文摘

一个10 kb o抗原基因簇是测序的沙门氏菌血清无性系种群。血清达喀尔O28参考应变和从两个 。波莫纳血清组O28隔离。这两个 。波莫纳O抗原基因簇显示只有温和的身份 。达喀尔O28基因簇,表明O抗原寡糖可能包含一个或多个糖赋予O28抗原决定基,但可能是不同的。这些新奇的发现是绝对的正确解释的关键分子血清型检测目标基因的O抗原基因簇内沙门氏菌血清型和建议的O抗原基因簇的可能性沙门氏菌型也可能是异构的。

1。介绍

沙门氏菌O血清型利用抗体特定的糖脂多糖O抗原区分侧链型细菌。抗体,在高度吸收血清学分型试剂,经常意识到一个非常小的在O抗原表位低聚糖,也许只有一个糖或部分糖(1]。革兰氏阴性细菌的O抗原是一种高度变量,surface-exposed成分脂多糖的一个重要的角色有助于这些细菌的细胞表面抗原变异。它由重复3 - 6单糖单位,O抗原的变化由于单糖的组成差异联系单位和糖。O抗原之间的差异提供了结构基础上的沙门氏菌Kauffmann-White [1),大肠杆菌O抗原血清学分型方案(2]。目前有46个O抗原识别在2541型组成沙门氏菌(3)和174 O抗原的类型大肠杆菌(4]。

血清型目前提供其他类型的基线方法进行(5,6]。毒性和宿主范围沙门氏菌血清隔离是特定血清型(7,8];因此,准确的测定沙门氏菌血清型是目前重要的人类疾病监测和疫情检测(9)和控制生物的食物链(10]。此外,血清组Kauffmann-White方案定义的分类通常表明遗传相似度,表明血清型经常有系统发育意义(11]。

所需的复杂性、成本和时间使用自定义或商业传统的血清学分型抗血清使研究人员考虑发展其他分子手段(12]。因此有必要开发技术(13),允许快速和便宜的最常见的决心沙门氏菌血清型。这样的方法(14,15)可以被纳入易于使用的格式(8,13,16)将接受主要的实验室。

O抗原的合成所需的基因美国血清菌株之间在一个集群中galF和接地细菌染色体上基因(17]。蛋白质产物的基因在这些集群通常可以分为三组:(i)的合成所需的糖,(ii)的转让和修改那些参与单位,和(3)这些必要的聚合和运输的单位啊17]。而糖生物合成的基因已经被发现非常均匀美国血清压力,转移酶/ flippase和聚合基因编码的wzx和wzy基因显示大量的异构性。可以使用此异质性为基础发展的新型分子血清学分型方法(16]。

我们已经测序的O抗原基因簇年代。波莫纳O28隔离和年代。达喀尔O28参考应变。尽管这一事实年代。达喀尔和年代。波莫纳O血清型,相同的O抗原基因簇年代。达喀尔是截然不同的年代。波莫纳。这些结果表明,O抗原的低聚糖年代。波莫纳O28和年代。达喀尔O28,尽管他们包含至少一个共同的抗原决定基,可能在结构上不同。

2。材料和方法

2.1。沙门氏菌分离株

沙门氏菌血清无性系种群。血清血清型波莫纳(血清型281282y: 7;核磁测井07 - 0213)数量的应变采集世界动物卫生组织参考实验室实验室食源性沙门氏菌人畜共患病,圭尔夫,。的年代。波莫纳参考菌株s - 1467 (281282:y; 1 7)年代。达喀尔菌株s - 1097 (281,28岁3::1、6)来自参考应变收集国家微生物实验室主任(核磁测井),温尼伯,MB。菌株s - 1467最初是在1999年从巴斯德研究所获得s - 1097是一种文化类型菌株获得1972年Colindale从公共卫生实验室服务,英国(应变号码JT 987)。

