文摘
的在体外的生存大肠杆菌O157: H7在在两种实验条件下(无菌的土壤和自然水)检查。DNA微阵列整个组大肠杆菌O157: H7基因用来测量基因表达模式后14天。尽管人口下降,一些大肠杆菌O157: H7细胞生存在无菌溪水在无菌土壤长达234天,179天。在土壤微观细胞培养14天表示对抗生素抗性基因,生物合成,DNA复制和修改,新陈代谢,噬菌体,转座子,质粒,发病机理和毒性,抗生素耐药性,核糖体蛋白,压力反应、转录、翻译、和运输和结合蛋白水平显著高于细胞生长在Luria肉汤。这些结果表明,大肠杆菌O157: H7期间可能产生不同表型的交通环境。此外,这种病原体可能变得更加耐抗生素使随后的感染更难以治疗。
1。介绍
大肠杆菌O157: H7是肠出血性的E。杆菌产生一个强大的类志贺毒素。它能够导致血便,出血性结肠炎,溶血性尿毒症综合征(1]。O157: H7近75000例感染发生在美国每年(2]。大多数与食用受污染的相关疫情,未煮熟的,牛食品(1]。也有报道E。杆菌O157: H7暴发相关与饮用水和娱乐(3- - - - - -7]。
E。杆菌O157: H7无处不在在农场健康牛羊港的病原体在胃肠道(8]。因此,农场动物粪便传播源E。杆菌O157: H7的环境和潜在的人类食物链。的最常见的一种模式E。杆菌O157: H7介绍到粮食作物是通过受污染的灌溉用水9]。此外,这种病原体的传播通过环境与径流污染的牛的粪便或用作土壤改良剂(10]。地表水和地下水的污染在美国的农村地区日益普及的结果集中的动物饲养操作(9]。
大肠杆菌O157: H7能生存在广泛的条件下在不同的栖息地。环境中,细胞处于快速变化的条件如pH值的变化,营养可用性、温度、氧化应激和渗透的挑战11]。E。杆菌O157: H7污染水和土壤是依赖这种病原体的能力,以适应这些变化。然而,有限的信息有关的生存E。杆菌O157: H7土壤和水作为细菌的增长,如果有的话,在这些环境中是不清楚或记录。E。杆菌O157: H7可能应对不良环境条件通过表达各种应激反应基因,使生存(12]。主调节器的应激反应是σ因子的一种选择(rpo)。σ因子可能在应对压力诱导如弱酸、饥饿、高渗透性、高或低温度(13]。有证据表明,应激反应可以使生存在更严重的情况下,增加致病性,增强抗二次压力(14]。换句话说,当E。杆菌细胞被强调,他们变得更难杀,更耐饥饿和有毒化学物质通常用于配电系统如氯。因为这重要的公共卫生意义E。杆菌O157: H7能开发一个disinfectant-resistant表型在运输水处理厂(14]。因此,了解压力对基因表达的影响,以应对改变环境条件可能在理解这种生物的生存来说至关重要,因为它从一个环境移动到另一个地方。
有限的工作已经进行了调查E。杆菌O157: H7环境中的生存和功能基因组学。这还需要进一步的研究来理解支持的机制E。杆菌O157: H7生存在这样一个各种各样的环境。本研究的基因表达谱进行比较大肠杆菌O157: H7(土壤和自然水)两种环境条件下使用DNA微阵列表达增长媒体。此外,我们调查的长期生存E。杆菌O157: H7的微观模拟这些环境。
2。材料和方法
2.1。土壤和水收集和网站描述
土壤和水从纽比沟收集2006年6月在24小时内降雨事件(1.93厘米或0.76英寸)。纽比沟位于Mississinewa流域内冰碛平原东部中央的蒂普顿印第安纳州(美国)。这个分水岭的特点是高度干扰中耕作物农业景观成为主流。环境样品被放置在无菌瓶和存储在一个冷却器冰袋运输样本的实验室。在24小时内处理用作水土微观根据下面描述的方法。
2.2。培养液和孵化条件
