文摘

我们研究了鼠感染肺结核气溶胶模型的适用性为研究新的抗细菌药物的药效学。通过气溶胶感染老鼠路线导致了可再生的过程结核分枝杆菌肺部的感染。肺部细菌负荷增加对数在前六周,此后,感染稳定未来12周。我们观察到宏观上可见肺肉芽肿有明显的抗酸的细菌和相关组织病理学。利福平(RIF)的剂量范围30 - 270毫克/公斤表现出明显剂量反应而异烟肼(INH)的剂量范围10到90毫克/公斤,乙胺丁醇(EMB) 100到1000毫克/公斤显示浅剂量响应。吡嗪酰胺(PZA)没有剂量响应之间的300和1000毫克/公斤剂量范围。固定在一个单独的时间杀死研究药物剂量(RIF 90毫克/公斤,异烟肼30毫克/公斤,EMB 300毫克/公斤,和PZA 300毫克/公斤)的杀菌作用四种药物治疗时间的延长和增加从两个星期缩短至四个星期。观察到感染和治疗结果在这只老鼠模型表明,它可以作为额外的药物相关功效模型开发了新型抗结核的化合物的发现和开发接口。

1。介绍

结核病仍然是全世界范围内导致死亡的主要原因(1)尽管前所未有的科学界的兴趣,以便更好地理解的病理学和发展新的介入治疗。在这个过程中,感染的动物模型是一个墙角石在理解复杂的病理学和免疫学的肺结核。豚鼠是第一个动物模型用于演示肺结核病1882年科赫(2]。从那时起,各种动物模型包括老鼠,兔子,和非人灵长类动物3- - - - - -5]研究了模拟结节的疾病和相关的宿主反应。然而,没有一个模型能够模拟复杂的人类病理学观察。

鼠标仍然是首选物种建模结核病感染以及筛选新型抗结核药物候选人由于实际原因(6,7]。几内亚猪、兔子、和非人灵长类动物更代表了人类疾病(4,5药物筛选),但构成挑战,因为大型复合需求和高昂的成本。

老鼠大大促进了建模的各种人类肺部细菌(8)、真菌(9和病毒感染10,11)由于越来越可用性的鼠免疫试剂。近年来,一些老鼠菌株,如刘易斯,美国棉花大鼠(12),糖尿病鼠菌株(13)已经成功地用于开发结核病的感染模型,特别是对调查病理学和免疫反应14,15]。然而,没有报告治疗结核病的感染大鼠模型。在这里,我们报告的应用纯种老鼠模型近似结核感染和一线药物的效果的控制感染。

2。材料和方法

2.1。菌株

结核分枝杆菌H37Rv写明ATCC 27294菌株对所有标准的抗细菌药物敏感,是用于所有动物感染实验。细菌培养准备如前所述[16]。

2.2。药品和试剂

利福平(RIF),异烟肼(INH)、吡嗪酰胺(PZA)、乙胺丁醇(EMB)和羧甲基纤维素(CMC)是美国从西格玛化工有限公司购买。

2.3。动物

动物伦理委员会制度(IAEC),在印度政府注册(注册。不。5/1999 / CPCSEA)批准所有动物实验和使用的协议。雄性Wistar鼠从拉吉生物技术购买浦那,印度。老鼠(7 - 8周大)每笼被随机分为三组,被允许前2周适应性实验使用。饲料和水随意。受感染的老鼠单独保存在通风笼(美国艾伦镇技术)在生物控制三级设施。

2.4。气溶胶感染

Wistar鼠通过呼吸道被感染途径获得低级杆菌肺部感染(100杆菌)使用修改后的麦迪逊气溶胶室(16]。感染细菌性肺负荷估计来确定合适的药物疗效的实验条件。感染后,动物研究的期间被安置在一个生物安全三级设施。通过使用微生物枚举作为因变量,每个治疗组需要的动物数量是低三个实验药物评估。分枝杆菌感染过程中监测的枚举集落形成单位(CFU)从肺切除1,2,3,4,6,8,13,postinfection 18周。