2.2。放大的o抗原基因簇

o抗原基因簇之间的启动顺序(18),接地从隔离放大了07 - 0213 412年至482年长期使用引物PCR (19)和一个扩展远程dNTPack工具包(罗氏诊断,拉瓦尔、QC、加拿大)后生产的方法。DNA模板制备使用的协议20.]。DMSO溶液的用量在每个优化PCR反应(卷/期)的5%。92年扩增条件 ∘ C 2分钟;92年的10个周期 ∘ 65年10秒,C ∘ C 15秒,68 ∘ C 15分钟;92年20周期 ∘ 65年10秒,C ∘ C 15秒,68 ∘ C 15分钟+ 20秒添加到每个额外的周期;和最终扩展为68 ∘ C 7分钟。PCR扩增,扩增子可视化在1%琼脂糖(英杰公司加拿大,伯灵顿,加拿大)凝胶与溴化乙锭染色后。

2.3。克隆的o抗原基因簇DNA

从几个PCR扩增子反应是汇集和剪切喷雾器(表达载体)3分钟20 psi获得片段之间0.5和4 kb。汇集片段使用蒙太奇PCR离心过滤净化设备(美国微孔,Billerica的)和克隆到pCR4-TOPO向量使用威尼斯平底渔船TA克隆工具按照制造商的指示(表达载体)。转化株的大肠杆菌应变DH5 选择Luria-Bertani平皿上包含100 克毫升1氨苄青霉素与添加X-Gal-IPTG (40 克毫升1;USB公司,克利夫兰,哦,美国)。DNA从积极的(白色)分离克隆了沸腾的技术(21]。

2.4。DNA测序的o抗原集群

的沙门氏菌DNA插入被放大在PCR反应使用由于“快速上手”项目Taq DNA聚合酶工具包(罗氏诊断加拿大拉瓦尔QC)引物M13 ( 5 -GTAAAACGACGGCCAGT - 3 )和T7 ( 5 -GTAATACGACTCACTATAG - 3 )补充特定的质粒序列侧翼插入站点。放大条件94 ∘ C 5分钟,35 94年的周期 ∘ C 30秒,50 ∘ C 30秒,72 ∘ C为45秒,紧随其后的是最后一个扩展为72 ∘ C 5分钟。扩增子可视化在琼脂糖凝胶如上所述,纯化的DNA核心设施在全国微生物实验室使用Agencourt Ampure PCR净化系统(Agencourt生物科学公司,贝弗利,美国),并使用M13和T7引物测序。DNA测序是由DNA核心设施在全国微生物实验室使用大染料终结者3.1循环测序试剂盒(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)根据制造商的指示。DNA序列数据生成使用ABI 3100或3730 DNA分析仪(应用生物系统公司)。Lasergene DNASTAR软件(DNASTAR Inc .)、美国麦迪逊WI) Kodon(应用数学、奥斯汀、TX)和Psi-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)被用于编辑、组装和注释的DNA序列。

2.5。基因库提交

这个手稿的序列描述沉积与基因库加入数字EU805803 (年代。波莫纳NML 07 - 0213)和FJ467642 (年代.Dakar s - 1097)。

3所示。结果

长PCR扩增的DNA病毒年代。达喀尔使用启动和s - 1097接地引物产生11386个基点(表的产物1)。的年代。波莫纳O28隔离07 - 0213 O抗原基因簇长10125个基点,包含11个开放阅读框架(表2)。这个区域的序列参考应变年代。波莫纳隔离s - 1467也决心和发现相同的07 - 0213从核苷酸序列50 - 10010(数据没有显示)。所有集群O抗原orf低% G + C含量和显著的同源性基因从其他细菌(表1和2,图1)。

表1
假定的组成O抗原基因簇年代。达喀尔隔离s - 1097。
表2
假定的基因和蛋白质组成的O抗原集群年代。波莫纳隔离07 - 0213。
(一)
(一)
(b)
(b)
图1
比较的O抗原区域:一个。年代。达喀尔O28与年代。波莫纳O28和美国血清达喀尔M269血清型;B。大肠杆菌101 - 1和年代。波莫纳O28和大肠杆菌O114。的年代。波莫纳和年代。达喀尔o抗原簇DNA序列沉积与基因库(加入数字EU805803 FJ467642,职责)。的大肠杆菌O114 O抗原加入集群AY573377数量大肠杆菌101 - 1 O抗原簇序列数据大肠杆菌101 - 1 gcontig_1112603666495,加入NZ_AAMK02000002.1数量。

