商业运输媒体的适用性不理想的条件下生物病原体

文摘

有大量的数据支持商业运输的使用媒体作为已知的临床样本的稳定器;然而,几乎没有信息来支持他们使用制造商指定的控制之外的条件。此外,没有数据来确定说媒体是否适合生物病原体,特别是那些感兴趣的美国军队。本研究评估商用现货(COTS)传输媒体基于样本复苏,生存能力和质量不致病的病毒的核酸和多肽炭疽杆菌,鼠疫杆菌,委内瑞拉马脑炎病毒,除了蓖麻毒蛋白毒素。样本存储在COTS, PBST,或没有媒体在不同的温度在一个扩展的测试期间。结果表明COTS媒体,虽然足够保护的核酸和蛋白质的物质,不能维护一个精确的表示biothreat代理的集合。

1。介绍

炭疽袭击2001暴露了美国生物恐怖主义缺陷相关的准备1]。大量传入的样本被现场移动实验室和需要航运样品非现场分析的可行性支持大规模的修复活动,比如那些发生在布伦特伍德的邮政办公室和哈特参议院大楼(2]。现场样本提取存储在水在4°C或−20°C更长的储存时间。对于非现场分析,棉签发货干在冰上。回顾性分析的事件清楚地表明,缺乏标准化的收集和处理复杂环境样品和清理污染的技术评估(1,3]。生物修复活动、纵向临床研究和验证活动支持军队和条约开发每个共享一个公共theme-a要求收集样本和保全他们的审查和分析在未来的日期。在样品必须由实验室离线分析的情况下,大量的时间可以流逝之间时当样本收集和分析。在这些情况下的生物样品往往会失去生存能力re-growth或降低和变性使随后的PCR和免疫测定的分析更加困难。必须有一个过程的短期和长期存储效率和保留样品的完整性。收集支持军事或国际条约验证组织的团队,需要的是更加复杂的难以维持冷链,高致病性的本质可能需要收集样品,在很远的地方,一个样品可能需要发货,直到它可以分析设备齐全的实验室。商用收集和传输媒体的使用是有吸引力的,由于全球可用性和低廉的价格。

下面的研究来评估潜在的一种类型的商用收集和运输系统为临床样品和确定其开发潜力成为适用于四个典型的生物起源的代理人可能感兴趣的军事和条约组织验证。每个运输系统包含一个无菌,rayon-tipped擦洗涂料用于收集样本和一个管包含运输介质的擦洗器取样后放置。我们检查了这些特定的使用COTS传输媒体保持有机体或毒素的能力生存能力,以及他们是否适合维护检测核酸和蛋白质水平对一系列环境条件。

这个研究包括了所选择的代理炭疽杆菌,革兰氏阳性和non-spore-forming endospore-forming物种,革兰氏阴性鼠疫杆菌。与减少致病性菌株(炭疽杆菌斯特恩和鼠疫杆菌A1122 resp)被用于测试。的营养形式炭疽杆菌因为孢子不需要使用液体传输介质稳定。然而,传输媒体是否适合保存营养细胞还未确定。此外,鉴于全球生物监控的扩张,这些环境采样COTS包的效用可能不仅限于传统的武器和孢子沉积,但动物尸体或人类可能适用性病人营养形式将占上风。从脱脂蓖麻子的蓖麻毒素holotoxin纯化的蛋白质毒素bio-threat代理测试。委内瑞拉马脑炎病毒(三角)被选为包膜和单链RNA病毒的一个例子,是与人类疾病有关。tc - 83 v字形的疫苗株被选为测试由于其低致病性。

