文摘
的端依赖启动子的前面rsbV基因的枯草芽孢杆菌是诱导5倍的反应(1)的4%乙醇,(2)碳饥饿,(3)磷饥饿。结合位点对全球碳和氮监管机构、CcpA TnrA,突变,他们损失的后果,CcpA或TnrA使用进行了研究rsbV-lacZ融合。这些反应被证明是依赖CcpA TnrA,他们假定的结合位点上游的启动子。感应响应葡萄糖限制在很大程度上是被CcpA损失或上游地区,而感应很大程度上是为了应对磷限制废除仅由上游突变。结果表明CcpA直接影响碳饥饿反应,蛋白质施加间接影响所有三个应力响应。DNA序列的完整性是非常重要的三种反应。
1。介绍
在革兰氏阳性细菌物种等芽孢杆菌,复杂的rsb操纵子编码应力σ因子,σB,它的许多调控蛋白(1,2]。该操纵子包括两个启动子,σ一个端依赖启动子的前面rsbR基因操纵子的开始,和一个σB端依赖启动子的前面rsbV基因,第五个基因在这个8-cistron操纵子(3]。σ的生化机制了解得B控制包括一个反σB一个anti-anti -σB和蛋白质磷酸化4- - - - - -6]。此外,感应的σB启动子部分调节适应热休克(盂),冷休克(4 - 12)、生理盐水(10%)冲击、乙醇(4 - 10%)冲击,和各种饥饿(碳、磷和氮)压力5,7]。一直认为ATP水平下降可能会触发σB激活(8]。的这一监管体系的元素被发现在一个广泛的细菌除了低和高G + C,革兰氏阳性细菌包括拟杆菌、蓝藻、变形菌门,deinococci [2]。
我们已经调查了依赖各种应激反应(乙醇压力和限制碳和磷),表明这些反应都依赖于校长carbon-limitation转录因子枯草芽孢杆菌,CcpA [9- - - - - -11),以及主要氮调节器TnrA [12]。然而,我们表明,点突变和缺失的上游地区rsbV子,在rsbU基因,主要是废除所有这些应激反应。因为这些研究进行的rsbV-lacZ系统集成融合记者amyE轨迹,我们可以得出这样的结论:RsbU函数是没有参与这些影响。我们的初步结果表明,CcpA和TnrA施加其影响(碳饥饿可能除外)通过二次效应。他们进一步表明,DNA构象的上游rsbV启动子的反应中起着至关重要的作用rsbV推广到多个压力。
2。材料和方法
2.1。菌株和质粒
菌株在表列出用于这项研究1。大肠杆菌DH5α一般使用克隆主机。的变换枯草芽孢杆菌是由一个方法(其它地方描述的那样13]。质粒pDG1661获得芽孢杆菌遗传学中心在俄亥俄州。启动子的rsbV由PCR使用铂可以放大DNA聚合酶(表达载体corp .)与引物rsbV1 (5-ataaagcttttctcggcatctcgcaggac-3)和rsbV2 (5-aaaggatcccaagcctgtaatgtcaaaca-3),消化欣dIII和Bam嗨,克隆到相应网站的质粒pDG1661 pDG构造-rsbV1。片段rsbV3放大通过PCR引物rsbV7 (5-tataagcttgaatgcagaacggaaaacgg-3)和rsbV2消化了欣dIII和Bam嗨,克隆到相应网站的质粒pDG1661 pDG构造-rsbV3。片段rsbV5放大通过PCR引物rsbV11 (5-tataagcttcttggagcgtcctgatctgc-3)和rsbV2消化了欣dIII和Bam嗨,克隆到相应网站的质粒pDG1661 pDG构造-rsbV5。启动子的ctc扩大了与引物PCR ctc1 (5-ttgaattctgaatattgtaggtaacatc-3)和ctc2 (5-ttaggatccatttttgccttcgtccctc-3),消化生态国际扶轮和Bam嗨,和质粒克隆到相应的网站pDG1661 pDG构造-ctc。
2.2。定点诱变
的萨尔我片段包含rsbV子,混乱关系(TnrA结合位点),和CRE pDG (CcpA绑定网站)-rsbV1人民被克隆到pUC19构造-rsbV1。举办的,rsbV1m1包含突变CRE网站的中央C改为由定点诱变人民的-rsbV1使用QuikChange定点诱变工具包(Stratagene corp .)与引物rsbV5 (5——gaatgcagaacggaaaaagctttcttggagcgtcctg-3)和rsbV6 (5-caggacgctccaagaaagctttttccgttctgcattc-3)。证实了这种突变序列。的生态国际扶轮和Bam人民的片段之中,你好rsbV1m1包含rsbV启动子和突变CRE克隆成pDG1661 pDG构造-rsbV1m1。