E。杆菌写明ATCC 35150是用于调查O157: H7应变生存和两种不同的环境条件下基因表达的差异相比,仅有肉汤(磅)(位于马里兰州Rockville BD,)。要长期储存,文化是保持在10%甘油c。在短期内,细胞培养在营养琼脂(BD)偏。的E。杆菌O157: H7实验文化是由铂环量的偏文化移植到包含30毫升的磅。100毫升瓶瓶是孵化24小时C没有颤抖。这种文化被用来接种治疗的三个条件:30毫升磅控制,90毫升无菌水微观流,和100 - g无菌土壤微观。30毫升磅控制(100毫升瓶)接种1毫升的文化和孵化C用颤抖的在48小时60 rpm。剩余的细胞被离心收获10000g 10分钟C (Sorvall RC-5B),与无菌去离子水清洗两次,在10毫升无菌resuspended溪水或10毫升无菌去离子水。这种悬架是用于接种流水土缩影,分别。控制和水实验使用十执行复制,微阵列分析四个和六个监测生存与更换。土壤的治疗方法是用34复制,四个微阵列分析和30监控生存不重复。水微观被孵化C用颤抖的60 rpm,土壤微观被孵化C没有颤抖。四个缩影,每个土壤和水,被移除后14天进行DNA微阵列分析。的四个烧瓶C磅控制被移除后48小时内进行DNA微阵列分析。生存是定期评估使用下面描述的扩散板的方法。
2.3。水的缩影
在这个实验中使用的溪水的pH值7.26。整除的水(90毫升)放入250毫升无菌瓶和热压处理过的C在15 psi 15分钟。灭菌后,水储存在微观C到接种。接种后为8.8CFU /毫升E。杆菌O157: H7写明ATCC 35150年,水微观孵化C用颤抖的60 rpm。
2.4。土壤微观
本研究中使用的土壤是一只狐狸粉砂壤土pH值为6.95 (15]。福克斯粉砂壤土是一个典型的农业土壤在印第安纳州中部东部。它是一种温和的可用水量排水性良好的土壤,穷人和中等径流,过滤能力(15]。土壤pH值是由土壤放置20克到50毫升烧杯,添加20毫升的去离子水,搅拌30分钟(16]。这种悬架被允许接受一个小时,和pH值用酸度计测定。土壤含水量测定用重量法;土壤是重,烤箱干C,然后reweighed直到样品重量是常数(16]。土壤含水量是确定为0.323(32.3%),这是一个稍微湿润土壤(15]。大型岩石和碎片从干土,和100 - g整除被放在250毫升玻璃瓶。土壤微观在热压处理过的C在15 psi 15分钟灭菌后,土壤是返回到干燥箱24小时C除去任何残留的水分。贫瘠的土壤,根据板计数检查,接种前储存在室温下。土壤含水量是适应现场条件通过添加32.3毫升无菌去离子水(16]。接种后与CFU /毫升E。杆菌写明ATCC 35150 O157: H7,微观静态密封和孵化C。
2.5。菌落计数
最初(零时postinoculation)浓度E。杆菌O157: H7孵化前决心为每个条件。E。杆菌O157: H7浓度测定为每个条件通过扩散板的方法。样本计数被直接从水微观和磅肉汤。提取的细菌从土壤,100毫升0.1%的聚乙二醇(PEG)添加到100克的土壤。这种悬架(150 rpm)动摇了15分钟C,然后允许五分钟。这个悬挂的上层清液离心10分钟(10000克,C),以及由此产生的上层清液用于列举细胞。活细胞计数进行重复的序列在0.9%无菌生理盐水稀释和扩散板培养0.1毫升到R2A琼脂(BD)板块。盘子被孵化C 48小时。孵化后,盘子与菌落计数25和250年之间被认为和重复的平均数量。殖民地的平均数量除以原溶液的体积或质量估计CFU /毫升的数量和CFU / g,分别。
2.6。总RNA的隔离
总RNA分离使用FastRNA Pro Soil-Direct工具包(Qbiogene, Inc . CA)和少量修改(在下面描述)来提高质量和产量。的kit-supplied赖氨酸矩阵E管被放置C RNA提取前2天以减少取暖和RNA降解。一克的样品被放入kit-supplied赖氨酸矩阵E为裂解管。样品溶解进行使用Mini-BeadBeater-1仪器(Biospec产品,Inc .,巴特尔斯维尔)80秒的速度设定48(最大速度)。RNA是离心机通过kit-supplied快速清理自旋过滤器去除残余抑制剂后提取并存储在100年L DEPC -在c . RNA质量由1.0% (w / v)琼脂糖凝胶电泳和光谱分析(OD260年/ OD280年)使用热科学液体GENESYS 5分光光度计。260海里的OD测量被用来量化RNA产生。大约有100克每样本获得的总RNA。纯化RNA样本在冰上交付给霍华德埃登贝里博士的实验室印第安纳大学医学院的医学基因组学中心的微阵列分析。