2。材料和方法

2.1。生物制剂、媒介和生长条件

所有化学品都是分子级和购买的费舍尔科学(美国佐治亚州Suwanee)。炭疽杆菌(Sterne应变)和鼠疫杆菌A1122 (YPA1122)从关键试剂获得计划(CRP)(美国马里兰州阿伯丁试验场)。Sterne应变条纹在TSA板块(Inc .正欲富兰克林湖,新泽西州),在37°C和殖民地出现后孵化24小时。一个殖民地加入5毫升无菌TSB (Lenexa Remel Inc ., KS)和允许增长37°C与扶轮曝气24小时每分钟180转。文化是通过扩大1毫升的起动器并将它添加到500毫升无菌TSB文化。文化被允许增长在180 rpm - 24小时37°C。增长YPA1122遵循了类似的课程文化的异常在30°C 42-48小时孵化。委内瑞拉马脑炎病毒tc - 83是获得关键试剂项目(美国马里兰州阿伯丁试验场)。冻结的股票有一个4×10的浓度⁷空斑形成单位/毫升cell-freezing介质(目录编号为12648 - 010,英杰公司公司,卡尔斯巴德,加州,美国。细胞培养获得的供应从VWR国际(美国宾夕法尼亚州西切斯特)。病毒空斑病毒效价是由州立细胞系获得来自美国类型文化集合(写明ATCC、编目号码ccl - 81马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。的每个好six-well微量滴定板满载着5×10⁵维洛细胞(2.5×10⁵/毫升)前一天和允许孵化一夜之间在37°C公司为5%₂介绍了病毒之前,100%的湿度。一小时后孵化在37°C有轻微摇晃,病毒被和2毫升的1:1的混合物2×修改鹰介质(MEM)(目录编号为11935 - 046,表达载体,卡尔斯巴德,加州,美国)和2% seaPlaque琼脂糖(Cambrex目录编号12001 - 898年,查尔斯的城市,爱荷华州,美国)覆盖。混合物在室温下是固体,直到随后孵化48小时37°C 5%,有限公司₂和100%的湿度。蓖麻凝集素II (RCA 60,蓖麻毒素),磷酸5毫克/毫升10毫米,150毫米氯化钠,pH值7.8与0.08%叠氮化钠作为防腐剂购买从向量实验室(美国加州伯林盖姆)。蓖麻毒素是储存在4°C不使用的时候。

2.2。拭子准备

细菌培养是离心机在2200 rcf十分钟10°C以颗粒细胞。细胞球然后在10毫升磷酸盐缓冲盐水洗,14毫米氯化钠,氯化钾0.3毫米,1毫米Na₂HPO₄2毫米KH₂阿宝₄(pH值7.4)w / 0.1% Triton x - 100 (PBST)之前resuspended体积小的PBST生成细菌加载股票。为了得到一个初步的浓度,测定细菌股票在PBS稀释,光密度是决定使用规范20 d +分光光度计(热费希尔科学Inc .,沃尔瑟姆,质量,美国)相比,在波长600 nm,是从已知的细菌浓度标准曲线。股票稀释在PBST依照分光光度计数据获得约3×10的浓度⁸cfu /毫升和1.6×10⁹cfu /毫升炭疽杆菌Sterne YPA1122,分别。100年μL股票被吸收到人造丝擦洗,然后放入管包含传输媒体。除了测试以下媒体:PBST,液体定制(产品目录号140 c)和液体斯图尔特(产品目录号141 c),拭子也放入干燥管(目录编号为155 c)。所有传输媒体购买的科潘诊断Inc .(美国加州电晕),除了PBST,准备现场在无菌空运输管。拭子在每个时间点重复测试和温度。控制每个时间点满载100拭子μL PBST,但只有在孵化25°C。

两个蓖麻毒素股票是由与sterile-filtered蒸馏水稀释,最终浓度为5μg / mL的实验(HS),高和低50 ng / mL飙升(LS)的实验。人造丝棉签上升了100μL浓度高或低浓度,从而加载500 ng和5 ng蓖麻毒素/拭子,分别。三个运输条件检查:无菌水、干燥、和蛋白质(天车)的传输媒介。天车是由0.1% BSA和1.0% Triton x - 100在无菌水和内部。液体传输媒体,一毫升每个加入无菌运输管包含一个海绵(意大利布雷西亚,科潘地提供了诊断)。