2.3。生长条件和酶化验
芽孢杆菌细胞生长在磅,葡萄糖限制媒介(GLM)和磷酸盐限制媒介(PLM) [14]。全球语言监测机构含有0.05%葡萄糖和KH的0.15毫米2阿宝4是用于PLM。但从0.18毫米的KH获得了类似的结果2阿宝4。环境压力是由添加乙醇的最终浓度4%(卷/期)在磅中等细胞呈指数级增长。为β牛乳糖化验,一夜之间文化生长在1毫升的相应的培养基稀释200倍到新鲜的媒介和生长在37°C用颤抖的在200 rpm。样本收集每小时测定光密度的600海里。β牛乳糖活动确定了如前所述[15]。
3所示。结果
3.1。紧张施工
图1显示了结构和突变引入为了研究乙醇压力、碳限制,磷限制的反应σB端依赖的启动子sigB(rsb操纵子。的rsb操纵子有stress-insensitiveσ一个启动子的前面rsbR基因,由上面的第一个箭头表示操纵子,一物σB启动子的前面rsbV基因,由第二个箭头表示在操纵子(3]。上游的σB启动子和rsbU结构基因是两个假定的转录因子结合网站,一个特定的TnrA CcpA(开放箭头)和一个特定的(所谓的副产物响应要素(CRE)(关闭箭头)见图1)[16]。一个lacZ融合了位置282年,在σB启动子。不同的菌株有(1)野生型监管区域(rsbV1),(2)和C一样一个点突变在CcpA绑定网站(rsbV1m1),(3)删除缺乏公认的TnrA绑定网站(rsbV3),(4)删除缺乏TnrA和CcpA绑定网站(rsbV5)(图1)。突变的守恒的C CRE预计将废除CcpA绑定(17]。
3.2。乙醇应激反应
研究乙醇应激反应的结果与这些结构提出了数字2(一个)- - - - - -2 (d)。添加4%的乙醇,σB野生型基因的启动子活性增加约5倍与早期的研究背景的协议(5,18]。如数据所示2(一个)和2 (b)CcpA或HprK的损失,需要降解物阻遏枯草芽孢杆菌,导致中度乙醇激活反应。TnrA的损失或TnrA和CcpA导致反应略低于当的ccpA基因被删除。
(一)
(b)
(c)
(d)
影响各种突变和乙醇应激反应的条件σB端依赖rsbV启动子与细胞在LB培养基呈指数级增长。(a) = 0时,乙醇添加到最后一卷的4%,导致4-5-fold增强启动子活动的野生型基因背景(rsbV1)(■)。突变(图1)降低基底以及诱导启动子活动。野生型(■);ccpA突变体( );hprK突变体();的rsbV1m1突变体(◆);rsbV3(缺乏TnrA结合位点)(▾)rsbV5(缺乏TnrA和CcpA结合位点)(▴)。(b) CcpA损失的影响(),TnrA (▴),或两个转录因子(◆)乙醇的应激反应σB端依赖的启动子rsb操纵子。(c)葡萄糖对乙醇的应激反应的影响rsbV启动子。实验是在LB培养基进行(封闭的符号)和没有(符号)开放1%葡萄糖。野生型(广场)ccpA突变体(圈)。(d)的反应σB端依赖ctc基因对乙醇的压力。一个lacZ融合的ctc基因,4%乙醇的反应是用野生型背景(■)ccpA突变背景(),rsbV1m1遗传背景(◆),rsbV5遗传背景(▴)。实验是在LB培养基在标准条件下进行的。添加乙醇(4%)。 |
图2(一个)表明,上游监管区域的损失包括TnrA网站(rsbV3),双方的损失TnrA和CcpA绑定网站(rsbV5)或点突变在CcpA绑定网站(rsbV1m1)导致更大量激活的损失。三个突变体构造显示类似的反应。这些结果显示,虽然CcpA和TnrA可能扮演监管角色,CcpA结合位点或修改的点突变的上游地区损失TnrA结合位点单独或连同CRE带来更加显著的效果。
然后,我们研究了葡萄糖对乙醇的影响响应(图2 (c)),在野生型(广场)和遗传背景ccpA突变背景(圈)。与葡萄糖(封闭的符号),乙醇反应是相同的,如果没有葡萄糖(开放符号)在实验误差。因此,我们得出结论(1)DNA序列的前面σB启动子是更重要的监管比CcpA的存在与否和/或TnrA,和(2),葡萄糖并不影响乙醇应激反应要么有或没有CcpA [19]。行动以来CcpA通常取决于葡萄糖的存在(20.),我们建议CcpA和TnrA施加间接影响激活的σB启动子在乙醇之外(见部分4)。甚至一个单核苷酸替换的CRE已经删除整个地区一样戏剧性的效果(但不能证明)表明,乙醇的CRE是重要的应激反应,尽管CcpA和葡萄糖。如果这个建议是正确的,然后要求TnrA结合位点的存在也可以推断(见部分4)。
