文摘

细菌和古细菌有氧社区恢复从浅El-Djerid盐湖沉积物在突尼斯,及其盐度梯度分布。六个样品物理化学和微生物分析从6盐水湖的网站获得物理化学和微生物分析。所有样本研究被认为是高盐度与氯化钠浓度范围从150 - 260 g / L。一个特定的嗜盐微生物群落恢复从每个网站,和孤立的微生物进行鉴定通过表型和系统方法。只有一个极端嗜盐的生物领域古生菌网站4只隔绝,而生物域细菌从现存的5个采样恢复站点包含250 g / L氯化钠。域的成员细菌属于属Salicola、Pontibacillus Halomonas Marinococcus,Halobacillus,而唯一的域古生菌孤立的属于属Halorubrum。这项研究的结果讨论了微生物的生态意义上的分解有机物El-Djerid湖及其潜在的工业应用。

1。介绍

高盐环境中发现各种各样的水生和陆生生态系统。他们居住着halotolerant微生物还嗜盐的微生物从中度嗜盐菌之间的媒体含有较高的增长率0.5米和2.5米氯化钠极端嗜盐菌具有较高增长率在媒体包含超过2.5氯化钠(1]。需氧、厌氧和兼性厌氧微生物属于域古生菌和细菌从这些极端的生态系统恢复,他们参与总体有机质氧化(2- - - - - -6]。

温和派和极端嗜盐菌已经被孤立不仅从咸水环境生态系统(盐湖、海洋盐场和盐碱土)也从碱性生态系统(碱性湖泊)。研究最广泛的生态系统是大盐湖(美国犹他州),死海(以色列)的碱性卤水Wadi Natrun(埃及),和湖Magadi(肯尼亚)7- - - - - -9]。值得注意的是低分类生物多样性中观察到所有这些盐水环境(10,11),很可能由于高盐浓度测量在这些环境中。

适应高盐条件下,嗜盐微生物开发了各种生化策略,包括兼容溶质合成维持细胞结构和功能(12- - - - - -14]。这些溶质(例如,ectoine) +其他化合物(细菌视紫红质、胞外水解酶、生物表面活性剂)嗜盐微生物显然是工业生产的兴趣。除了这些metabolical和生理特性,嗜盐微生物扮演着重要角色在发酵鱼酱和转换和可耻的浪费和含盐废水中有机污染物15- - - - - -17]。

突尼斯南部功能众多的生态系统包括极端(咸水)环境中微生物多样性研究一直不佳。最大的盐湖El-Djerid Sebkha (5000 k )在突尼斯南部,是一个重要的盐的食物来源,但其微生物多样性还从未被研究过。鉴于其经济价值为该地区盐来源,我们进行了微生物调查来获得更好的知识这种极端生态系统中微生物多样性蓬勃发展。本研究的目的是化学分析的盐和盐水样品湖,隔离任何小说极端嗜盐的需氧或兼性厌氧微生物,并检查他们的表型特征和生理生化特征,以筛查代谢物的工业小说产生的利息嗜盐的分离。

2。材料和方法

2.1。样本集合

研究了菌株的隔绝水和沉积物El-Djerid Sebkha,浅湖位于突尼斯南部。根据原位物理化学条件和水平的废水污染物,Sebkha分为六个实验网站(图1)。2006年2月收集的样本。水和沉积物样品收集在不同深度的表面和(0.1,0.2,0.3米)在每个站点。所有样本被收集到无菌瓶和存储在冰盒在实验室。


图1
站点地图的El-Djerid湖(突尼斯)和采样点。
2.2。理化分析的样本

pH值、含水率和 , , , ,Cl- - - - - -盐和沉积物样品测量的内容根据标准方法Trussel et al。18]; 量化了滴定AgNO吗3, 量化了原子吸收分光光度法, 被火焰分光光度法量化,然后呢 量化了用EDTA配位滴定法。原位测量温度和pH值。