三角tc - 83冻股票稀释1:20使用伯爵修改鹰的介质(EMEM)产品目录号30 - 2003(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。100年μ2×10的L⁶空斑形成单位/毫升装股票吸收到人造丝棉签然后切断成塑胶管包含3毫升M4RT (Remel、目录号R12505)或UTM(科潘、编目号码402 c)病毒传输媒体以及PBST管不含运输介质(干)。每个管也有三个1毫米玻璃珠来辅助提取。此外,一个控制拭子载着100的传输媒介μL PBST。

2.3。生存能力测试

拭子中掺入炭疽杆菌斯特恩和鼠疫杆菌A1122被存储在一个四个温度(−70°C, 4°C, 25°C,或45°C)长达60天。两个棉签删除每个时间点和涡流的拖把头提取大面积混合器(70%最大脉冲,两分钟)在5毫升PBST。为第0天、拔牙和棉签被加载的一个小时内处理,避免不可逆结合拖把头。100年μL提取的连续稀释PBST和镀到大豆胰蛋白酶的琼脂板一式三份。除了量化可行的效价与拭子,剩余交通媒体也连续稀释PBST确定可行的生物从人造丝扩散到传输媒体。炭疽杆菌Sterne是孵化24小时37°C鼠疫杆菌A1122 42-48小时孵化30°C,之后使用Q-Count殖民地统计菌落计数器(先进的仪器公司,诺伍德,质量,美国),以确定细菌浓度。

拭子中掺入v字形的病毒被存储在三温度(−70°C, 4°C,或25°C) 21天。病毒是由涡流从传输管中直接提取两分钟(干棉签提取3毫升无菌去离子水)。100年μL 900年连续稀释的传输媒介μL EMEM。500年μ每个稀释了维洛细胞L如上所述确定病毒效价。

2.4。发射极耦合逻辑免疫化学

蛋白质签名的细菌,病毒,毒素决心使用BioVeris公司M1M电化学发光(ECL)系统(美国马里兰州盖瑟斯堡,M)。发射极耦合逻辑minitube分析从关键试剂购买计划(CRP)(美国马里兰州阿伯丁试验场)。化验使用两种抗体特定抗原的单管冻干试剂格式的兴趣。此外,积极控制包括产量低(PCL)和moderate-quantity (PCM)积极控制蛋白质。这使得每个存储样本的半定量的分析比较积极的控制。拖把头提取(100μL)是直接添加到冻干试剂。M1M完全自动化和执行所有孵化项目试剂添加根据预排程序的每个试验的方法。炭疽杆菌Sterne,鼠疫耶尔森氏菌属A1122、蓖麻毒素和v字形的提取物都使用ECL MINItubes可以从CRP的化验。

2.5。实时聚合酶链反应

实时PCR用于核酸检测。炭疽杆菌斯特恩和鼠疫耶尔森氏菌属A1122化验在罗氏LightCycler 2.0使用爱达荷州技术(美国犹他州盐湖城)炭疽杆菌Sterne 1包(产品目录号3828)和目标鼠疫耶尔森氏菌属A1122目标1包(产品目录号3831),分别。测试样品的实时PCR试验由20μL的拖把头提取和20μL的装备调整缓冲区添加到冻干试剂。

病毒核酸检测是通过使用JBAIDS爱达荷州技术装备产品目录号jrpd -容易- 0114。所有实时PCR检测使用根据制造商的建议。病毒拭子中提取用水稀释10倍,和40μL稀释的样本添加到冻干重组实时PCR试剂。过境点测定使用LightCycler 4.0软件算法(罗氏诊断,印第安纳波利斯,印第安纳州,美国)。