2.5。体内剂量反应研究

在另一项实验中,4周postinfection开始,每组3动物由口腔填喂法每天一次一线抗结核药物的剂量范围在0.25% (w / v)羧甲基纤维素悬浮剂。利福平(30 - 270毫克/公斤),异烟肼(10 - 90毫克/公斤)、吡嗪酰胺(300 - 1000毫克/公斤),和乙胺丁醇(100 - 1000毫克/公斤)管理两个或四个星期。开始和完成后24小时治疗,组的老鼠被暴露和肺部无菌移除。左肺叶加工CFU估计监测药物疗效而正确的叶在10%甲醛溶液固定组织病理学。左肺叶是均质在最后一卷3毫升用Teflon-Glass组织研磨机(惠顿Inc .)。悬挂在连续稀释10倍每个步骤,至少3稀释被镀到麦德布鲁克7 h11琼脂补充白蛋白葡萄糖10%过氧化氢酶(Difco实验室)和孵化C和5%股份有限公司₂为3周。

2.6。组织病理学

正确的肺叶的每只动物被组织病理学研究。他们收集的渗透和10%中性缓冲福尔马林,紧随其后的是标准的组织病理学处理技术(15使用不同等级的酒精。石蜡包埋组织切片5米厚度和沾Haematoxyline和伊红染色或Ziehl尼尔森染色酸事实杆菌使用快速染色工具包(正)。

2.7。统计分析

从电镀转换为获得的菌落计数(+ 1),=可行的结节杆菌总数计算在给定的样本。棱镜软件版本4 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,加利福尼亚州)被用于所有的计算。

3所示。结果

3.1。过程中结核分枝杆菌鼠肺感染

最初实验的重点是建立一个最佳的接种体大小需要持续实现低细菌数量(100 - 300 CFU)在肺部。结核分枝杆菌三种不同细菌的接种物的优点(10⁴CFU米),CFU米和10⁸CFU毫升¹)在25毫升aerosolised卷使用克里森喷雾器(BGI,沃尔瑟姆,MA)在固定的时间,和感染过程中监测到四个星期。所有三个接种物导致细菌进入肺部的安装方式(图存在剂量依赖的相关性1)。10的培养液⁶CFU毫升¹始终如一地交付杆菌/肺和进一步的实验被认为是最佳的。感染后的10的初始负载⁸CFU毫升¹陡峭的,而以下10吗⁴CFU毫升¹产生了不一致的在动物感染。因此这两种接种物没有优先进行进一步的实验。肺结核感染过程中增加对数前6周。增长率下降之后,净肺部细菌负荷增加仅仅是1CFU未来12周(图2)。

3.2。毛重和组织病理学研究

严重不同大小的老鼠发达限制肉芽肿(精确到3毫米直径)分布在肺表面通过6周,逐步增加到5毫米,提高外观(图2插图)。肉芽肿的组织病理学检查在不同的时间间隔在感染过程中显示强烈的杆状的负载和病理之间的联系。显微镜下,前两周没有肺组织病理学变化除了血管的轻度炎症反应。星期2,单核细胞浸润在降低培养液(肺泡空间分布稀疏CFU在高剂组()和广泛CFU毫升¹和10⁸CFU毫升¹)。通过4周,在肺肉芽肿病变被认为在所有组(图5),尽管这种焦点的数量的变化取决于最初的培养液。主要细胞类型巨噬细胞/组织细胞和泡沫细胞。淋巴细胞聚集主导,而一些epitheloid细胞和多核周围偶尔出现。一些退化中性粒细胞也见过。没有中央坏死区和外围纤维化。肉芽肿的一般体系结构类似,在老鼠。

3.3。杀菌活性的药物

四个一线抗结核药物的剂量反应测定大鼠感染模型在一个宽的浓度范围进行一次日常per-orally 2周。RIF展出最有力和一把锋利的杀菌活性存在剂量依赖的相关性在所有药物测试(图3)。RIF 30、90和270毫克/公斤剂量导致了1.5,2.1和2.7分别降低CFU肺部后两周的治疗。异烟肼是第二个最有效的药物为0.4,1.2和1.3分别降低CFU 10点30和90毫克/公斤。EMB是不如RIF和异烟肼但有效的表现出一个明确的剂量反应。的净杀菌作用EMB 100、300和1000毫克/公斤是0.1,0.2和0.9分别降低CFU。相比之下,PZA活动的0.6和0.7那么在300和1000毫克/公斤剂量减少。