2.7。DNA微阵列,cDNA制备、杂交
DNA微阵列是用来评估的基因表达谱E。杆菌O157: H7写明ATCC 35150维护三个环境条件。用于微阵列系统E。杆菌是GeneChipE。杆菌2.0基因阵列(Affymetrix公司,圣克拉拉,CA)。微阵列分析四个biologically-independent复制(对E。杆菌增长,RNA隔离、样品制备和阵列杂交)为每个治疗条件。
原核样本的标准协议和阵列处理Affymetrix推荐的GeneChip表达分析技术手册(Affymetrix,圣克拉拉,CA)使用。互补脱氧核糖核酸合成使用T7 promoter-dT24寡核苷酸作为底漆与英杰公司生活技术SuperScrip选择系统。下面两样东西互补脱氧核糖核酸合成和孵化与T4 DNA聚合酶、产品纯化使用Affymetrix清理模块。生物素化的cRNA使用溶Affymetrix工具包。cRNA是使用试剂盒纯化RNeasy列,量化,然后支离破碎的孵化与镁在高温下。生物素化的cRNA被添加到一个杂化的解决方案和杂化GeneChip后添加控制寡核苷酸C的17个小时不断旋转。杂交混合物被移除,GeneChip洗,沾phycoerythrin-labeled链霉亲和素使用Affymetrix流体。GeneChip又洗了,孵化与生物素化的antistreptavidin,然后restained phycoerythrin-labeled链霉亲和素放大信号。平衡组样本并行处理,以减少非随机误差。使用专用的数组进行扫描扫描仪由Affymetrix GCOS控制软件。
2.8。数据分析
微阵列表达数据使用Affymetrix GCOS生成软件。Affymetrix微阵列套件算法用于分析杂交强度GeneChip表达式探测器阵列和数据计算一组指标来描述探头组的性能。每个数组的平均强度归一化了1000年全球扩展目标强度。平均每个治疗组表达值通过计算几何平均数,因为它是更好地应用于数据波动大。只有探针集收到了“现在”的75%或更大的被认为是。表达式值被规范化变换(17]。两个治疗比较确定比相应的基因表达的平均强度为每个治疗。褶皱变化计算数据(感应范围从1到100的值,而镇压限制的值在0和1之间的空间(18]。例如,值为2表示2倍upregulation值为0.5时表示的基因差别2倍对这些比较Luria肉汤的环境条件。一个以及在转换后的数据进行使用Microsoft Excel。进行重要的基因选择使用Microsoft Excel滤波器函数选择的基因大于或等于2倍和差别,或者对这些P价值than.05少。
2.9。官能团
功能显著表达基因测定使用affymetrix NetAffx分析中心(http://www.affymetrix.com/analysis/netaffx/index.affx)和EcoCyc (http://ecocyc.org/)数据库。官能团的分析是由基因分配给一个13官能团。
3所示。结果
3.1。的生存大肠杆菌O157: H7的无菌土壤微观
8.8土壤微观接种10毫升108CFU /克E。杆菌O157: H7写明ATCC 35150株。后立即接种,平均预培养的浓度E。杆菌O157: H7是1.8107CFU / g。孵化后在C,生存是定期监控了179天。没有明显的下降E。杆菌观察O157: H7浓度在第一次30天的孵化(图1)。最后测量是拍摄于179年的一天,细胞的平均浓度为7.7107CFU / g(数据未显示)。