3所示。结果

3.1。效果不理想的存储条件Biothreat代理可行性

所有数据都表示为百分比复苏相对于总试样加载到拖把头在0天。为了捕获和量化可行的生物的总量出现在一个特定的时间点,总代表的值提取的拖把头和剩余交通媒体如表所示1。


Biothreat代理	存储临时表。	存储介质	第一天	第三天	第七天	第14天	21天	28天	60天

炭疽杆菌	−70°C	PBST	3.8±0.3	0.91±0.13	5.0±0.80	4.73±0.91	1.76±0.36	0.69±0.1	3.48±0.42
		定制	3.69±0.4	2.55±0.6	7.61±1.6	13.5±3.8	3.1±0.7	4.26±0.5	3.8±0.6
		斯图尔特	2.52±0.5	2.92±0.5	17.4±3.6	9.83±1.5	5.57±0.7	7.97±1.6	7.47±1.1
		干	0.9±0.03	4.52±0.6	2.61±0.2	1.92±0.3	5.72±0.3	1.69±0.1	6.46±0.6
	4°C	PBST	4.7±0.37	0.14±0.03	0.08±0.02	0.01±0.001	0.87±0.001	0.002±0.001	0.005±0.001
		定制	7.57±0.4	0.85±0.2	0.61±0.1	0.05±0.02	0.006±0.001	0.004±0.001	0.004±0.001
		斯图尔特	14.2±3.57	2.25±0.4	0.8±0.07	0.3±0.04	0.006±0.001	0.002±0.001	0.003±0.001
		干	1.25±0.05	0.9±0.06	0.006±0.001	0.002±0.001	0.002±0.001	0.002±0.001	0.003±0.001
	25°C	PBST	73.1±15.9	52.4±5.94	114±17	62.1±6.32	79.6±3.85	71.3±4.37	56.7±5.23
		定制	68.1±14.8	102±11.6	451±22	372±46	293±39	298±28	258±11
		斯图尔特	87.4±2.61	122±6	171±23	162±18	195±28	215±18	249±22
		干	7.93±3.18	2.92±0.7	0.8±0.2	0.8±0.1	2.81±0.5	0.4±0.04	0.6±0.2
	45°C	PBST	0.01±0.001	0.01±0.001	0.01±0.001	0.003±0.001	0.004±0.001	0.003±0.001	> 0.001
		定制	16.0±2.0	2.47±0.3	3.98±0.7	1.98±0.4	0.22±0.06	0.22±0.04	0.003±0.001
		斯图尔特	0.15±0.02	0.01±0.002	0.06±0.01	> 0.001	0.1±0.01	0.005±0.001	0.01±0.002
		干	0.06±0.003	0.01±0.003	0.002±0.001	> 0.001	> 0.001	> 0.001	> 0.001

鼠疫杆菌	−70°C	PBST	1.93±0.8	0.1±0.02	0.03±0.004	0.06±0.005	0.23±0.03	0.07±0.01	0.1±0.01
		定制	2.13±0.6	3.0±0.2	1.4±0.2	3.9±0.3	2.8±0.3	0.5±0.04	1.7±0.08
		斯图尔特	2.1±0.6	6.3±1.1	3.1±0.5	2.8±0.6	4.7±0.4	2.2±0.8	2.4±0.2
		干	0.06±0.01	0.4±0.02	0.3±0.05	0.6±0.05	0.4±0.03	0.3±0.06	0.5±0.01
	4°C	PBST	20.2±2.2	7.8±0.7	13.4±1.8	4.8±0.4	6.7±0.5	3.8±0.3	2.6±0.2
		定制	49.5±3.6	37.8±2.5	54.2±3.2	53.6±4.6	50.8±4.8	12.8±1.2	10.0±1.1
		斯图尔特	41.3±5.1	22.8±1.2	32.8±3.3	66.0±6.2	51.8±4.4	15.2±1.3	32.0±2.2
		干	12.0±1.1	4.1±0.4	0.08±0.02	0.02±0.005	> 0.001	> 0.001	> 0.001
	25°C	PBST	6.6±0.8	4.7±0.3	3.8±0.5	1.5±0.1	0.7±0.05	0.2±0.03	0.2±0.009
		定制	52.3±9.6	30.3±1.4	34.2±4.0	0.2±0.002	2.1±0.1	0.1±0.03	0.005±0.001
		斯图尔特	44.4±9.8	49.0±10.2	34.5±5.2	46.6±11.8	8.0±1.4	0.04±0.006	> 0.001
		干	4.3±0.5	0.6±0.06	0.009±0.002	0.0	0.0	−	−
	45°C	PBST	0.0	0.0	−	−	−	−	−
		定制	1.3±0.1	0.0	−	−	−	−	−
		斯图尔特	1.1±0.1	> 0.001	0.0	0.0	−	−	−
		干	0.0	0.0	−	−	−	−	−

