文摘
许多粪肠球菌菌株显示公差或抵抗许多抗生素,但不能指定基因造成的阻力。的抗多种抗菌素的粪大肠V583,完整的基因组序列是可用的,生存和生长在媒体含有相对高水平的氯霉素。没有特定的基因编码在V583氯霉素抗性已认可。我们使用微阵列来识别基因和机制背后的公差在V583氯霉素,相比之下的细胞治疗subinhibitory氯霉素和未经处理的浓度V583细胞。期间课程实验中,超过600个基因显著不同的转录。由于氯霉素影响细菌蛋白质合成,许多基因参与蛋白质合成,例如,核糖体蛋白基因被诱导。参与氨基酸生物合成的基因,例如,tRNA合成酶和能量代谢的基因表达下调,主要。在调节基因EF1732 EF1733,代码可能氯霉素运输车。流出的药物使用的细胞可能是机制V583克服氯霉素的效果。
1。介绍
氯霉素(Cm)一直作为广谱抗生素在人类和兽医自1950年代以来,但在人类使用氯霉素是现在相当有限1]。在动物中,氯霉素使用仅限于宠物和non-food-producing动物。氯霉素的结构相对比较简单,它是第一个化学合成抗生素市场上(1]。氯霉素在细菌抑制翻译,通过抑制肽基转移酶反应大亚基的核糖体。肽基转移酶活性的抑制作用是由绑定几个蛋白质在50年代核糖体亚基(2]。
大量的细菌耐药机制氯霉素在被描述,其中最常见的是通过氯霉素乙酰化酶失活的氯霉素转移酶(猫)1];氯霉素乙酰转移酶(猫)描述了在这两种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。猫的羟基化催化氯霉素,从而使抗生素无效(1]。氯霉素的失活也可以由异型生物质乙酰转移酶(1,3]。第三个氯霉素失活机制是由氯霉素磷酸转移酶(1]。几个例子的氯霉素抗性或对氯霉素敏感性降低由于射流泵(具体或耐多药转运蛋白)描述,主要是革兰氏阴性细菌(1]。基因编码猫和氯霉素射流泵由翻译衰减(4]。最后,氯霉素抗性可能是由于突变23 s rRNA,从而改变细胞中氯霉素的结合位点(1]。
在本文中,我们目前的转录粪肠球菌V583 (V583)用氯霉素治疗。Enterococci已知有固有的耐多种抗生素,而获得性耐药其他抗生素被描述(见例如,审查由弗朗茨et al。5])。这些天,粪大肠病原体被认为是一个臭名昭著的机会主义者,经常获得抗生素耐药性决定因素和潜在毒性的因素。V583抗多种抗菌素的隔离,但没有确定具体的氯霉素抗性基因的基因组序列。V583生存与氯霉素治疗,但是增长却降低了,这表明,氯霉素引起压力细胞。
我们使用DNA微阵列来获取一个概要文件的氯霉素治疗V583细胞转录事件,识别机制/耐氯霉素背后的基因。在这篇文章中,除了“传统”的分析微阵列图像,使用一个原型方法的自动化分析微阵列图像,减少人工干扰图像分析。DNA微阵列的使用监控转录在细菌中是非常有用的,因为它可能有助于识别特定以及宽容/压力适应的一般机制。它还将重要信息添加到越来越多的细菌基因组数据的行为。
2。材料和方法
2.1。菌株、生长条件和RNA隔离
粪大肠V583生长与GM17耗氧在烧瓶中(Difco)在一个旋转瓶(300 rpm)。确定水平的氯霉素文化中使用微阵列实验前,细胞生长在GM17中包含10个,7.5,5.0,2.5,0μ克/毫升氯霉素。增长是4小时监控。的转录分析(微阵列实验)V583细胞治疗2.5μ克/毫升氯霉素。
微阵列实验,培养在一夜之间被稀释50生长在GM17如上所述,大约1小时,OD600年~ 0.2。然后,文化被一分为二,氯霉素(σ)被添加到一个文化。氯霉素的最终浓度为2.5μ克/毫升。两种文化(GM17和GM17加氯霉素)被进一步孵化和5毫升样品每种文化都收集在0 (t0), 90 (t90), 180 (t180)分钟后加入氯霉素。OD600年所有样品的测定。细胞收获,RNA提取,测定完整性和集中的RNA进行如前所述[6]。