3.2。的生存大肠杆菌在水中O157: H7的缩影
无菌水接种10毫升CFU /毫升E。杆菌O157: H7写明ATCC 35150株。0天,平均浓度E。杆菌O157: H7是CFU /毫升。孵化在微观世界C与温柔颤抖60 rpm,生存是监控为234天。减少E。杆菌O157: H7浓度低于postinoculation浓度没有被观察到,直到第三天(图2)。人口下降小于0.3日志由28天。最后的测量是拍摄于234年的一天(接种后近8个月),和细胞的平均浓度CFU /毫升(数据没有显示)。
3.3。微阵列分析
的基因表达谱E。杆菌写明ATCC 35150孵化O157: H7无菌土壤、水和磅进行评估。日志表达的比率E。杆菌O157: H7基因组细胞生长在磅在60 C 48小时用颤抖的rpm和fourteen-day孵化无菌水C是如图3。整个基因组的分析表明,705个基因高表达在磅(绘制一个负值),751个基因高表达在无菌溪水(正值)策划(图3)。图4显示了日志的表达率E。杆菌O157: H7基因组细胞生长在磅C 48小时而fourteen-day孵化在贫瘠的土壤c .整个基因组的分析表明,2664个基因高表达在磅(绘制一个负值)在1823个基因高表达的无菌土壤(绘制一个积极的价值)。
分析基因比例显著表达水平(2折,P价值. 05)显示,大部分的基因条件之间没有显著差异。尤其是磅与细胞生长的细胞在无菌溪水孵化;26个基因相比,更重要的是表现在磅12基因在细胞培养无菌溪水(表中1)。细胞培养的比较无菌土壤相比,细胞生长在磅产生了更多的表达的差异;89基因表达水平明显高于在磅308个基因高表达在无菌土壤(表2)。
的官能团分析显著表达基因磅和无菌土壤(表2)和磅和无菌水(表1)。官能团分析磅和无菌土壤显示细胞孵化无菌表达更多的抗生素抗性基因,生物合成,DNA复制/修复和限制/修改,新陈代谢,发病机理和毒性,噬菌体,转座子,质粒,核糖体蛋白,应激反应,转录,RNA加工、退化、翻译和翻译后修饰,运输和结合蛋白(表2)。官能团分析磅和无菌的溪水显示细胞孵化溪水表达更多的未知功能的基因,细胞生长在磅表示更多的核糖体蛋白基因,信号和能动性,应激反应,转录,RNA加工、退化、翻译和翻译后修饰,运输和结合蛋白(表1)。这些差异基因表达的本质是详细描述表3和4。例如,七个氨基酸生物合成基因的表达水平明显高于土壤中比在磅(表3)。没有这些氨基酸生物合成基因的差异表达细胞间生长在磅和细胞培养无菌天然水(表中4)。的55个基因编码核糖体蛋白质,45是表达水平明显高于土壤相比,仅有肉汤(表2)。只有一个核糖体蛋白基因(rpmC)明显表现在细胞生长在磅水相比(表1)。
应激反应的基因包括那些功能温度冲击,耐酸碱,SOS反应,渗透的挑战。十八应激反应基因明显表达细胞孵化在无菌土壤相比,磅(表2)。另一方面,三个压力反应的基因相比,更重要的是用磅表示细胞培养无菌天然水(表中1)。的rpo基因诱导响应进入固定相,也强调如弱酸、饥饿、渗透的挑战,和温度变化。的表达rpo土壤中显著升高(2.68倍感应)(表吗3)。的rpoH热休克σ因子32 (),调节热休克反应,更多的高度表达的土壤相比,磅(3.19倍感应)(表3)。细胞生长在土壤热休克基因的表达dnaK和htpX在更高水平(表3)。此外,表3所示rseA的antisigma调节器rpoE信封系统热应力,在细胞培养诱导土壤感应(3.29倍)。许多冷休克基因明显表达在细胞培养土壤相比,细胞生长在磅:cspA、cspE cspG ymcE,死了,yfiA(表3)。只有一个冷休克基因(中海壳牌)表达在细胞水平显著降低孵化在无菌水相比,细胞生长在磅(0.48倍镇压)(表吗4)。