三角	−70°C	PBST			0.0	0.0	0.0
		UTM			5.7±1.1	5.48±3.0	4.28±0.23
		M4RT			4.7±0.8	10.9±3.9	14.6±2.8
		干			0.13±0.1	0.05±0.001	0.09±0.03
	4°C	PBST			0.0	0.0	0.0
		UTM			9.1±1.3	0.8±0.2	5.82±2.4
		M4RT			4.3±0.4	5.75±0.23	9.45±0.6
		干			0.0	0.0	0.0
	30°C	PBST			0.0	0.0	0.0
		UTM			11.6±9.9	0.0	0.0
		M4RT			0.0	0.0	0.0
		干			0.0	0.0	0.0

表1

的可行性炭疽杆菌,鼠疫耶尔森氏菌属,和v字形。显示的数字是总数的比例加载到人造丝拭子标本在0天。为了巩固大量样本中被提取出来,v字形集合才开始,直到第七天,只坚持21天。框一直显示为灰色,细菌和病毒之间存在冲突集合点。此外,没有了样本数据后,显示0%的生存能力连续两个时间点,由(−)表示。

3.1.1。炭疽杆菌Sterne

温度似乎产生最大影响的可行性炭疽杆菌斯特恩。最高回收率测定样品储存在25°C在液体定制液体斯图尔特,PBST(表1)。生存能力也观察到在干燥的存储条件下温度。存储在4°C和45°C导致生存能力对所有媒体的最大损失由60天(表进行测试1)。拭子在−70°C的结果存储在一个最初的生存能力下降超过96%的所有传输媒体;然而,强劲的长期生存能力是观察60天的测试期间超过存储在4°C或45°C(表1)。炭疽杆菌储存在25°C液体定制和斯图尔特液体导致的增加意味着经济复苏开始3天(表1)。样本可视化使用相差显微镜检查(见补充数据网上doi: 10.1155 / 2 dl / 463096),显示复苏的增加孢子形成细菌链成单个孢子的结果而不是发芽。

3.1.2。鼠疫杆菌A1122

就像炭疽杆菌,恢复鼠疫耶尔森氏菌属在很大程度上是依赖于温度和存储媒体。鼠疫耶尔森氏菌属生存是最好的保存在4°C液体斯图尔特,显示原始负荷材料减少了68%,而可行性PBST下降了97.4%和可行性液体定制后60天内下降了90%。所有传输媒体未能保持明显的可行性后60天25°C(表1)。PBST没有保护可行性以及斯图尔特和定制在45°C没有可行性检测到后一天。斯图尔特和定制能够保持可检测的可行性至少24小时45°C。拭子存储在−70°C液体定制和液体斯图尔特显示保持长期生存能力的能力。冻结了导致最初的生存能力下降之前第一天对所有传输媒体条件;然而,生存能力保持不变,在液体定制和液体斯图尔特和干燥条件下之后60天的测试期间(表1)。干藏表现出竞争丧失生存能力后14天25°C和几乎完全丧失生存能力由28天在4°C。

3.1.3。三角

总的来说,可行性较高时样本存储在寒冷的温度下阶层和M4RT(表1)。没有可行的病毒在任何温度从存储在PBST拭子中恢复过来。−70°C,病毒生存辅助存储在UTM和M4RT时,表现出复苏率高于样本存储在干棉签在21天的测试时间(表1)。UTM的采收率和M4RT病毒传输媒体也明显样本存储在4°C没有可行的病毒在PBST或干燥条件下(表1)。存储在30°C的复苏在很大程度上抑制病毒。UTM保存v字形的生存能力只有7天,而没有其他的运输方法是积极可行的病毒,尽管结果是高度可变的。