的基因顺序年代。达喀尔O28 O抗原基因簇是非常不同的年代。波莫纳O28(图1,比较表1和2)。前五个基因的年代。波莫纳O28集群是rmlB,rmlD,rmlA,orf2.9,rmlC(表2之前李报道),确认结果和里夫斯19)部分的O抗原基因簇的序列年代。达喀尔隔离。其中,只有rmlA和rmlB都出现在年代。波莫纳;orf2.9适度同源的吗amsE同族体的年代。波莫纳(图1)。的wcxM——基因的年代。达喀尔s - 1097是在相反的方向对其余的O抗原集群,暗示一个独立的起源。这个基因是同源的fdtC基因的s波莫纳应变07 - 0213(图1)。识别的年代。波莫纳rmlA和rmlB然而,基因是明确的rmlA只有温和的同源性rmlA来自其他的基因沙门氏菌和大肠杆菌。G + C含量的42.9%rmlB从年代。波莫纳O28隔离接近这个基因在其他的平均值沙门氏菌隔离(19]。另一方面,年代。波莫纳rmlA% G + C含量为37.4%,远低于其他沙门氏菌O抗原序列。

的年代。波莫纳O抗原基因簇显示类似的组织从两个类似的集群大肠杆菌菌株(图1)。的rmlA和rmlB在所有三个菌株基因显示重要的身份。虽然这两个fdtA和fdtC基因同样位于O抗原簇年代。波莫纳和大肠杆菌O114,只有fdtA基因/ FdtA蛋白表现出显著的序列标识(图1)。两个基因是缺席的大肠杆菌101 - 1。虽然fdtB基因的大肠杆菌菌株相似程度的身份与共享fdtB从年代。波莫纳,Fdt蛋白质大肠杆菌101 - 1有一个更高层次的身份的年代。波莫纳的蛋白质。所有剩余的基因年代。波莫纳没有与相应的身份大肠杆菌基因,虽然有高水平的翻译的身份蛋白质(图1)。

的wzx和wzy基因识别的基础上翻译蛋白质与其他基因的同源性(表1和2,图1)。翻译这些基因的蛋白质产物的拓扑是决心确保与拟议中的名称一致。Wzx的预测跨膜结构和Wzy确认使用TMHMM Server v . 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和HMMTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/)服务器wzx翻译产品12 membrane-spanning地区和预测wzy翻译产品有10。这两个wzx和wzy基因的年代。达喀尔O28独特和非常不同的wzx和wzy基因的年代。波莫纳;蛋白质显示只有28%的身份(图1)。的年代。波莫纳Wzx和Wzy蛋白质有很强的身份与他们的同系物大肠杆菌101 - 1与Wzx和Wzy降低身份大肠杆菌O114(表2,图1)。在这两种情况下没有身份在DNA水平,表明趋同进化的蛋白质没有之间转移的基因大肠杆菌应变和年代。波莫纳。

血清学分型的沙门氏菌和大肠杆菌压力是由细菌凝集化验的识别和血清型部分,国家微生物实验室,使用沙门氏菌和大肠杆菌特定的兔抗血清。这些抗血清准备,在必要时吸收,并受严格的质量控制由NML根据参考方法(1,3,24]。沙门氏菌O抗原测定滑动凝集,而沙门氏菌H抗原和大肠杆菌O和H抗原凝集测定管。在幻灯片凝集年代。达喀尔O28参考菌株s - 1097,年代。波莫纳O28 07 - 0213菌株,年代。波莫纳参考文化(s - 1467)都给了4 +反应测试时anti-O28抗血清。一个大肠杆菌O114参考文化200 (EC)测试相同的抗血清导致了负面反应。