2.3。浓缩和隔离

浓缩的文化和隔离程序恢复需氧或兼性厌氧适度极端嗜盐的微生物进行中包含(每升):氯化钠,250克; 6 13 g; 7 ,20克;氯化钾,4 g; 2 ,1 g;NaBr, 0.5克; ,0.2克;酵母提取物、5克;胰蛋白胨,8 g;和葡萄糖,1 g。pH值调整到7.2,10 M氢氧化钠在高压灭菌法。浓缩的文化是亚文化在相同条件下多次。菌株生长在100毫升的介质在旋转瓶250毫升厄伦美厄烧瓶 在150 rpm风潮。整除(100 l) 稀释是镀在琼脂培养基。经过两个星期的孵化 ,有红色、橙红色,淡粉色,黄色,奶油,白,透明的殖民地。不同的殖民地了,多尝试几次获得纯粹的文化。微生物培养物被储存 在分离培养基补充50%甘油。

2.4。隔离的描述和识别

在130株孤立中,只有36显示不同的表型特征和系统发育签名(ARDRA 16 s rRNA基因序列)。这些被选中作进一步鉴定。隔离检查了殖民地和细胞形态和能动性。殖民形态描述了使用标准的微生物标准,特别强调色素沉着,直径,殖民高程,一致性和透明度19]。这些特征被描述为在最佳的培养温度、pH值和盐浓度。

对于生化测试,菌株生长在烧瓶,文化被孵化 。最佳的离子含量(每升:4 g的氯化钾,13克 6 啊,1克 2 啊,20克 7 、0.5克NaBr 0.2克 ,250克氯化钠)是用于所有生化测试媒体。氧化酶反应是执行根据科瓦奇(1956)(20.]。过氧化氢酶是由添加10卷 每个应变文化(18小时后孵化 )在固体培养基。白明胶酶, 牛乳糖、脲酶、吲哚生产,Voges-Proskauer测试是使用标准程序执行。其他表型特征确定使用API 20 e和API 20个ne套件(BioMerieux、马西l 'Etoile、法国)据洛根和伯克利(1984)(21]。

2.5。16 s rDNA的PCR扩增

使用向导细菌培养的DNA提取基因组DNA净化设备。16 s rRNA基因分离的菌株被加1放大 L细胞培养的thermocycler超小型电子管包含5 L (10×taq缓冲区,0.5 L每50 nM Fd1 Rd1引物5 L(25毫米 6 ,0.5 L 25毫米的核苷酸,0.5 L聚合酶(5 u ),和38 L无菌蒸馏水。通用引物Fd1和Rd1 (Fd1, -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - Rd1, -AAGGAGGTGATCCAGCC - )被用来获得的PCR产物~ 1.5 kb对应基地8 - 1542基于位置大肠杆菌16 s rRNA基因的编号(22]。样品将被放置在一个混合热反应堆thermocycler (BIOMetra Leusden,荷兰),变性1分钟 并受30周期为20秒 ,30秒 ,1分钟和30秒 。这是紧随其后的是最后一个伸长步骤5分钟 。PCR产物进行分析1% (w / v)琼脂糖凝胶并送往GATC测序(德国)。序列数据导入到BioEdit版本5.0.9序列编辑器(23];base-calling检查,一个连续的序列。完整的序列对齐使用RDP序列对准器程序(24]。共识序列手动调整,以符合16 s rRNA基因二级结构模型(22]。nonredundant爆炸搜索(25确定它的近亲。序列用于系统发育分析获得的RDP [24)和基因库数据库(26]。序列位置和对齐歧义消除,成对的进化距离计算使用的方法朱克斯和康托尔(1969)(27]。构建系统树图使用neighbour-joining方法(28]。树拓扑的信心决心使用100 -引导树(29日]。

2.6。限制性内切核酸酶来进行

酶消解时被孵化执行5 10 U L的PCR产物的酶和相应的酶缓冲。一点都持续了一个小时 为运算器我,有第三,Rsa即消化产品分析2% (w / v)琼脂糖凝胶。

3所示。结果

3.1。理化分析

温度采样地点 上午6点沉积物样品的物理化学特性如表所示1。沉积物样品的pH值在7.8和8.8之间。最高的水分含量值被发现S4样本。 内容是最高的S5样本, 内容是最高的S3样本,而 浓度是最高的S2(表样例1)。总盐成分较高的S4采样站点(335毫克/克)比其他采样站点(表1)。从研究湖泊沉积物样品都是由 和高水平的 。湖的总离子成分不同取决于取样面积。考虑到湖的矿物组成及其浓度 , , , , ,它显然应该居住着嗜盐的微生物,从而证明微生物调查。