在第二个实验中,我们比较的影响RIF 90毫克/公斤,异烟肼30毫克/公斤,EMB 300毫克/公斤,PZA 300毫克/公斤管理per-orally每天一次2周或4周。两个实验的效果是可再生的(表1);RIF、EMB PZA时表现出杀菌活性明显高于治疗的持续时间从2到4周,提高而异烟肼(图4)。

4所示。讨论

动物模型是药物发现项目不可分割的一部分。他们允许了解疾病过程和评估新的干预措施在动态系统提供体外药效和治疗之间的联系使用。

传统上,老鼠已选择的模型的早期临床试验药物候选抗结核的活动,因为他们相对容易处理,降低维护成本,需要少量的实验性药物研究药物动力学和药效学6,7,17]。相比之下,老鼠被认为是不适合实验肺结核因为他们指出耐结节细菌。无论是高剂量的结节杆菌给非肠道可能杀死也不产生坏死结节状的病灶和结核菌素的敏感性。

病理观察到老鼠后结核分枝杆菌感染并不完全反映了人类疾病。相比之下,更大的动物,如豚鼠,兔子,非人灵长类动物更好的近似人类肺结核(18- - - - - -21]。然而,明显限制药物筛选仍然更大的规模、物流和药物数量的要求。近年来,证据是可用的肺结核感染的老鼠有坏死病变和慢性肺部感染(13,14,22),更接近人类疾病中观察到的事件比在老鼠模型中。因此,老鼠可能会提供一个中间选择的代表比老鼠更组织病理学方面的人类疾病,然而,并非对物流提出更高要求和药物的物质。

我们报告一个纯种老鼠气溶胶感染肺结核模型适合调查抗结核的药物的药效学。三个关键原因促使我们探索大鼠感染模型如下。

(1)老鼠是被广泛接受的物种为研究药物动力学和毒性动力学在药物发现项目的临床前和发展阶段(15]。(2)近年来,有许多报告老鼠结核分枝杆菌结核感染模型研究免疫学和病理学(12- - - - - -15,19]。事实上的一份报告显示,肉芽肿结核分枝杆菌感染美国棉花大鼠(12)展览干酪的中央坏死类似于人类动物模型从而增加附加价值。(3)我们推断,如果响应结核分枝杆菌感染大鼠抗结核的治疗可再生产地建立整个PK, PD,毒理学调查发现和开发的接口可以做在同一物种。

我们有可重复实现慢性老鼠肺部感染类似报道美国棉花大鼠(12和刘易斯的老鼠14]。在我们的研究中,受感染的老鼠出现在18周的观察健康。气溶胶感染允许我们模仿门户入口的人类,导致炎性疾病导致肺肉芽肿。感染的两相的性质可能会提供一个机会来研究药物对积极影响复制杆菌(周1 - 6)或最低限度复制杆菌(7 ~ 18周)。

的组织病理学改变Wistar鼠在18周没有中央坏死类似于老鼠(7)和其他老鼠菌株如1型糖尿病大鼠(13和刘易斯的老鼠14]。相比之下,美国棉花大鼠(12]和F344 / N-rnu裸大鼠(22)已被证明展览中心坏死肉芽肿内显示变量不同鼠菌株免疫和病理结果。

我们的研究建立了四个一线抗结核药物的功效(RIF、异烟肼、PZA EMB)在纯种老鼠感染模型中。重大杀菌活动四个参考药物作用于不同的分子靶点无疑表明感染大鼠模型的适用性筛选的化合物与抗结核的活动。因此,纯种老鼠模型提供了一个重要的优势的小鼠模型,因为它提出了组织病理学变化更接近观察人类结核病,同时允许药物动力学的研究,药效学和安全性药理学在同一物种。这将提供一个更好的处理预测人类的剂量与适当的安全边际。

确认

作者真诚地承认Kaur Parvinder准备结核分枝杆菌文化用于所有动物感染和Vasan Sambandamurthy回顾这个手稿。第一和第二作者的贡献同样这个手稿。