文摘
最低抑制浓度(MIC) 13抗菌药物72年汤采用微量测定空肠弯曲杆菌菌株的牲畜。23(31.9%)隔离完全敏感;隔离都容易红霉素、氯霉素、链霉素、庆大霉素、磺胺甲恶唑、卡那霉素和meropenem,除了一个。耐喹诺酮类最高(52.8%),达到相似的价值观在家禽、奶牛、羊,但低肉牛。耐四环素(48.6%)主要是奶牛和有关家禽-lactams (26.4%)。多药耐药性主要是奶牛(28.6%)和家禽中发现(21.0%),而牛肉最高比例的完全隔离。两个实时PCR分析检测中喹诺酮(C257T点突变相关gyr基因)和大环内酯物(A2075G 23 s rRNA基因)的电阻对这些菌株开发和验证。进一步组88例孤立的分析实时PCR证实缺乏大环内酯物的电阻,并演示了测定的重现性和加工性。
1。介绍
弯曲杆菌肠道的无症状地存在广泛的哺乳动物和鸟类,包括国内农场动物,构成人类感染的潜在来源,通过污染的食物和水。的发病率空肠弯曲杆菌增加了在过去十年,今天是细菌性肠炎的主要原因在大多数发达国家1,2]。虽然大多数的弯曲杆菌感染是自限性的,复杂的情况下可能保证抗菌治疗。药敏数据显示fluoroquinolone-resistant的数量的增加,程度较轻,macrolide-resistant弯曲杆菌菌株引起人类感染。阻力问题在人类医学主要是与人类滥用抗菌药物,但有越来越多的证据,来自抗菌素的使用抗菌素耐药性在食用动物可能复杂的人类感染的治疗3,4]。抗菌素治疗或预防性使用在畜牧业也可以施加选择压力感染食用动物的细菌,达到人类通过食品(5]。当地和国际委员会强调了需要更好地控制抗生素的使用在人类医学和兽医管理(2]。从这个意义上讲,系统监测抗菌素耐药性的发生c .空肠来自动物可以作为一个指标的选择压力这些细菌正在和帮助在抗性发展的早期检测。
患病率研究最近在巴斯克地区(西班牙北部)确定绵羊的28.3%(34/120)和18.0%(37/206)的牛农场阳性c .空肠(6),和更高的值(38.2%,13/34)在自由放养的家禽农场(7]。人类的高发病率弯曲杆菌巴斯克地区感染2006年(每100000人口114例)和相对较高的患病率在初级生产单位的食源性病原体促使我们决定选择的抗菌素耐药性资料c .空肠孤立的从动物粪便在巴斯克地区两年(6,7]。
2。材料和方法
2.1。选择隔离
c .空肠选择隔离的患病率研究嗜热弯曲杆菌在牲畜在巴斯克地区(西班牙北部)2003年10月至2005年5月(6,7]。为了避免偏见,隔离的基础上选择隔离源(主机、农场和群)。因此,72年的分离分析汤采用包括19个隔离来自12个家禽农场(18群),25从羊乳品农场(21),28隔离从牛(14肉牛和奶牛农场11日)。当隔离进行临床流行病学相关,也就是说,来自同一群/群,以前佛罗里达州PCR-RFLP,但是脉冲场凝胶电泳的出现输入数据(6,7)被认为是选择基因无关的菌株。因此,72年的隔离可以歧视为50但是脉冲场凝胶电泳的出现和28佛罗里达州PCR-RFLP类型。除了从肉牛隔离,一些额外的88隔离分析实时PCR在某种方式与72年的初始隔离(与动物在同一群/群),因此不习惯估计患病率的阻力。
c .空肠从CAMPYNET收集菌株(应变cnet - 015容易大环内酯类和喹诺酮类;应变cnet - 077耐喹诺酮类)弯曲杆菌杆菌菌株0402587(对大环内酯类耐药)被用作SNP检测控制实时PCR。
2.2。汤采用测试
最低抑制浓度(MIC)测定72株孤立的家禽(19),乳制品羊(25)、牛(28)汤采用使用专门设计的易感性板(Sensititre,长途跋涉诊断系统)包含系列双倍稀释13抗菌药物(表1)。c .空肠接种物的麦克风准备一夜之间成长在哥伦比亚琼脂microaerobic大气中(10%孵化有限公司2,5%的人啊2,85% N2)°C,悬挂在5毫升Sensititre标准化肉汤(浊度相当于0.5麦克法兰标准)。一百毫升的悬架被转移到11毫升cation-adjusted Mueller-Hinton补充细胞溶解的马血,5%和100被用于接种96孔板给最终的浓度105cfu /毫升。microaerobic孵化后24小时°C,生长在每个与积极的控制(没有抗菌药物)和麦克风记录的最低浓度的抗菌完全抑制增长,除了磺胺甲恶唑,麦克风将最低浓度,抑制80%的增长。结果解释使用流行病学截止值基于麦克风的野生型易感人群的分布由欧洲委员会药敏测试(EUCAST,http://www.eucast.org),除了卡那霉素、meropenem和磺胺甲恶唑,CLSI断点之间敏感和中间为肠杆菌科菌株使用(8表所示)1。