3.2。核酸检测细菌Biothreat代理使用实时PCR

实时PCR数据是一致的没有任何显著可见增加或减少恢复的遗传物质在所有储存条件和时间点,独立biothreat代理测试;因此,数据将作为补充。

3.3。发射极耦合逻辑Immunodetection细菌Biothreat代理

四加系统用于指示的数量根据ECL immunodetection测试是积极的。在每个时间点重复棉签提取,建立重复检测化验。因此,总共有四个发光读数,评估样本是否阳性(+)或负面(−)代理检测。

3.3.1。炭疽杆菌Sterne

保护性抗原,蛋白质检测到这个特殊的ECL工具包,在−普遍检测到70°C,但没有检测到45°C,不管传输媒体的存在或存储温度(表2)。一个积极的信号检测在第一天在4°C的储存条件但没有7天,除了干拭子的条件下检测到大量的保护性抗原在整个研究过程中。此外,只有PBST斯图尔特和液体显示任何积极的蛋白质检测25°C和只在第一天(表2)。


Biothreat代理	存储临时表。	存储介质	第一天	第七天	第14天	21天	28天	60天

炭疽杆菌	−70°C	PBST	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		定制	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		斯图尔特	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
	4°C	PBST	+ + + +	−	−	−	−	−
		定制	+ + + +	−	−	−	−	−
		斯图尔特	+ + + +	−	−	−	−	−
		干	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
	25°C	PBST	+ + + +	−	−	−	−	−
		定制	−	−	−	−	−	−
		斯图尔特	+ + + +	−	−	−	−	−
		干	−	−	−	−	−	−
	45°C	PBST	−	−	−	−	−	−
		定制	−	−	−	−	−	−
		斯图尔特	−	−	−	−	−	−
		干	−	−	−	−	−	−

鼠疫杆菌	−70°C	PBST	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		定制	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		斯图尔特	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
	4°C	PBST	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		定制	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		斯图尔特	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
	25°C	PBST	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		定制	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		斯图尔特	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
	45°C	PBST	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		定制	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		斯图尔特	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +

三角	−70°C	PBST		+ + + +	+ + + +	+ + + +
		UTM		+ + + +	+ + + +	+ + + +
		M4RT		+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干		+ + + +	+ + + +	+ + + +
	4°C	PBST		+ + + +	+ + + +	+ + + +
		UTM		+ + + +	+ + + +	+ + + +
		M4RT		+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干		+ + + +	+ + + +	+ + + +
	30°C	PBST		+ + + +	+ + + +	+ + + +
		UTM		+ + + +	+ + + +	+ + + +
		M4RT		+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干		+ + + +	+ + + +	+ + + +

表2

发射极耦合逻辑immunodetection的炭疽杆菌,鼠疫耶尔森氏菌属,和v字形。四加系统用于指示的数量根据ECL immunodetection测试是积极的。在每个时间点重复棉签提取,建立重复检测化验。因此总共有四个发光读数是否进行评估炭疽杆菌,鼠疫耶尔森氏菌属和v字形显示阳性(+)或负面(−)检测。是在表1,为了巩固大量样本中被提取出来,v字形集合才开始,直到第七天,只坚持21天。表条目有细菌和病毒之间的不整合收集点显示为灰色。

