文摘
实验研究利什曼虫金属和抗阻力指出,基因扩增是戒毒中心的主要机制之一。放大的基因代码腺苷triphosphate-dependent转运蛋白(多药耐药性和22 P),酶参与trypanothione通路,特别是伽马谷酰基半胱氨酸合成酶,和其他参与叶酸代谢、二氢叶酸还原酶和pterine还原酶等。本研究的目的是检测和量化这些基因的扩增内脏利什曼病药物在临床菌株:婴儿利什曼虫,l . donovani,l . archibaldi。相对量化实验通过实时聚合酶链反应表明,多药耐药性基因扩增是更频繁的事件。22 P和二氢叶酸还原酶基因,水平的放大后相当水平观察体外耐药克隆的选择。因此基因扩增是一种常见的现象在野生菌株并存利什曼虫基因组可塑性。这一发现印证了实验研究的结果,支持更好的理解金属电阻选择和传播在流行地区。
1。介绍
内脏利什曼病(重要的)是一个公共卫生问题在东非,亚洲、地中海盆地和中美洲和南美洲。据估计,每年约有500 000个新病例发生。在东非和印度,六世导致大规模和顽强的病死率率高的流行病(1]。在很多国家负担不起费用的脂质体两性霉素B,第一行治疗仍然依赖于stibogluconate钠或N-methyl glucamine [2]。案例描述了耐火材料锑治疗人类很长一段时间(3)以及狗(4]。在过去的几十年里,中锑药物的耐药性的发生率利什曼虫spp。大大增加了一些重要的焦点5]。导致耐药的机制在活的有机体内也不太清楚。在体外菌株选择金属电阻的研究表明,几个独立通路可能同意抗性表型(6]。其中,能源的过度依赖转运蛋白似乎发挥重要作用在锑的阻力(综述(7])。基因编码ATP结合盒(ABC)转运蛋白(8)和多药耐药性(MDR)基因(9)已被证明被放大在菌株选择染色体外的元素在体外抗重金属。一些作品表明,基因一致谷胱甘肽和抗寄生虫trypanothione合成也可以放大(10]。基因扩增也被描述的利什曼虫菌株选择抗甲氨蝶呤(11]。其他分子参与三价锑或亚砷酸盐化合物运输aquaglyceroporins像达到的监管提供了阻力三价锑和变异可能影响运输专门金属(12]。
然而,所有这些发现来源于研究菌株的诱导阻力在体外对自然条件和数据缺乏。因此,本研究的目的是评估基因扩增的频率和放大抗药性的基因水平利什曼虫临床菌株。
2。材料和方法
2.1。利什曼虫株
这项研究包括90名利什曼虫菌株与法国和苏丹六世疫源地。
六十l . infantum收集菌株在法国从16 HIV阳性病人原地六世。复发发生时,我们连续执行寄生虫分解动作:为每一个病人,隔离不同的数量从2 - 7和调查的持续时间(表10到1800天1)。
二十7株(15l . donovani、6l . archibaldi和六个l . infantum),从27孤立苏丹的病人。这些患者感染了艾滋病毒。其他三个菌株(两个l . donovani和一个l . infantum)从苏丹分离post-Kala-Azar同属的利什曼病(PKDL)患者(表2)。
所有菌株都确定、类型和低温贮藏在国家中心参考利什曼病(法国蒙彼利埃)。
一个婴儿利什曼虫菌株,分离出一只狗在一个区域没有任何治疗压力(MCAN / 82 / GR / MON497),被用来作为参考(校准器)相对量化实验。在体外敏感性分析证实了这一毒株的敏感性锑的(13]。这是使用相同的条件作为研究菌株生长。
2.2。DNA提取
寄生虫是生长在RPMI介质(含10%胎牛血清,庆大霉素,所有从σ);细胞被离心收获,洗两次与PBS DNA提取。DNA纯化从5 106promastigotes通过QiaAmp DNA迷你包(51034年试剂盒ref)根据制造商的规格。与100年进行洗脱L DNAse自由水和浓度测定的分光光度法。DNA的解决方案保持冷冻(−40直到使用C)。
2.3。在研究相对量化的基因
我们专注于以下基因:两个ATP-dependant药物转运蛋白,MDR 1和22 P (PGP);一个基因参与谷胱甘肽和trypanothione合成,G-glutamylcysteine合成酶(GSH1);两个基因参与了叶酸代谢途径,二氢叶酸reductase-thymidlate合成酶(DHFR-TS)和pterine还原酶(PTR1)。