表1
沉积物样品的物理化学特性。
3.2。微生物分析

几个稀释后接种在同一液体介质在有氧条件下,殖民地在琼脂培养基分离含银量为25%的氯化钠。130在有氧条件下极端嗜盐的菌株从六个样品。然而,表型特征的基础上(宏观和微观分析),生理分析(氯化钠、pH值),生化测试(20 e API, API 20 ne),和分子方法(PCR 16 s ARDRA(由三个酶消化运算器我,有三世和Rsa我),只有36个隔离选择和更详细的检查。这些菌株被发现通过分析基因序列编码16 s rRNA(图2)。最高的总细菌数( cfu / g)在有氧条件下被发现在S1采样站点。一些殖民地白色或透明而另一些显示各种色素,也就是说,红色、橙红色,明亮的粉红色,或yellowish-cream。奶油色的殖民地被发现是最众多的湖泊(表3)。


图2
16 s rRNA细菌域的基于基因的系统发育树,包括16 s rDNA序列来自El-Djerid湖沉积物样品。拓扑构建的系统树使用最大似然和maximum-parsimony算法被neighbour-joining类似树的构造分析。实心圆圈表示节点引导价值高于80%。
3.3。殖民地和细胞形态

占主导地位的细菌数量由运动型或不动的,革兰氏阳性微生物,其中大多数是孢子形成的细菌。大多数殖民地布朗琼脂培养基后,0.5 - 2毫米直径3周的潜伏期。这些殖民地是光滑、圆形、low-convex、透明或半透明的,和整个。菌株分离都是短,细胞长,和棒肿胀发生在单身,成对或短链。这些细胞被约0.5 - 2 -6.5米宽,2.5 米长。隔离是兼性厌氧或有氧和增长所需的酵母提取物。所有菌株的特点如表所示3。从这些样本范围从殖民地色素血红色的淡粉色。大多数殖民地直径1到2毫米,圆形,凸,闪闪发光,整个。最优增长发生在25% (w / v)生理盐水, ,pH值7.3,从而表明这些隔离应该被视为极端嗜盐的的定义根据Ventosa et al。1]。

3.4。生化试验

所选菌株生化测试媒体(表中进行了测试3)。ONPG和明胶水解被发现是负的色氨酸脱氨酶并没有生产,而赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶,和精氨酸dihydrolase被发现是积极的对于大多数隔离。大多数菌株降低硝酸盐亚硝酸盐(表3)。

3.5。系统发育分析

基于酶消化资料,16个代表36分离的细菌选择分类和系统发育研究。确定他们的系统发育地位,每个应变的16 s rRNA基因序列进行了分析,以及系统发育树构建了基于bp(图1280年明确2)。菌株的16 s rRNA基因序列已被存入数据库基因库

系统发育分析表明,多数菌株分离相关属Halomonas或Salicola,而其他菌株属中最密切相关的物种Halobacillus,Pontibacillus,和Marinococcus(图2)。所有菌株都超过97%的身份和自己最亲近的系统发育相对(表2),建议他们应该考虑在同一物种水平直到DNA / DNA杂交研究的结果可以验证他们的关系(工作)。只有一个领域的代表古生菌被确认为Halorubrumsp。,但这微生物没有进一步的特征。的16 s rRNA基因序列恢复16代表孤立的细菌组成9分类学的截然不同的微生物系统发育近亲的Halobacillus salinus,Pontibacillus chungwhensis,Marinococcus halophilus,Salicola marensis,美国萨利·,Halomonas elongata,h . sinaiensis,h·萨莱纳和h . koreensis。