两个基因参与细胞表达的SOS反应明显生长在土壤相比,磅:recA和苏拉。这种监管网络引起的DNA损伤或干扰DNA复制。的osmotically诱导基因osmB表达在细胞水平明显高于土壤中孵化感应(4.77倍)。osmB编码未知函数的一个外膜蛋白。七个基因帮助发病机理和毒性明显表现在细胞培养土壤相比生长在磅(表2)。特别是,vacB诱导基因表达(2.26倍)(表3)。托拉,一个基因参与大肠杆菌素生产,明显表现在细胞相比,土壤中孵化细胞生长在磅(2.26倍感应)(表3)。此外,袜基因高表达的细胞培养无菌土壤微观(感应)2.44倍(表3)。最后,三种抗生素抗性基因(马尔马拉,和marB)表达在细胞水平明显高于孵化在无菌土壤微观而磅(表2)。
4所示。讨论
E。杆菌O157: H7可能遇到条件低于最优增长的土壤、水和为了生存必须适应这些条件。各种应激反应机制允许这种病原体适应亚致死的环境条件。这些压力使延长E。杆菌O157: H7生存在更严重的情况下,增加其发病机理,提高其耐化学物质通常用于配水系统(14]。因为这重要的公共卫生意义E。杆菌O157: H7能开发一个disinfectant-resistant表型在运输水处理厂(14]。因此,本研究调查的生存和基因表达谱E。杆菌O157: H7无菌的土壤和自然水。我们的结果表明,E。杆菌O157: H7可以持续很长一段时间在无菌土壤和无菌水。此外,我们发现E。杆菌O157: H7展品差异基因表达谱在无菌的土壤和溪水相比,细胞生长在磅新鲜。这种生存不占的可能影响竞争与其他细菌或与掠夺性原生动物的互动。在自然条件下,捕食者和其他细菌存在,净相继死去E。杆菌O157: H7可能发生。也有可能的环境持久性E。杆菌O157: H7细胞最初生长在粪便提取物可能是不同的。
在无菌土壤微阵列分析显示,细胞培养14天仍然非常活跃。事实上,308个基因被发现在这些细胞高表达与细胞生长在磅。官能团分析显示,大多数的这些基因参与氨基酸生物合成、DNA复制和修复,发病机理和毒性,应激反应,核糖体蛋白质、抗生素耐药性,转录和翻译。另一方面,微阵列分析细胞置于无菌溪水14天显示只有12个基因高表达了在这种情况下。大多数的这些基因是未知函数的未分类。有显著差异的核糖体蛋白的表达和翻译的基因。通常,更快增长较快的细胞合成蛋白质,含有更多的核糖体(19,20.]。道等。18)的基因表达研究E。杆菌K12的应对营养限制。这些研究人员发现,42核糖体蛋白基因表达水平明显高于高营养条件下细胞生长。目前的研究,另一方面,表明45核糖体蛋白基因高表达的细胞培养无菌土壤相比,细胞生长在磅。除了growth-rate-dependent监管核糖体数量发生在非常低的增长率(21]。当E。杆菌细胞适应缓慢的增长率从快速,RNA的积累就在短时间内衰减到RNA含量降低,细胞生长的特征(速度较慢,22]。
人们认为相同的机制,功能在氨基酸饥饿还在增长速度转换功能。事实上,不断积累的RNA在细胞部分氨基酸饥饿已被证明是伴随着持续合成核糖体蛋白(23]。这可能占核糖体蛋白基因的高表达在本研究观察到的基因编码的氨基酸生物合成所需的酶高表达在细胞培养无菌土壤微观。在E。杆菌、有97个已知基因负责编码氨基酸生物合成所需的酶(18]。以前的结果(18]表明这些基因诱导为低营养环境中增长似乎在目前的研究。增长条件,导致核糖体合成的降低率通常导致过度的核糖体蛋白质,和其转录水平更高的增长更快的细胞。
监管机制,控制一般的压力反应是rpo西格玛因子()和编码的rpo基因(24]。提前适应细胞暴露于环境压力包括的表达rpo。这个基因,控制50多个蛋白质的表达,是诱发响应进入固定相,也强调如弱酸、饥饿、渗透的挑战,和温度变化13]。的表达rpo在无菌土壤微观细胞细胞培养相比,高出2.68倍Luria误事。此外,18的表达基因参与应激反应的细胞从土壤中高度表达。这些基因调节细胞反应冷冲击、热冲击,耐酸碱,渗透挑战,SOS反应(24]。这表明土壤环境强调这些细胞,他们打开基因应对亚致死的环境条件。