我们测量通过实时PCR,扩增水平相对不变的基因。我们使用两个单拷贝基因作为参考基因:DNA聚合酶(14)和ascorbate-dependant过氧化物酶(15]。引物和探针定位DNA聚合酶基因选择根据布列塔尼et al。16]。下ascorbate-dependant过氧化物酶和基因研究中,提取特定序列从基因库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和引物和TaqMan探测器被设计通过Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)。表3总结了序列的引物和探针用于这项研究。
化验都是复式PCR,表现在重复实验中,Stratagene MX 4000热循环与多路复用QPCR现成的混合(Stratagene ref 600549 - 51)。每个试验是由使用0.1 ng的DNA模板示例。热剖面是94聚合酶激活C 10分钟,94年C 30年代,54岁C 30年代,45周期。所有的样品参考应变的结果相比的三角洲(三角洲Ct)方法;这种方法计算,对于每一个样本,感兴趣的基因水平的相对不变性的基因,然后标准化结果的校准器(17]。
2.4。统计分析
统计分析是计算使用SAS统计9.1.3 (SAS、卡里、数控、美国)统计软件。基因扩增的发生是否相关利什曼虫每个研究基因物种测试使用皮尔逊卡方测试。
3所示。结果
3.1。阈值
对于每一个基因的研究,我们需要估计一个阈值放大。在这一目标,我们确定敏感的基因扩增水平参考应变从十生物复制。我们认为这一水平作为一个敏感的参考价值。阈值定义重要的基因扩增是固定的计算平均值10复制扩增3标准差来避免超过估计的基因扩增。表4礼物意味着,标准差,为感兴趣的基因和阈值;因此放大阈值都低于2,表明我们的化验能够辨别至少两倍,基因扩增相对选择参考。
3.2。菌株耐药基因扩增的证据领域
强度和频率相关的数据下的菌株基因扩增研究提出了在表1,2,4。只统计了账户初始应变孤立的结果从法国病人。
MDR 1基因至少两次放大30的46个原始菌株,代表65%的病例。谷胱甘肽在只有三个放大苏丹菌株(意思是放大级别= 2.41)。在第一个应变,谷胱甘肽放大与PGP, MDR 1, PTR1放大;第二,谷胱甘肽放大与PGP和MDR 1放大;第三,谷胱甘肽放大与MDR 1放大。
5的16法国病人原始菌株显示DHFR基因扩增;在四个菌株MDR 1基因也被放大。
3.3。稳定连续菌株之间的基因扩增水平相同的病人
我们分析了基因拷贝数变化的顺序从16株法国病人。变化的PGP, MDR 1,谷胱甘肽,DHFR和PTR基因扩增对初始水平小于或等于28%,34%,25%,33%,和10%,分别,除了增加PGP放大级别中观察到一个病人(F8)。这种情况下与病人最初处理N甲基glucamine他最初的22个月后复发的疾病。对于这个病人,两个菌株,期间收集的复发,面对PGP放大级别的7.84和7.49,而不是0.45的初始水平之前,第一个疗程(图1)。
3.4。在利什曼虫物种基因扩增频率
我们测试了最终的物种之间的联系l . archibaldi l . donovani(没有在地中海聚焦),l . infantum(在两个研究焦点)和基因扩增。只有MDR 1放大,这是83%的观察l . infantum菌株,在统计学上(P= .04点)与物种(表5)。
4所示。讨论
几项研究旨在文档之间的基因扩增利什曼虫菌株的基因组选择下在体外药物的压力及其参与耐药机制(18]。第一种方法使用杂交实验标准化后的样品的看家基因(8]。最近,微阵列技术开发;大量的基因可以分析成一个单一的实验中,提高检测能力。这种技术证实基因扩增的参与利什曼虫锑阻力,并辅以其他技术最好的量化的变量基因(10,19]。更好的精度是比较实时PCR方法获得的,量化的目标基因的拷贝数一个或多个管家基因。
我们分析了放大5基因耐药性实验研究的基础上。我们的方法是可再生的足够的升值将增加两倍,基因扩增,但提出了一些限制方面。一个明确的临床治疗和基因扩增反应之间的相关性是不可能建立,因为大多数的法国患者用脂质体两性霉素B治疗和我们缺乏精确的信息对葡甲胺反应antimoniate政府在苏丹的情况下。其他机制比基因扩增参与抵抗治疗如过度表达,有时两个现象联系(20.]。在这项研究中,promastigotes体外5到8通道后进行测试;我们假设研究字符是稳定的,像其他作者所描述的那样在活的有机体内(21),在体外(22]。然而,我们相信我们的结果突出的耐药现象的一些重要方面利什曼虫需要进一步讨论。
我们的主要研究结果表明基因扩增,最初描述的实验研究实验室突变体的耐药,也可以遇到的利什曼虫菌株。