2.2。转录分析使用DNA微阵列
这项工作中所使用的芯片已经被Aakra前面描述的et al。6),互补脱氧核糖核酸的合成,荧光标记,杂交,进行了图像采集(如前所述6]。RNA提取独立于三个实验。至少五个复制杂交过程为每个时间点进行。微阵列实验dye-swap实验,避免偏差引入微分的互补的标签。
2.3。图像分析
分析了微阵列图像两次;GenePix Pro 6.0(见[7])和微阵列图像分析的原型程序(见[8,9])。
2.4。原型的开发项目进行分析和微阵列图像的质量评估
建立原型项目竞争使用DNA微阵列分析方法(8,9]。中央方面发展,这个项目是(1)现货分割,(2)基因表达强度建模和计算值,和(3)质量评估点的微阵列图像。
为每个点框(网格单元)的解决方案(1)包括二维高斯函数的估计,重新排列的像素到一维高斯和定义的序列点分割问题的解决方案(识别前景点的像素)通过最大化相关联的两个示例统计(8,9]。(2)使用的解决方案的重新排列顺序像素作为物流建模的基础和背景估计前的水平(Cy3 -和Cy5频道分别被认为是)。传统的计算相关log-ratios然后基于这些估计前——和背景水平。质量评价(3)是基于一组决策规则,涉及12个不同的质量参数中定义与估计高斯函数(即密切联系。、形状、大小和位置的点)和物流模型,即拟合曲线的特点和模型残差(8,9]。
2.5。下游的数据分析
下游分析是由LIMMA包(www.bioconductor.org)R计算环境(www.r-project.org)。预处理和标准化遵循一个标准程序使用方法所描述的史密斯和速度(10]。差异表达基因测试是在一个线性模型上下文被史密斯(11]。选择混合模式的方法来描述within-array变异之间复制(每个数组中的每个探针5复制),和一个经验贝叶斯滤波的gene-wise方差进行据史密斯et al。12]。对于每一个基因,值调整控制错误发现率,因此所有调整值显示为错误发现率(FDR-adjusted;通常被称为在文献中值)。
2.6。实时rt - pcr
来确认独立微分基因表达微阵列实验,观察到以下基因被选为分析实时定量逆转录聚合酶链反应(RTQ): EF0633 (tryS-1,编码tyrosyl-tRNA合成酶),EF2653 (Cro的编码转录监管机构/ CI家庭),和EF0105 (argF-1、编码鸟氨酸carbamoyltransferase)。EF1964 (gap-2,编码glyceraldehydes-3-phosphate脱氢酶),这是既定的,是用来正常化Taq人数据。RTQ分析运行如前所述,Aakra et al。6]。
2.7。微阵列加入数量
微阵列数据存入ArrayExpress数据库(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)系列加入数量(不可用)。
3所示。结果
3.1。的增长粪大肠V583氯霉素的存在
确定合适浓度的氯霉素转录分析实验,V583治疗各种浓度(2.5十国集团氯霉素的g / ml)。增长V583氯霉素的含量降低。90分钟后OD600年所有chloramphenicol-treated文化50%的OD600年未经处理的控制(图1)。微阵列实验,这是决定治疗V583细胞为2.5克/毫升氯霉素。转录分析实验使用微阵列,推荐使用抑制剂浓度低,因为更高的浓度可能诱发二次反应(13,14]。
3.2。的转录分析Chloramphenicol-Treated V583微阵列
随着时间的微阵列实验课程实验,细胞RNA提取样本,进一步收集杂交过程三次后增加氯霉素V583文化之一。未经处理的细胞被用作控制实验。细胞样本收集后立即添加氯霉素(t0),后90分钟(t90)和后180分钟(t180)。相应的互补脱氧核糖核酸样品为每个时间点是混合和杂化微阵列幻灯片。