2.3。通过实时PCR SNP歧视
两个TaqMan实时PCR检测是检测中喹诺酮(C257T点突变相关gyr一个基因,用力推- 86 ile)和大环内酯物(23 s rRNA的A2075G突变基因)的阻力。不同的小树林绑定(MGB)和锁核酸(放大器)探针进行测试,提供最佳组合不匹配歧视(基于最大和最小净荧光差异荧光信号和指数增长的开始阶段的反应)。十每个引物的反应包括900海里,100 - 200 nM的调查(表2),1TaqMan普遍掌握混合(应用生物系统公司)和Ampli-Taq黄金DNA聚合酶和5 ng模板DNA。ABI棱镜上运行7500序列PCR反应检测系统(应用生物系统公司)使用以下程序:10分钟在95°C,和40个周期95°C的15秒和1分钟60°C。SNP歧视,实时PCR最初是在72年分离的表型分析,然后使用遗传型的描述一组进一步的88隔离,加起来总共有160隔离分布如下:36家禽隔离来自13个农场(21群),44个绵羊的隔离从35农场,和80头牛隔离来自38个农场。
2.4。统计分析
主机物种之间的电阻/频率磁化率进行比较进行了使用Fisher精确检验,和定量MIC值转换为基地2对数减少可变性和最后的单位有一个双重的量表,然后提交给方差分析和比较析因设计的最小二乘方法对抗生素使用的漠视,过程和主机物种SAS统计软件包版本8.0(美国SAS研究所)。P值小于。05were considered significant.
3所示。结果
分布中等收入国家的72人c .空肠压力分析汤采用如表所示1。23(31.9%)隔离容易13抗菌药物。此外,所有隔离都容易红霉素(麦克风不高于0.5 mg / L),氯霉素、链霉素、庆大霉素、磺胺甲恶唑,meropenem,他们中的大多数(83.3%)和麦克风对卡那霉素的2 - 4 mg / L值,只有一个从抗奶牛隔离。耐喹诺酮类和四环素是最常见的特征。因此,38个分离株(52.8%)耐环丙沙星和萘啶酸,而其余34(47.2%)容易(MIC分别为0.25和8)。耐四环素为35(48.6%)隔离观察,麦克风16 mg / L 30人。除了一个隔离的耐四环素也对强力霉素,一个例外是一个绵羊的孤立的MIC值8 0.5四环素和强力霉素。19(26.4%)隔离是耐氨苄西林和阿莫西林。耐多药耐药性定义为三个或更多的类抗菌药物,出现在10c .空肠隔离(表3),主要是有关奶牛(28.6%),紧随其后的是家禽(21.0%)。另一个23隔离两类抗生素有耐药性,其中大部分是喹诺酮类和四环素。
有趣的是,整个电阻低患病率发现隔离从肉牛羊相比,奶牛和家禽。因此,牛肉是宿主物种比例最高的所有13个测试隔离敏感抗菌药物(50.0%),而羊最低(24.0%)(表3)。隔离的数量太小,提供任何测试表型统计解决当比较主机物种之间的电阻/频率磁化率。然而,比较孤立的MIC值表现出不同的分布从不同的宿主物种(图1)。方差分析和比较的对数转换的意思是麦克风对喹诺酮类的值检测到显著降低值c .空肠从牛肉相比,所有其他三个主机物种(),彼此没有差别(图1(一))。同样,对四环素和价值观-lactams也不同物种之间(数据1 (b)和1 (c))。
(一)
(b)
(c)
由于氟喹诺酮类原料药和大环内酯类药物治疗的首选弯曲杆菌感染,两个实时PCR检测是快速确定遗传因素相关的分布来抵抗这些抗菌素:点突变gyrGyrA亚基的基因编码相关的DNA促旋酶(C257T喹诺酮阻力gyr一个基因,用力推域V - 86 ile)和23 s rRNA基因的大环内酯类(A2075G突变)产生的阻力。SNP歧视,实时PCR最初是在72年完成c .空肠由汤采用菌株表型分析。与表型结果相比,实时PCR检测gyr一个基因核苷酸点突变的菌株鉴定为耐环丙沙星和萘啶酸汤采用,但没有一个敏感的人。也完全同意表型抗菌药物敏感性测试,没有一株在23 s rRNA A2075G突变基因对大环内酯类产生了耐药性,通过实时PCR如图所示。汤采用之间一旦建立了100%的一致性和实时PCR, 88年进一步设置隔离然后遗传型的实时PCR分析。再一次,所有人都容易观察大环内酯类,但耐喹诺酮类。总体而言,89年的160例孤立的quinolone-resistant突变gyr一个基因,类似的分配汤采用观察到不同的主机。比较电阻/频率对喹诺酮类药物的敏感性由不同主机之间的实时PCR显示显著降低电阻率比其他物种(牛肉)。