最经常放大基因MDR 1基因,发现放大与平均65%的菌株扩增6.98水平。MDR - 1基因已经在几个特征利什曼虫物种。这个基因最初发现被放大在突变体选择长春花碱(V圈)23]阻力和转染实验表明,这种基因的产物可以通过主动挤压产生耐药性的药物。实验研究表明,射流可以抑制维拉帕米(24]。这个基因高度同源的哺乳动物MDR基因参与抵抗的抗癌药物。放大的MDR 1我们观察到利什曼虫与那些报道恶性疟原虫在实验研究25]。电阻的恶性疟原虫奎宁与PfMDR1有关表达式,是直接相关的基因扩增,带来交叉耐药性其他药物(26]。MDR的选择由密集的扩增子可以解释,或者排斥,使用葡甲胺antimoniate治疗六世在苏丹和在法国在兽医实践。所以MDR的频率放大可能反映了对治疗压力利什曼虫。Katakura et al。27获得稳定转染子l . amazonensisMDR基因拷贝数超过500在选择压力下,对于PGP Guimond et al。10]表明,增加2.2倍发现通过微阵列技术测量作为一个污点南部增加12.7倍。我们的研究结果表明,高拷贝数的推定地抗性基因在自然条件也可以观察到;一个应变(S30)显示高拷贝数对MDR 1和PGP,分别,63 - 22倍。执行双重PCR保存结果明确相关的技术错误反应管中引入样本数量的差异。
PGP的发现放大5株平均8.42的拷贝数,类似于比率Guimond报道后金属耐药菌株的选择(10]。PGP属于ATP结合盒转运蛋白家族,多药耐药性蛋白(MRP)的亚科。PGP的承认metal-thiol轭合物和抵抗三价金属(如III或某人三世化合物)通过积累细胞内囊泡的轭合物接近鞭毛的口袋里(28]。的水平阻力授予这个基因转染的依赖利什曼虫物种,这表明其他因素一致抵抗。在另一项研究中,发现Haimeur PGP的生产过剩与谷胱甘肽1基因扩增[8]。我们的研究结果表明,这样一个伴随放大这些基因也发生在领域的菌株在3 5例的PGP放大。
Legare表明增加trypanothione合成一致的解毒减少锑化合物(29日]。GSH1重亚基编码的gamma-glutamylcysteine合酶(30.),一个酶参与trypanothione通路和Grondin等人表明GSH1过表达连续在金属耐药菌株基因扩增31日]。在压力下研究中,谷胱甘肽放大似乎是一个小事件和进一步的工作必须为测试超表达的假设没有基因扩增。
DHFR基因的扩增中只有五个法国l . infantum菌株。DHFR-TS是一个双功能酶,参与的叶酸合成的主要途径;重复的基因组区域首先甲氨蝶呤抗药突变体(32]。可以假设药物压力是最重要的在地中海地区,由于延长使用trimethoprime在兽医实践(33]。Guimond等人发现了一个7.1增加DHFR耐菌株基因扩增水平选择甲氨蝶呤(10]。我们这里显示,一些自然菌株呈现相同的放大级(平均= 10.6)。DHFR放大和突变也发现疟原虫在自然或实验药物压力下(34]。这些突变可以描述DHFR等位基因参与乙嘧啶阻力和执行基因研究关于耐药性的传播从亚洲到非洲35]。
放大PTR1基因出现罕见的天然菌株的集合。这一发现是一致的,在trypanosomatids antifolate化疗失败,这个基因的扩增的生理结果抑制DHFR [36]。
这些基因都被放大称为染色体外的元素。R地区DHFR, H地区PTR1和PGP被描述在选择抗甲氨蝶呤l . tarentolae(37),l .主要(38]。在目前的研究中,我们没有观察到这样的联系,甚至在F8病人,显示放大PGP的选择一个寄生虫。MDR基因编码由V圈或D圈,为他们的选择取决于所使用的药物。LD1地区是第一个染色体外的扩增子中描述利什曼虫并在大约15%的野生型菌株(39]。这些元素参与的可塑性利什曼虫基因组。
除了MDR 1,统计数据表明,基因扩增与无关利什曼虫物种以显著的方式。这可能是解释为相对低的菌株显示基因扩增研究样本,导致电力不足检测这样的协会。
我们的研究结果说明定量的相关性研究基因扩增可能参与的分子工具利什曼虫耐药性。放大基因的高频率和传播领域中菌株是至关重要的对于理解耐药性传播和治疗失败利什曼虫物种。然而,这些结果,从分析获得promastigote阶段,需要确认组织无鞭毛体和临床意义的数据授权评估在进一步的研究中,应该比较基因扩增锑治疗的临床结果。此外,其他机制可能参与锑抗性在自然条件,如可变基因表达或改变蛋白质的功能,还有待证明。
承认
本文由Publique内部资金援助,支持Hopitaux de马赛。