文摘
支是一个挑剔的微生物引起生殖器和extragenital感染。我们开发了一个特定的实时PCR展品高灵敏度和低intrarun interrun可变性。当应用于临床样本,定量PCR可以证实的作用m . hominis在三个严重extragenital感染患者。
支挑剔的细菌,并没有发现经常使用无菌媒体(1]。缺乏细胞壁使这些生物自然抵抗内酰胺抗生素,而不是通过革兰氏染色法检测。m . hominis是公认的代理的生殖器感染的成年人以及新生儿感染的2,3]。此外,据报道,各种严重的extra-genital感染的病原体如脑脓肿、肺炎、纵隔炎、心包炎、心内膜炎、骨炎、关节炎、伤口感染、腹膜炎、肾盂肾炎免疫抑制和免疫活性的个人(4- - - - - -11]。以来最常用的抗生素在临床实践中并不活跃m . hominis这个挑剔的细菌感染的诊断是一个至关重要的问题,特别是对于extra-genital病例。
在这种背景下,我们开发了一个实时PCR检测分析m。然后,这个新的PCR应用于临床从extra-genital从患者获得的样本m . hominis感染。
正向引物美家(5-TTTGGTCAAGTCCTGCAACGA-3”、位置序列AF443616基因库2472 - 2493年),反向引物MhR (5”-CCCCACCTTCCTCCCAGTTA-3”AF443616位置2553 - 2572年),放大101 bp 16 s rRNA-encoding基因的一部分,和一个小沟粘合剂探针标记和5”维克(AF443616 TACTAACATTAAGTTGAGGACTCTA、位置2513 - 2537)选择使用底漆表达软件(应用生物系统公司,达姆施塔特,德国)。最后一个体积的反应进行了20l,包括0.2每个引物的米,0.2。M的调查,10l 2TaqMan普遍掌握混合(应用生物系统公司),和5l的DNA样本。循环条件是2分钟50°C和10分钟在95°C,紧随其后的是45的周期在95°C和1分钟15秒60°C。ABI棱镜7900仪器(应用生物系统公司)是用于PCR扩增和检测的产品。实时PCR的特异性高,增加了TaqMan探测器的使用。没有观察到当cross-amplification 5 ng的人类基因组DNA,真菌(白色念珠菌写明ATCC 10231)和15个不同菌株进行测试(肺炎支原体、Ureaplasma以及Ureaplasma体,加德纳菌属鞘突,乳酸菌sp。沙眼衣原体肺炎Chlamydophila,粪肠球菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌,葡萄球菌saprophyticus,酿脓链球菌,和链球菌agalactiae)。包含目标基因的质粒构建执行量化的步骤,如前所述[12]。
重复序列稀释10倍的质粒在十独立运行实验为了分析PCR的灵敏度和重现性结果。如图1(一)intrarun重现性非常好。正如所料,intrarun可变性在非常低的浓度稍高的目标DNA(图1(b))。interrun变异性很低,除了在低浓度的10质粒拷贝/ 5l(图1 (c))。因此,平均Ct值+ /标准偏差的(1.28%),(1.10%)和1000年(1.34%),100年,10 DNA复制/ 5l。实时PCR的灵敏度分析是10拷贝质粒DNA控制/反应混合物,即类似于light-cycler PCR已经报道Baczynska et al。14]。这种敏感度约10倍,比16 srrna广泛PCR et al。(由博斯哈德15]。当测试获得的基因组DNA在增长m . hominis在文化中,我们再次获得一个优秀的敏感性约1000 /毫升细菌。当连续稀释临床样本(腹股沟脓肿患者的1),PCR eubacterial略积极当实时特定支原体PCR阳性Ct为33.4(45副本5l的DNA)而eubacterial当实时特定PCR是负面的支原体PCR阳性Ct为36.3(6.5册5l (DNA)。
(一)
(b)
(c)
因为越来越多的证据支持的角色m . hominis作为一个新兴的extra-genital感染、实时PCR测试在34个临床样本来自15个病人患有各种extra-genital感染。这些样本包括生理上无菌胸膜液体,等网站percardial液、脑脊液和心脏瓣膜()和与口咽的样本可能被污染的植物(),也就是说,主要呼吸道样本()。从200年DNA提取l的样本使用MagNAPureLC自动化系统(罗氏)和DNA MagNAPureLC隔离设备1(罗氏)。DNA筛选了100年最后一卷l的洗脱缓冲工具包中提供的。负面提取控制(并行DNA自由水提取的标本)为每个提取运行测试。每个样本重复放大。抑制控制(标本上升1l包含200个质粒拷贝)和消极的PCR混合控制系统测试。所有样本调查临床怀疑,因为除了两个的存在m . hominisDNA已经被广泛16 srrna PCR直接进行标本(16]。都被新的PCR证实了积极很高的细菌负荷(表1)。DNA的m . hominis样品1中还发现了剩余的13个病人。
所有3阳性患者的DNAm . hominis中检测出3标本(表1)。此外,每个3例,至少一个积极分子的结果进一步证实了文化与商业媒体(支原体坚持、bioMerieux、法国)或在血琼脂(细菌和测序的薄层识别)(13]。由于16 s rRNA的高水平的保护,我们的实时PCR可能放大的任何成员m . hominis集团包括m . salivarium m . orale和m . arginii。所有病例摘要m . hominis美国这篇测序证实的16 s rRNA编码基因。这三个病例的临床表现是总结表1。
总之,我们开发了一种新的PCR,表现出高灵敏度,允许我们三extra-genital例诊断或确认m . hominis感染,这可能仍未被发现的由于考究这种细菌的增长。最近,Masalma et al .,使用克隆和/或焦磷酸测序方法,还发现了两个extragenitalm . hominis脑感染(4]。他们的策略的优点是广谱的方法,不仅限于支原体而我们的实时PCR的优点是简单,速度,降低污染的风险。
这个新的实时PCR代表一个有效的诊断工具m . hominis感染可能导致更好的患病率和致病性的定义m . hominis。此外,它可以帮助改善临床结果严重extra-genital感染的病人没有反应常用beta-lactam抗生素。
确认
g . Greub Leenards基金通过职业奖项名为“交易所Leenards倒拉新上的菜Academique en医学院倩碧洛桑”。本文作者感谢塔尔博士审查。a . Pascual和k Jaton贡献同样这项工作。