括金黄色葡萄球菌(8),(2)兔多克隆(ab35194 Abcam,剑桥,MA)指向的可溶性和结构抗原金黄色葡萄球菌,(3)兔多克隆免疫球蛋白指向凝集因子,ClfA金黄色葡萄球菌PAbClfA(礼貌Inhibitex公司市郊区,GA),和(4)人性化的小鼠单克隆anti-ClfA免疫球蛋白,HM904(礼貌Inhibitex公司市郊区,GA)。我们的在体外实验设计涉及变化的直接比较opsonophagocytic杀死或吸收P4的存在与否。

2.3。Opsonophagocytic死亡分析

评估P4疗法治疗的相关性金黄色葡萄球菌感染,我们使用了一个在体外opsonophagocytic杀死化验(OPKA) [16]。HL-60早幼粒细胞白细胞分化成粒细胞谱系或新鲜人多形核的neutrophills被用作效应细胞(中性粒细胞)。金黄色葡萄球菌临床分离株用于本研究提供的请乔帕蒂博士和约翰Vernachio (Inhibitex公司市郊区,GA)。三个不同的殖民地污点被用来屏幕金黄色葡萄球菌菌株,即金黄色葡萄球菌strainL、strainN strainFB surface-exposed抗原的存在,与上面列出的多克隆和单克隆抗体反应。基于殖民地污点分析(数据未显示),金黄色葡萄球菌strainN OPKA被选中。当所有三个金黄色葡萄球菌压力反应与丙种球蛋白(Gamunex),金黄色葡萄球菌strainN是唯一与这四个抗体反应。P4肽溶液(100μg / mL)添加到OPKA混合物在pre-opsonization阶段,和控制井获得10项提名μL DEPC水代替。Opsonophagocytic杀害金黄色葡萄球菌strainN毒株特异性抗体的存在和没有P4担任控制补充。增加opsonophagocytic杀死细菌的P4时添加到反应混合物(细菌、抗体和补充)计算并表示为%增加控制权。几个实验控制维护,仅包括细菌,细菌与OPKA组件之一,(抗体,补体,HL60细胞),或一个不完整的结合,缺乏任何列出的组件。这些控制导致的细菌杀死。由于本研究的主要目的是演示P4的opsonophagocytic造成的影响金黄色葡萄球菌strainN,这些控件中未包含的数据。

2.4。从人类血液中性粒细胞的隔离

肝素化静脉血获得埃默里献血者服务,亚特兰大,乔治亚州。白细胞分离设备,histopaque - 1119(σ,圣路易斯,密苏里州)从血液中分离粒细胞。粒细胞分离从血液中根据制造商推荐的方法。

2.5。鼠标菌株

老鼠(亩骶),应变瑞士韦伯斯特(ND4-SW),来自查尔斯河实验室(美国马Wilimington)。老鼠在这项研究中的应用是6 - 10周大。

2.6。鼻内感染和P4疗法

鼻内接种的老鼠金黄色葡萄球菌strainN和P4疗法是使用协议执行先前描述,与少量修改6,8]。女性瑞士韦伯斯特老鼠(查尔斯河实验室,威尔明顿MA) 6到10周的年龄被用于这项研究。所有实验机构护理和使用委员会批准(IACUC)和根据制度进行的动物实验中的伦理指南和安全指导方针。所有的实验都重复三次。Swiss-Webster老鼠()被感染鼻内金黄色葡萄球菌strainN (~ 1.1×10⁷细胞/鼠标)。我们最初试图开发一个静脉挑战失败是由于快速发病机理模型。因此,我们选择一个鼻内挑战moribundity之间和救援模型,该模型提供了一个窗口。15小时后挑战,老鼠垂死的得分(2)40/50。垂死的老鼠分成四组(10 /组),其中包括三个对照组(没有治疗,P4,丙种球蛋白)和P4治疗组(P4 +丙种球蛋白)。治疗对照组收到两个剂量丙种球蛋白(i.p;100年μL /鼠标)或P4(注射;100年μg /鼠标)在15个小时和24小时后感染。这些时间点选择基于pathogen-specific挑战和剂量优化实验。同样,P4治疗组2剂量丙种球蛋白(i.p;100年μL /鼠标),20分钟后由P4(注射;100年μg /鼠标)。治疗和治疗动物疾病症状监测和生存。由于IACUC局限性,我们只有使用丙种球蛋白在活的有机体内实验。