热休克反应是一种保护机制,以应对燥热引起蛋白质损伤;然而,有证据表明这些基因也诱导针对酸性条件(17],SOS-inducing治疗[25),和亚致死的暴露于氯(26]。大多数热休克蛋白作为分子伴侣结合而稳定的蛋白质,促进蛋白质重折叠和适当的组装27]。是这样的产品dnaK基因。的dnaK基因产物可以调节其他热休克蛋白,如htpX,扮演了重要的角色在消化不可逆热损坏的多肽(28]。除了希思休克蛋白质,许多冷休克基因明显表达在细胞培养土壤相比,细胞生长在磅:cspA、cspE cspG ymcE,死了,yfiA。这些基因保护细胞在亚致死的环境温度。CspA是致病的主要冷休克蛋白E。杆菌。它的功能作为一个RNA伴侣和促进翻译在低温下(29日]。特定的σ因子尚未确定的冷休克反应(27]。
两个基因参与细胞表达的SOS反应明显生长在土壤相比,磅:recA和苏拉。这种监管网络引起的DNA损伤或干扰DNA复制。RecA蛋白功能作为SOS的积极控制规定,要求所有同源重组E。杆菌同源分子之间,催化突触和链交换(30.]。的苏拉基因产物功能作为分隔作用的诱导抑制剂(31日]。当细胞暴露于SOS-inducing环境中,他们将继续拉长,但不能有隔膜的,从而形成细丝。
几个基因的发病机理和毒性E。杆菌O157: H7明显表达细胞无菌土壤微观。的vacB所需的基因,这是完整的毒性表型的表达E。杆菌(32),是细胞培养在土壤中高度表达。此外,一个基因参与结肠酸生物合成,wcaL在土壤相比,高表达磅。wcaL是最后一个基因的colanic酸基因簇33]。Colanic酸在细菌细胞表面形成防护膜,在发病机制中发挥作用34]。Danese et al。35]表明结肠酸合成调节生物膜,不是合成浮游细胞正常的实验室条件下。这可能占结肠酸的差异基因表达之间观察到细胞培养无菌土壤微观生物膜(很可能)相比磅控制。一个基因参与了大肠杆菌素生产,托拉在更高的级别上,明显表达在细胞培养相比,土壤中细胞生长在luria肉汤。大肠杆菌素抗菌蛋白质产生的一些菌株E。杆菌杀死竞争的菌株通过抑制能量代谢、蛋白质合成、DNA合成(36]。大肠杆菌素也被认为是宿主防御细菌耐药性增加。此外,三个基因(马尔马拉,和marB)负责多个抗生素耐药性更无菌土壤中高度表达。多种抗生素耐药性(3月)轨迹E。杆菌由两个操纵子(马克和marRAB)。的表达marRAB操纵子保护E。杆菌对许多抗生素(37]。此外,高表达袜与多种抗生素耐药性相关基因产物是(mar)表型[37]。的集体表达这些基因和基因一般应激反应可能导致细菌生存和中毒性感染。事实上,有证据表明抗生素治疗增加了儿童溶血性尿毒症综合征(HUS)的发展E。杆菌O157: H7感染(38]。
总之,Affymetrix GeneChipE。杆菌基因组数组是用来证明E。杆菌O157: H7细胞置于无菌土壤和水的缩影基因差异表达C 14天展览相比,细胞生长在磅C 48小时。细胞培养在无菌土壤微观无疑是强调在不同的生理状态,因此细胞生长在磅C 48小时。这些细胞表现出一种表现型,可能导致跟压力消毒阻力,增加了发病机理和毒性。这具有重要影响的水处理和公共卫生,因为地表和地下水的来源是市政饮用水。进一步研究机制和监管的压力反应E。杆菌O157: H7需要预防疾病的潜在风险。也有可能在未经消毒环境中基因表达可能是不同的,这需要调查。
确认
微阵列研究使用中心的设施进行了印第安纳大学医学院的医学基因组学。医学基因组学中心部分赞助来自美国印第安纳州印第安纳大学基因组计划(INGENE,支持部分由礼来养老,Inc .)。此外,作者感谢迈克尔·泰勒大学Guebert博士协助选择示例站点。