图2 (d)显示了不同的突变对乙醇应激反应的影响σB端依赖ctc基因枯草芽孢杆菌。结构和插入amyE轨迹”一节中描述2”。试验在磅进行介质的4%的乙醇。跟着那些观察到的响应rsb操纵子。因此,ccpA突变适度的活动减少ctc子,相对于野生型,但rsbV1m1和rsbV5突变施加更严厉的效果。基于这些结果,我们建议观察应激反应的影响rsbV操纵子表达式是传播ctc基因,σB因此,速率限制的表达吗ctc基因。这些结果也证实的有效性数据呈现在图2(一个)。
3.3。碳排放限制的反应
观察到在乙醇的加入,葡萄糖限制导致的大幅增加rsbV在野生型基因启动子背景(图3)。响应的点突变或损失部分或大部分的上游地区rsbU基因是戏剧性的。基底活动仅略有下降的点突变,但饥饿诱导在很大程度上是废除。删除突变降低基底活动更多,但是在所有情况下,一个感应反应,虽然减少了,还观察到(图3(一个))。
图3 (b)显示TnrA损失的影响,CcpA,或者这两个因素。TnrA损失基本上是没有影响,但失去CcpA±TnrA导致过早感应随后戏剧性的镇压。当CcpA流失的后果的决定σB占有ctc基因(图3 (c)),戏剧性的感应观察葡萄糖饥饿是废除。相对的反应rsbV和ctc启动子是可比的。
3.4。磷限制的反应
磷限制同样造成实质性的感应rsbV启动子(图4(一))。突变的CRE或删除部分或大部分的上游地区大大降低这种反应。CcpA损失的影响和/或TnrA被证明是不那么引人注目的损失CcpA拥有比失去TnrA(图更大的影响4 (b))。进一步减少损失的表达式。关联与应对CcpA的损失最小rsbV启动子表达,诱导表达的ctc基因被删除的没有明显改变ccpA基因(图4 (c))。
4所示。讨论
在这个项目的开始,我们发现了两个转录因子结合位点的逆境应答rsbV启动子内rsbU结构基因。首先是一个典型的全球氮结合位点的监管机构枯草芽孢杆菌,TnrA,而第二个是一个典型的CRE网站通常结合全球碳监管机构枯草芽孢杆菌,CcpA。我们引入了一个虚弱的点突变的CRE和删除TnrA结合位点或TnrA和CcpA绑定网站(见图1)。令人惊讶的是,无论哪一类型的突变,改变这种上游地区基本上废除了应激反应(1)乙醇,(2)碳限制,和(3)磷限制。在所有情况下,反应降低到相似度,和所有三种类型的突变有类似,但不相同的效果。
有多种解释这些观察。例如,CRE和邻近地区可能绑定一个蛋白质或RNA,和绑定可能取决于上游DNA的二级结构。甚至细微变化引入的点突变的CRE可能取消激活交互。或者,上游地区可能本质上控制子活动对压力的反应信号传输一个信号通过启动子DNA螺旋。这可能影响绑定的RNA聚合酶或其他因素导致的应力响应。不过,另一个可能性是CRE和TnrA绑定网站是重要的压力感应,但他们不功能主要在这方面分别绑定CcpA TnrA。无论如何,我们的实验清楚地表明,广义的影响这些上游DNA的变化不是由CcpA和/或TnrA孤单。
我们相信,这些转录因子,CcpA TnrA,发挥他们的作用,一般来说,不那么引人注目的比上游的突变,通过间接手段。例如,对乙醇和磷限制压力只有适度依赖CcpA TnrA。进一步,尽管CcpA绑定到DNA通常依赖于外源性葡萄糖的存在产生的代谢物或另一个glycolytically代谢糖,葡萄糖的存在对乙醇应激反应(图上没有效果2 (c))。相比之下,碳饥饿的感应rsbV启动子是显著影响的损失CcpA尽管删除tnrA没有效果。自ccpA突变影响增长率和葡萄糖利用率,这是可能的,即使是戏剧化的效果CcpA可能是间接的。无论如何,其效果似乎并不由CRE中标识rsbU基因。
这里的研究报告清楚地表明的重要性rsbU地区上游的rsbV启动子在基底和诱导启动子活动。很明显,TnrA和CcpA影响这些应激反应。因此,现象学的定义。详细的分子机制,提供解释这里的观察报告,尚未确定。的功能为TnrA和CcpA假定的结合位点rsbU基因同样必须进一步调查。
确认
这项工作是由国家卫生研究院授予GM55434医学科学研究所。作者感谢苏珊·费舍尔应变SF416T,他们感谢玛丽•贝思希勒援助的准备手稿。