3.3.2。鼠疫耶尔森氏菌属A1122

所有鼠疫耶尔森氏菌属样本阳性的时间进程无论存储温度(表2)。

3.3.3。三角

ECL结果始终积极在21天的时间进程。v字形的病毒蛋白是可检测的所有时间点和所有的存储条件下;尽管缺乏可行的病毒在PBST(表1和2)。

3.3.4。蓖麻毒蛋白

蓖麻毒素holotoxin检测使用一个ECL-based免疫测定如上所述。使用500 ng高的峰值浓度(HS)导致了不同的相对发光信号相比,5 ng低峰值浓度(LS)(表3)。这是真的不管缺席或运输缓冲和存储温度检查。蛋白质传输媒体(天车)普遍提供最健壮的检测水平(表3在每个温度和时间点)。然而,存储在水中也导致类似的检测水平,以存储在天车25°C(表3)。随着温度的增加从−70°C到45°C,蓖麻毒素的immunodetection holotoxin降低(表3)在所有的传输媒体。最引人注目的是蓖麻毒素蛋白质检测的高尖的棉签在60天的时间进程存储45°C时液体传输媒体(表3)。


Biothreat代理	存储临时表。	存储介质	天的存储
Biothreat代理	存储临时表。	存储介质	1	3	7	14	21	28	60

蓖麻毒蛋白高飙升	−70°C	水	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		天车	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		PBST	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
	4°C	水	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		天车	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
	25°C	水	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		天车	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
	45°C	水	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		天车	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + +	−	−	+ + + +

蓖麻毒素低峰值	−70°C	水	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		天车	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
	4°C	水	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		天车	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
		干	+ + + +	+ +	+	+	−	+ + + +	+ + + +
	25°C	水	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+	−	−	+ + + +
		天车	+ + + +	+ + + +	−	+ +	−	−	+ + + +
		干	−	−	−	−	−	NT	+ +
	45°C	水	−	−	−	−	−	NT	−
		天车	−	−	−	−	−	NT	+ + + +
		干	−	−	−	−	−	NT	−

4所示。讨论

详尽的研究已经检查各种采样工具和技术的功效删除bio-threat代理从广泛的环境条件,而另一些仍在探索不同传输媒体的功效[细菌样本的可行性4- - - - - -18]。本研究评估修改的商用现货(COTS)传输媒体基于样本复苏,生存能力和质量不致病的病毒的核酸和多肽炭疽杆菌Sterne,鼠疫耶尔森氏菌属A1122、三角和蓖麻毒素在60天内。研究结果表明,COTS媒体评估这是不能维持的一个精确的表示数量的biothreat代理收集的时候。

之间的比较炭疽杆菌和鼠疫耶尔森氏菌属枚举60天的测试期间清楚地表明,虽然总数炭疽杆菌菌落计数增加,鼠疫耶尔森氏菌属数量减少。这种差异可能是由于每个有机体如何回应nutrient-deleted环境压力(19]。温度升高和斯图尔特液体定制或传输媒体的存在,这都是营养价值,促进孢子形成(20.]。低温抑制炭疽杆菌Sterne孢子形成,进而导致营养细胞的快速丧失生存能力。这表明,长期储存在升高的温度下减少恢复可行的生物除了微生物孢子形成贫瘠传输媒体的能力。不幸的是,如果一个样本慢慢从营养到孢子状态转换,在实验室里分析的样品不是准确描绘最初收集的样本在拭子在时间为零。下游法医实验室分析,需要一个精确的快照的原样品在时刻0将需要传输介质包含孢子形成抑制剂,同时保持营养细胞生存能力。

ECL蛋白质检测试验鼠疫耶尔森氏菌属A1122比相同的分析更加健壮炭疽杆菌斯特恩。使用鼠疫耶尔森氏菌属基于抗体发射极耦合逻辑分析,可以为周后检测蛋白质失去生存能力。这是生动地明显鼠疫耶尔森氏菌属A1122飙升样本存储在45°C。相比之下,炭疽杆菌保护性抗原只有很短的时间内检测到从样本存储在−70°C。观察到的差异蛋白质之间的签名检测鼠疫耶尔森氏菌属A1122和炭疽杆菌Sterne也可能是因为后者形成孢子的能力。保护性抗原不会像广泛表达炭疽杆菌sporulative状态,一般转录和翻译处于休眠状态21- - - - - -23]。如果蛋白质签名检测使用ECL进行孢壁蛋白60天,结果可能会与本研究中观察到的明显不同使用保护性抗原,需要在将来的研究中得到解决。