微分转录的决心,“得分”为显著差异转录基因,与阈值。在现在的环境下,使用两种不同的方法的结果图像分析进行比较,需要一个一致的方法来确定每个基因是不同转录。当基因的转录是更高的氯霉素,基因表达调节(诱导)表示,基因表达和转录时低,是表示表达下调(压抑)。
3.3。微阵列图像的分析和质量评估
我们应用两种不同的方法来分析微阵列实验期间获取的图像:GenePix软件和一个原型程序。原型微阵列图像自动分析方法分析图像上的点,基于大量的质量参数,大大减少了人工干扰分析。大多数基因都得分显著差异表达使用GenePix也发现显著差异表达的原型程序,反之亦然;609个基因显著得分,或在一个或多个时间点表达下调数据基于GenePix和原型分析。其中,23个质粒编码。使用的程序和原型作为意义的阈值,694染色体(质粒)27日显著的基因得到了——或在一个或多个表达下调三个时间点。相反,基于GenePix数据,672(28质粒)得分为显著差异表达的基因。这些基因是得分显著,或只有一个表达下调的方法主要是代表在微阵列点信号强度较弱。的价值与这些基因的表达数据,对于大多数基因,接近意义阈值()。
我们决定继续的基因(609)得分显著差异表达的两个数据集。质粒基因的转录模式(pTEF1、pTEF2 pTEF3)处理在一个单独的部分(见下文)。
氯霉素治疗似乎有显著影响转录事件V583细胞,在大量的基因(609)在一个或多个时间点不同转录。301个基因表达下调,336个基因在调节在一个或多个时间点。共同的监管模式被认为;15基因转录有差异这三个时间点,当121个基因转录有差异在两个时间点。在t90差异转录基因的数量最高(t0)最低。微分转录可能是由于氯霉素治疗(1)和(2)增长率处理和未经处理的文化之间的差异。25我们发现基因转录水平的变化(向上和向下)期间。
在基因转录水平改变了,在一个或多个时间点,基因编码的蛋白质构成最大的集团,但是这些基因也构成最大的集团V583基因组。相对于基因编码的蛋白质的数量在V583基因(1/3),差异转录基因的数量(包括调节和表达下调)属于这个群体相当低(数据没有显示)。运输和绑定过程相关的基因也构成一大群之间的差异转录基因,但是这类表达下调基因的数量高于调节基因的数量:运输和结合蛋白基因编码组成的近12% V583基因表达下调基因的12%,和6%的调节基因。在调节基因,基因属于类别的蛋白质合成;嘌呤、嘧啶核苷和核苷酸;脂肪酸和磷脂代谢是丰富。中表达下调基因氨基酸生物合成基因,和能量代谢的基因。
正如上面提到的简要的,15个基因显示显著的表达在所有三个时间点检查(见表1)。大部分这些基因(12)是调节时间点。胱硫醚的beta-lyase基因(EF0290)在t0表达下调,在t180 t90和调节。chaperonin编码基因(EF2633 EF2634,groE操纵子)下调在t90 t0 t180和调节。该操纵子(groE)是唯一一个操纵子,基因调控期间在各方面课程。
V583基因组序列的一个重要特征是可能的大量移动遗传成分和体内获得的DNA(兆欧)[15]。这些基因构成有关V583基因组序列;54的兆欧基因(大约680染色体兆欧)基因转录有差异。例如,13个基因属于phage01(51基因总数。参见[16]chloramphenicol-treated名称)是调节的细胞。在这些endolysin-encoding基因(EF0355)。基因从phage05 phage06, phage07也不同转录;phage05基因表达下调,而phage06和phage07基因调节(除了EF2822 t0下调)。另一个endolysin-coding基因(EF2802)位于phage06地区,这种基因在调节phage06基因。在phage02 (EF1276-EF1293)基因转录有差异。phage02发现在许多不同的粪大肠压力(16- - - - - -18]。几个基因的致病性岛(PAI;参见[15,19])和地区组成vanB阻力因素(见[15)不同转录。PAI基因主要是压抑(7 9),而大多数的差异转录基因vanB11)地区诱导(8。在诱导vanB区域基因的基因编码组氨酸激酶VanSB及其同源反应调节器,VanRB。