表2
细菌和古菌的分布及分类特征孤立El-Djerid 6采样站点的湖。
表3
36个菌株的表型特征进行了研究。

4所示。讨论

最近几十年已经看到激增研究极端环境包括咸水环境的生态系统。分子和微生物研究显示适度的存在极端嗜盐的微生物在一个广泛的这些盐水环境(9,30.- - - - - -33]。El-Djerid盐湖是一个咸水环境在突尼斯南部,被认为是athalassohaline因为其盐成分来源于大陆的矿物的溶解34]。类似于其他咸水环境生态系统,湖水受到剧烈的物理化学条件包括高盐度、高辐射(紫外线)和强变化的温度和干燥使它相关的微生物学家的研究目标。据我们所知,这是第一个微生物研究极端嗜盐的需氧细菌从El-Djerid盐湖。

表1土壤理化分析的结果报告样本6个地点。样品不同于其他高盐环境的研究到目前为止。钠和钾浓度在6个地点高于在以色列的死海8]。与死海的水和美国大盐湖,是微酸性(pH值6 - 7),网站5和6的pH值是8.3和8.2,分别,因此应该被认为是弱碱性。湖泊Wadi Natrun和Magadi的pH值(肯尼亚)被认为是高碱性环境pH值(11)(35,36]。

在这项工作的过程中,我们分离130极端嗜盐的菌株,并进一步为36这些菌株表现出不同的色素与殖民地在琼脂板(表2)。系统发育分析表明,隔离都五个属的域的成员细菌,包括Salicola,Pontibacillus,Halomonas,Marinococcus,和Halobacillus。属的成员Salicola,Pontibacillus Marinococcus,和Halobacillus被认为是需氧微生物,而属的成员吗Halomonas被认为是兼性厌氧菌能够利用硝酸盐作为终端在厌氧条件下电子受体。这些微生物可能会使用各种有机化合物包括糖基板和应该考虑化能有机营养物。几乎所有这些隔离检测表面的沉积物在第一个厘米(0.1 - -0.2米)的每一个生活小区。Halomonas物种分布在所有5个站点研究和代表的主要菌株分离,尤其是在站点1。这个属的成员一起的属Salicola,Pontibacillus,Marinococcus,Halobacillus也被其他盐水环境隔绝,包括athalassohaline和thalassohaline湖泊和海洋水域(37- - - - - -40]。应该强调,在嗜盐的微生物分离,只有一个,这源于网站4,属于域古生菌(数据没有显示)。然而,有限的嗜盐的archaeons El-Djerid湖泊中发现可能是由于使用的培养基,这可能有利于细菌生长,因此不能反映其真实分布在湖内。所有被发现的菌株为革兰氏阳性棒生产赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶,精氨酸dihydrolase。一些隔离能减少硝酸盐,亚硝酸盐,表明它们可能参与全球氮循环中的湖。因为所有的隔离能够生长最佳的25%氯化钠,他们应该考虑极端嗜盐的41]生态意义,因此关于生物地球化学最盐水El-Djedid湖的部分。令人惊讶的是,尽管网站5合适的物理化学条件允许微生物,没有隔离恢复。

广泛的研究在不同的栖息地在西班牙和摩洛哥咸水环境,集中在筛选生成新的胞外——(EPS)的细菌通常可以导致几株隔绝盐碱土壤和描述为新物种属于属Halomonas(42- - - - - -46]。类似于观察报道,少数这些孤立的微生物被确定为属的成员Pontibacillus,Marinococcus,和Halobacillus。其他需氧或兼性厌氧,中度嗜盐的细菌在属内分类相关的订单Bacillales(47]。凸显了这种潜在的工业用微生物(生产兼容的溶质、生物聚合物和生物修复过程)和详细审查1,48,49),促使我们屏幕的嗜盐菌分子工业利益(工作)。

最后,极端嗜盐的分离株的代谢特征的El-Djerid盐湖表示,这些隔离能够氧化有机聚合物Sebkha和应参与居民有机质的矿化,类似于其他咸水环境生态系统37]。研究这些细菌应该重新调查构成halostable酶(表的来源3),提供了潜在的应用在各种pharmacochemical行业(50,51]。

确认

作者感谢Mhamed本•阿比德(Sidi Thabet极technologique,突尼斯)技术援助和帮助理化分析。他们感谢法国大学合作项目和突尼斯部科学,技术和发展为a海迪提供金融支持。