实时PCR试验的结果是类似与发射极耦合逻辑分析;没有相关性与生存能力。有检测到的所有传输媒体核酸水平在每一个温度超过60天的测试时间鼠疫耶尔森氏菌属和炭疽杆菌。

需要存储的v字形的病毒在病毒传输媒体如果任何可行性七天,除非样品冷冻后维护。即使对冷冻储存,商业病毒传输媒体M4RT和UTM提供显著复苏比存储在PBST或干燥条件下。三角病毒的迅速丧失生存能力当存储在PBST可能是因为病毒的破坏包络的洗涤剂(24]。

病毒蛋白的稳定性不是M4RT或增强的UTM;然而,干燥存储并减少病毒蛋白恢复不存储时冻结。没有可以得出明确的结论病毒核酸签名从收集到的数据稳定,除了蛋白质检测所有在21天的测试温度和储存条件。

实时逆转录聚合酶链反应特定的v字形显示检测到大量的核酸对所有传输媒体在每一个温度在21天的测试时间。这是可行性结果形成鲜明对比,展示生活有机体不是绝对必要的核酸检测。

这一系列的实验表明,v字形的可行性对储存条件更敏感的检测分子目标使用ECL或实时逆转录聚合酶链反应检测。可行性研究应该扩展到确定更准确的v字形多久可以恢复从样品储存在4°C在传输媒体因为白天21日,效价下降很少被记录。额外的时间点也应该检查样品储存在30°C到更精确地确定病毒在这个温度衰减的速率传输媒体。时间进程的研究也应该延长ECL和实时PCR检测。

存储ricin-contaminated拭子在天车或水冷藏或冷冻导致蛋白质检测高于干棉签在相同条件下完成的60天的测试时间。然而,由于数量有限的样本和semiqualitative性质的分析,进一步测试和蓖麻毒素活性测定需要确定无菌水和铝之间存在显著差异蛋白质签名的稳定性。冷冻储存在−70°C提供了最好的稳定性就是明证的一致的检测轻拭子污染。的储存条件,蓖麻毒素出席后60天似乎察觉到28天,尽管这可能是实验设计的工件。蓖麻毒素没有生殖能力,可检测材料在60天的增加可能是由于蒸发缓冲区用于飙升蓖麻毒素在擦洗人为增加浓度,虽然更多的数据需要28天到60来支持这种说法。此外,由于ECL免疫测定,没有办法告诉如果蓖麻毒素检测60天活跃。

本研究评估使用常见的COTS运输和稳定系统为各种擦洗biothreat代理。结果表明,这些类型的COTS运输系统,通常使用在临床的设置,可用于储存和运输biothreat代理在环境设置条件可能不到理想只有在获得“是”或“否”的答案是足够的和敏感的分子分析。可行性研究表明,COTS运输的类型和稳定测试不能biothreat代理的维护一个精确的表示集合的时候,不应该用于法医分析。特别是孢子形成的细菌。未来交通媒体设计需要解决这个问题。

确认

作者表达自己特别感谢Kakoli金酒和艾伦和莎拉Katoski上汽的美国陆军Edgewood化学生物中心帮助准备手稿。

补充材料

补充图1描述了显微图像,使用100 x客观,拍摄的炭疽杆菌斯图尔特PBST孢子形成,液体定制和液体传输媒体七天。营养细胞被视为长纤维在股票文化零天PBST(面板左边)。孢子也观察到小折射的身体内丝状细胞或细胞碎片或免费在传输媒体(右边面板)。补充2 - 4数据说明了使用实时PCR核酸检测鼠疫耶尔森氏菌属,炭疽杆菌和v字形。每个图总结了实时检测数据为每个传输媒体在每个存储温度:−70°C (A), 4°C (B), 25°C (C)和45°C (D)鼠疫耶尔森氏菌属和炭疽杆菌−70°C (A), 4°C (B)和30°C (C) v字形。数据点代表平均C_t值两个PCR反应在60天的测试时间。

补充材料

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