是能更好地确定哪些基因更重要在V583氯霉素治疗的反应,我们对不同转录操纵子(见http://www.microbesonline.org/operons/gnc226185. html和[20.与微分转录])。在操纵子EF0205-EF0234,编码核糖体蛋白质(r-proteins), 8个基因调节。其他公认的操纵子编码核糖体蛋白质也调节;EF0915-EF0916, EF2715-EF2716。之间的差异转录基因编码r-proteins,只有一个(EF0820)是压抑的。
在包含v形atp酶基因的操纵子(EF1492-EF1500),四个基因调节。upregulation的基因操纵子也在研究Solheim et al。7在V583对牛胆汁和V583牛胆汁和SDS对待。另一个引起的操纵子是pyr操纵子(EF1712-EF1721),在V583诱导治疗牛胆汁一样(7]。大多数的基因操纵子EF2875-EF2885,编码基因参与脂肪酸生物合成,诱导(t90和t180)。EF1732和EF1733基因编码两个潜在转运蛋白的氯霉素V583细胞;这两个基因都强烈诱导V583细胞(t90)。
3.4。微分在聚四氟乙烯质粒基因的转录
的三个质粒V583基因组都是类似于著名的质粒(15]。抗生素耐药性的基因(例如,ermB)和一些假定的毒力因素(如聚合物质)中指定的基因质粒(15]。在chloramphenicol-treated V583细胞,只有少数的质粒编码基因转录有差异:11个基因(一,十下监管)从pTEF1,八个基因(3调节、5 / 5下调)从pTEF3 pTEF2和四个基因(一个表达下调,三个调节)不同转录。在不同转录(下调)耐药性质粒基因是基因编码或运输(EFA0010)。
4所示。讨论
在本文中,我们报告的转录模式粪大肠V583用氯霉素治疗。粪大肠V583能够生长在媒体含有氯霉素,但最优增长相比,然后慢慢地生长。没有特定的基因编码在V583氯霉素抗性已确定,并且能够生长在氯霉素的存在并不是因为23 s rRNA基因的突变。研究V583细胞的转录模式使用氯霉素治疗,每次课程实验选择,因为这些实验可能提供线索的细菌适应药物。我们使用两种不同的方法对图像分析转录水平,估计之前,结果是一致的。例如,大量的微分调节操纵子证实了一致性和微阵列实验的结果的可靠性。此外,诱导和压抑的基因相似,如预期的实验是这样的。转录模式也与其他类似的研究一致。例如,基因编码核糖体蛋白质调节,tRNA合成酶基因表达下调。脂肪酸生物合成的基因也诱导,以及v形atp酶的基因编码,也被认为在另一项研究的压力反应V583 [7]。v形atp酶的诱导的基因指出最优氧化还原条件的重要性强调(治疗)文化,讨论也由Solheim et al。7]。
官能团
基因组序列的注释基因植入官能团的分类,是有用的。最大的基因V583(和大多数其他基因组)基因编码的蛋白质和守恒假设的蛋白质。他们构成了超过1/3的基因组,并不奇怪,这些基因是主要的调控基因转录组配置文件(6,7,21,22]。假设的蛋白质的基因的重要性在许多论文讨论,看到例如[23- - - - - -25]。在我们的工作中,我们发现该基因编码的蛋白质实际上构成了一个小群调控基因比预期是基于纯粹的数量的这些基因在基因组序列。基因指定蛋白质参与蛋白质合成、脂肪酸、磷脂代谢和丰富的调控基因,而基因组序列的分数。虽然基因的功能类广泛的定义,这可能反映了基因和组响应中是特别重要的在V583氯霉素治疗。