2.7。分数的垂死的特点

老鼠监控和可视化每天两次得分为垂死的特点。老鼠排在5 - 0;5 =健康、正常的外衣,皮肤、眼睛、呼吸和活动/运动;4 =健康,开始看起来生病了,荷叶边外套;3 =生病,荷叶边外套,减少活动;2 =非常恶心,荷叶边外套,活动减少,眼分泌物;1 =濒临死亡,荷叶边外套,小/不活动,眼分泌物,减少呼吸,因此安乐死;0 =死。

2.8。统计数据

所有在体外和在活的有机体内实验进行了一式三份单独测定三天,除非另有指定。治疗后的垂死的动物数量记录直到80小时的数据计算使用不同团体间的显著差异t以及:成对的两个样品(MS Excel 2003)。kaplan meier分析应用于生存数据。

3所示。结果与讨论

P4肽,28-amino酸假定的绑定域的肺炎球菌表面adhesin (PsaA),是一个multilineage细胞激活剂(11]。我们已经表明,这真核细胞激活潜在的P4肽可以用于拯救老鼠从严重的葡萄球菌感染。

OPK试验表明功能性抗体血清的存在(17]。要求有针对性的功能性抗体和补充支持的假设P4增强opsonophagocytosis目标细菌的效应细胞。P4肽对细菌没有直接影响,没有有害影响人类细胞(11]。额外的实验表明,P4肽并不直接增加intraphagocytic呼吸爆发与OxyBURST-labelled细菌(见8]或活性氧(ROS)生产(数据未显示)。P4提高了在体外opsonophagocytic杀害金黄色葡萄球菌strainN种特异的抗体的存在和补充。的OPK P4-mediated增强金黄色葡萄球菌观察strainN HL-60-derived粒细胞和新鲜从人外周血中性粒细胞(数字1和2)。antistaphylococcal抗体,最大增强opsonophagocytic杀死的金黄色葡萄球菌与人性化anti-ClfA strainN被马伯(HM904)新鲜的中性粒细胞的效应细胞(100%为6.6μ免疫球蛋白g / mL,人物2)。以前,人性化anti-ClfA单克隆抗体被证明是有效的预防性保护实验室动物从葡萄球菌感染5]。

确定如果P4-mediated增强opsonophagocytosis会转化为治疗中获益,鼠标救援进行了研究。百分之七十(7/10)的老鼠接受P4和丙种球蛋白治疗存活完全缓解症状的未经处理的对照组相比,没有幸存者(,图3)。虽然有不同的治疗方法组幸存的动物数量(P4只= 40%;丙种球蛋白只= 20%),这些差异没有统计学意义()。在这项研究中,我们已经表明,P4-therapy结合IVIG有效拯救老鼠从严重金黄色葡萄球菌感染。数据显示,P4可能是一个重要的辅助免疫治疗。

老鼠的P4-mediated救援可能是因为循环效应细胞的激活导致吞噬细胞的数量的增加参与opsonophagocytic细菌病原体的清除。我们假设P4-therapy机制(18];虽然确切的机制仍在调查之中,先前的研究表明,P4疗法增强先天免疫(9]。多形核中性粒细胞(中性粒细胞)是主要的先天免疫组件由P4激活肽,我们已经观察到小鼠治疗neutrophil-depleting抗体,RB6-8C5,没有回应在活的有机体内P4疗法(7]。最近,我们已经表明,改变人口贩卖和增强专业吞噬细胞的能力也与P4-therapy(潜在的保护机制9]。我们也观察到的快速清除细菌与Fc的表面显示下降γ国际扶轮和足球俱乐部γRII吞噬细胞(9]。简而言之,pathogen-specific抗体的存在,效应细胞,补充关键因素决定的有效性P4疗法针对特定病原体(8]。

4所示。结论

金黄色葡萄球菌仍然是一个问题病原体因其广泛的毒性因子和耐药性。被动免疫疗法(丙种球蛋白)代理小菜吧像P4肽治疗提供了一种可行的替代方案金黄色葡萄球菌。因为葡萄球菌疾病负担和高病死率高,这些研究结果值得进一步探索。

确认

作者要感谢乔帕蒂博士和约翰·Vernachio Inhibitex, Inc,市郊区,GA,提供单克隆和多克隆抗体anti-ClfA金黄色葡萄球菌菌株用于这项研究。l·克利福德博士也要感谢麦当劳,医学博士,高级顾问对科学完整性,DHQP,疾控中心,亚特兰大的评论。

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