4所示。讨论

的DNA序列年代。达喀尔O抗原基因簇是一致的O抗原已知结构的低聚糖(图2)。鼠李糖是产生的rmlA,B,C,D基因簇(17的O抗原低聚糖年代。达喀尔含有鼠李糖(图2)。一个假定的rhamnosyltransferase也是确定的年代。达喀尔O抗原基因簇(orf11在表1)。虽然rmlB和rmlA出现在两个年代。波莫纳和年代。他们最近在达喀尔同源蛋白质来自不同来源(比较表1和2),这表明他们可能已经从不同的来源获得。的年代。波莫纳O28 O抗原集群没有包含rmlC和rmlD生产鼠李糖(图所需的基因1、表2)。此外,没有其他的基因会是活跃在这6-deoxy-hexose[的合成17]。这个微分生产鼠李糖必须确认结构的研究年代。波莫纳O抗原低聚糖。如果这是真的,它可能导致O28抗原的已知的异质性。沙门氏菌血清组O28最初分为三个subfactors-O281,O282,O283都应该被赋予结构差异(22,25,26]。年代。达喀尔表达次级因素O281和O283,而次级因素O281和O282有限合伙人的存在吗年代。特拉维夫和年代。波莫纳。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
低聚糖结构已知的沙门氏菌和大肠杆菌O抗原:A。沙门氏菌达喀尔O28 O抗原结构(22)和B。大肠杆菌O114 O-specific多糖(23]。加:半乳糖,相关:葡萄糖,GalNAc: N-acetylgalactosamine, QuiNAc: N-acetylquinovosamine (N-acetyl-2-amino-2, 6-dideoxy葡萄糖);Rha:鼠李糖。

fdtA(dTDP-6-deoxy-3 4-keto-hexulose异构酶)fdtB(dTDP-6-deoxy-D-xylo-hex-3-ulose aminase)基因被确定的年代。波莫纳和年代。达喀尔。的相同器官fdtC(假定的乙酰基转移酶)基因被确定年代。波莫纳,和分析建议是一种WcxM-like蛋白。我们建议基因确实是fdtC基于两个证据:(1)fdtC基因出现在同一位置大肠杆菌O114 O抗原基因簇,(2)fdtA,fdtB,fdtC一起组成一个功能单元(17]。一个假定的基因(orf12在表2),也编码WcxM-like蛋白,被发现的年代。达喀尔O抗原基因簇。这种基因会出现的相同器官fdtC基因的年代。波莫纳和大肠杆菌O114。自年代。达喀尔fdtC同族体存在于相反的方向与其他基因的O抗原集群相比,它已经获得独立于这些其他的基因。其位置的基因簇的位置明显不同fdtC在年代。波莫纳(图1)。

的rmlA和rmlB前两个酶基因编码的鼠李糖生物合成途径沙门氏菌和大肠杆菌(17,19]。从glucose-1-phosphate开始,这两个基因产生dTDP-6-deoxy-D -xylo4-hexulose。这中间可以转换为3-acetamido-3 6-dideoxy-D-galactose的fdtA,fdtB,fdtC基因(17]。的fdtC基因的相同器官wxcM编码的双功能酶的基因中,蛋白质的氨基末端部分同源乙酰转移酶和羧基末端部分类似于异构酶负责异构化4-keto己糖,3-keto己糖。如果两个活动确实是功能性的年代。波莫纳FdtC蛋白质,这种蛋白质可以负责生产Quip3NAc糖(图2;(17])中年代。达喀尔O28 O抗原(22),进一步表明糖可能存在年代。波莫纳。另外,年代。波莫纳可能确实把3-amino-3 6-dideoxy-D-galactose到O抗原低聚糖。结构决定需要解决这个问题。大肠杆菌O114应变E2808包含在它的o抗原糖Quip3NAc密切相关,也就是说,3,6-dideoxy-3 - (N-acetyl-L-seryl) -aminoglucose [23]。这个糖的前体可能这些同源基因的产物年代。波莫纳O28基因,我们建议可能涉及3-amino-3, 6-dideoxy-D-galactose和/或Quip3NAc合成。

年代。达喀尔orf9(表2)推定地编码一种蛋白质同源性很低的糖基化酶2的家人,没有发现年代。波莫纳。这强烈表明,产生的低聚糖年代。达喀尔会不同,所产生的年代。波莫纳。产品的第四个开放阅读框(orf2.9)也是一个公认的糖基转移酶(19]。在一起,这些蛋白质可能会负责添加两个或两个以上的剩余的三糖年代。达喀尔O28 O抗原寡糖(图2)。年代。波莫纳orf注释在这里wbuM和amsE也有强大的同源蛋白质的糖基转移酶2的家庭,尽管这些转移酶的特定函数不能推断单从DNA序列(17]。没有明显的身份在DNA或蛋白质之间这些糖基转移酶的水平年代。达喀尔和年代。波莫纳,表明这两个隔离的O抗原寡糖可能包含进一步的差异。