嘧啶生物合成操纵子(pyr;EF1721-EF1712)是由转录衰减,pyrR(第一个基因操纵子EF1721)编码监管机构造成转录终止(26]。一些细菌必须能够执行嘧啶合成是致命的(27]。[氨基甲酰磷酸是嘧啶生物合成的前体和精氨酸生物合成。在chloramphenicol-treated V583细胞,pyr是调节(t180(主要),当指定精氨酸生物合成基因表达下调(t90和t180)。微分转录这些基因也被观察到在之前的论文(6,7]。自完成pyr操纵子中调节chloramphenicol-treated V583细胞,我们可以假设这是氯霉素添加相关的文化。
脂肪酸生物合成的基因(例如,EF0282-EF0284和EF2875-EF2885)诱导的基因中丰富(t180,主要)。其中一些基因诱导也与SDS V583细胞治疗7]。这些基因的感应点改变细胞膜的适应机制之一V583压力在时间的课程。膜的改变可能会改变细胞的运输能力,这可能部分解释了相对较少的诱导基因指定运输和结合蛋白(低分数的大小相比,这组基因)。
兆欧基因
相比以前公布的转录概况V583 [6,7),我们观察到大量V583体内获得的基因的表达。噬菌体基因的诱导(如基因编码endolysin)可能是一个迹象表明某种程度上chloramphenicol-treated裂解的细胞。
微分参与蛋白质合成的基因的转录
自rRNA氯霉素的移动目标,转录基因编码核糖体蛋白质的反应(r-proteins)的预期。事实上,一些基因编码r-proteins诱导,这些蛋白质的生产过剩的公差可以部分解释V583氯霉素。然而,许多r-proteins的合成是监管转化,因此微阵列分析不能反映实际的r-proteins氯霉素治疗细胞。
基因编码氨酰合成酶是表达下调(t90),而prolyl tRNA合成酶基因调节。氨酰合成酶基因的镇压也被认为在研究Ng et al。28),的转录模式链球菌引起的肺炎对待不同的翻译抑制剂。镇压的tRNA合成酶基因可以表达细胞的蛋白质合成率低。未经处理的细胞增长速度,需要的速度比未经处理的细胞合成蛋白质。tRNA合成酶基因的镇压,可能,然而,出现奇怪的,因为翻译设备的其他部分基因(基因编码核糖体蛋白质和伸长因素)引起的。抗终止调节表达最氨酰合成酶和其他酶参与氨基酸生物合成(审查Ryckelynck et al。29日])。
转录的基因药物运输
还没有发现氯霉素抗性基因在V583基因组中。V583基因组序列中,有几个公认的药物转运蛋白的基因编码。其中一个基因调控,(EFA0010)。EF1732 EF1733基因,然而,ABC转运蛋白编码的MDR的家庭,是调节(t90 (EF1732);所有时间点(EF1733))。这两个基因在V583诱导细胞与红霉素治疗,也(6),指出他们在V583作为潜在的重要的药物转运蛋白。因此,明显的目标为未来的详细的实验,如基因敲除研究。EF1732和EF1733广泛出现在相应的基因粪大肠(18),其功能在其他菌株比V583还应该进一步阐明。流出的氯霉素出现的机制,可能在V583带来阻力。后立即V583细胞用氯霉素治疗生长非常缓慢的药物,虽然增长率增加后(图1)。改变增长支持假说的流出氯霉素抗性机制。
氯霉素与23 s rRNA的氢键结合(2],或许,一个绑定和游离氯霉素在细胞之间的平衡。免费药分子的射流会导致释放绑定氯霉素的核糖体。
确认
这项工作是由挪威研究委员会资助。f . Nes。作者感谢Bjørn e . Kristiansen挪威微阵列财团,奥斯陆,打印芯片幻灯片,Hanne Sagsveen优秀技术援助。