指定的ORF编码的蛋白质wbuO没有已知的保守域,的功能大肠杆菌同族体尚未确定。另外两个同源染色体(ACK44395和ACD75797),它包含八个跨膜域,被指定为o抗原酰基转移酶。

总的来说,年代。波莫纳O28 O抗原基因簇表现出显著的基因保护秩序的O抗原基因簇大肠杆菌101 - 1和大肠杆菌O114: H32类型菌株G1088(图1,(27])。没有结构分析大肠杆菌101 - 1 O抗原多糖被发现。的大肠杆菌O114 o抗原寡糖(图2)由克分子数相等的数量的半乳糖、核糖N-acetylglucosamine,和3,6-dideoxy-3-aminoglucose [23]。这是符合一个角色守恒的wbuM,- n,- o基因转移的半乳糖和葡萄糖(或N-acetylglucosamine) o抗原低聚糖和独特的基因的作用大肠杆菌O114核糖转移。核糖因此无法预期的一部分年代。波莫纳O28 O抗原低聚糖。额外的基因(wbuL)中大肠杆菌下游的立即O114应变fdtC但没有基因年代。波莫纳。最后一个基因年代。波莫纳O抗原集群显示更高的同源性白平衡从大肠杆菌O117 [28比的)wbuP基因大肠杆菌O114。

的wbuL和wbuP基因的大肠杆菌O114都没有同族体的糖基转移酶年代。波莫纳O28;这两个基因可能会改变大肠杆菌O抗原结构的方式,要么不允许它被抗血清与认可沙门氏菌O28血清组或创建一个替代immunodominant抗原决定基。支持这一观点的同源性较低wzy基因年代。波莫纳O28与wzy基因大肠杆菌O114的事实年代。波莫纳wzx基因是最接近同源基因核废料旁边metallireducensGS-15。

的年代。波莫纳O抗原簇可能是组装使用wbuM,wbuN,wbuO基因,至少,从大肠杆菌O114和其他基因从各种不同的来源。大肠杆菌O103隔离H515b(基因库加入数字AY532664和EF027106)的O抗原基因簇的同系物年代。波莫纳O28rmlB,rmlA,fdtA(wbtA),fdtC(wbtB),fdtB(wbtC)基因在同一订单前wzx(29日]。大肠杆菌或类似的血清群O103 H515b应变大肠杆菌,也可以一直的前五个基因的来源年代。波莫纳O28 O抗原基因簇。

通过测序的提供的信息年代。波莫纳和年代。达喀尔o抗原基因簇将允许各种O28探针wzx和wzy基因被包括在DNA芯片的更新版本沙门氏菌血清学分型化验仪器,以及由其他格式(30.]。这将使准确的血清学分型更容易为初级实验室在卫生保健系统。

差异在O抗原基因的组织和内容,以及在wzx和wzy基因序列,表明O抗原的低聚糖年代。达喀尔和年代。波莫纳可能各有不同的化学结构,但意外地包含主要O28抗原决定基。这就需要确认结构研究超出了当前的调查范围。这种情况在其他血清组是否不清楚。很明显,分子血清学分型的开发方法和结果的解释这些方法需要从每个特征相关的基因沙门氏菌血清型。此外,本文提供的数据加强观察,两个分离血清组可能不相同,事实上,内容有相同的基因。解释型的身份及其与毒性的关系的意义和主机限制或适应变成更有问题。出于某些目的,它可能是更大的优势来确定genovar [11孤立的)。

确认

这个工作是通过加拿大卫生部资助生物技术(基因组)资金计划。作者承认的贡献Lorea贝克,凯瑟琳·鲍恩和Kristine克鲁兹在识别和血清型实验室,肠道疾病项目,细菌学和肠道疾病项目,核磁测井,PHAC,执行所有的血清学检测。他们要感谢Brynn Kaplen,金伯利Melnychuk艾丽卡兰德里,莎丽泰森,墨菲特拉维斯的DNA核心设施全国DNA测序和寡核苷酸合成微生物实验室。