4所示。讨论
使用不同的药敏试验方法,抗菌面板和断点阻碍抗菌素耐药性之间分布数据的比较研究。琼脂稀释法最常推荐弯曲杆菌spp。(CLSI),但它是劳动密集型,难以在常规实验室执行。汤采用是一个快速和容易执行方法,产量可再生的麦克风的结果c .空肠(9,10),这是商用,标准化方法CLSI批准于2006年(11]。抗菌素和稀释范围研究中使用此处包含这些定义为欧盟最低要求(四环素,红霉素,环丙沙星,庆大霉素及链霉素)和额外的建议(氨苄西林,阿莫西林和萘啶酸)(12),连同其他常用在临床实践中或在动物产品或其衍生品等(表1)。由于本研究的目的是为抗菌素耐药性监测和监控检测微生物耐药性的发展,麦克风流行病学截止值而不是临床断点被使用,这在某些情况下导致更高比例的隔离归类为耐药。与2006年相比欧洲共同体趋势报告和人畜共患代理和抗菌素耐药性的来源2)使用相同的否决,我们的结果显示一个高比例的家禽菌株耐ciprofloxacine,高于大多数国家报告的估计。耐四环素是几个成员国范围内估计。这些,连同红霉素的缺席,链霉素。和庆大霉素抵抗代表荷兰或者德国报告的情况类似,但西班牙明显不同,报告更高的阻力水平,所有这些抗菌素。同样在肉鸡,从1997年到1998年进行的一项调查显示在屠宰场在附近地区在西班牙(拉里奥哈省)磁盘使用琼脂扩散13),大约有99%的c .空肠隔离是氟喹诺酮类耐药;耐庆大霉素也高于目前的研究,但对四环素和氨苄青霉素可比。家禽品种分析研究在此被孤立的从农场自由放养的鸡7]很少使用抗生素和完全局限于治疗治疗病变的动物,而在上述研究菌株起源于肉鸡。尽管研究的结果比较的药敏模式弯曲杆菌从家禽生长在不同的生产系统(常规饲养与自由放养的鸡)有些不确定,它似乎,氟喹诺酮类耐药性更频繁地报道在隔离从传统饲养家禽14]。然而,最近的研究表明,fluoroquinolone-resistant弯曲杆菌,一旦进化,可能继续坚持鸡群无论使用氟喹诺酮类原料药。罗等。15)检查的效果resistance-conferring C257T突变gyr一个基因fluoroquinolone-resistant健身c .空肠在鸡。他们的研究结果表明增强体内fluoroquinolone-resistant健身c .空肠鸡在没有抗生素选择压力的情况下,建议fluoroquinolone-resistant隔离可以坚持鸡水库即使没有氟喹诺酮类抗菌素的使用。流行病学研究也显示fluoroquinolone-resistant的持久性c .空肠在鸡群停止田间使用氟喹诺酮类(16]。在这项研究中,所有的fluoroquinolone-resistant隔离的C257T突变gyr一个基因。
在奶牛,抵抗高四环素其次是氟喹诺酮类原料药、类似的模式来发现Englen et al。17]在美国奶牛尽管差异所使用的方法和断点。与我们的结果相反,同一作者(18)报告了类似的饲养场的四环素抗性水平牛。在欧洲,各国抵抗是高度可变的(19,20.),与四环素或喹诺酮类抗菌素对阻力较高c .空肠孤立的从肉牛。大环内酯物抵抗,报道没有在这项研究中,尽管在美国和欧洲在低水平(17- - - - - -19]。尽管盛行的c .空肠在羊,很少有调查在绵羊的抗菌素耐药性进行隔离和可比数据几乎没有可用的。Zweifel et al。21)发现非常低的电阻率在瑞士绵羊的弯曲杆菌使用磁盘扩散和NCCLS标准。在目前的研究中,随着喹诺酮类,四环素阻力也很高。有趣的是,最近的一项研究报告tetracycline-resistant的出现c .空肠与暴发相关的克隆绵羊的堕胎在美国(22]。在我们的地区,弯曲杆菌感染并不在绵羊的流产的主要原因(23]。
发达gyr和23 s rRNA基因SNP检测化验通过实时PCR可以检测到正确的基因型在所有情况下提供一个快速和可再生的筛选耐喹诺酮、大环内酯物检测的方法,这使得分析一组更大的压力。其他分子方法通常用于检测在86密码子点突变gyr基因不匹配放大突变分析PCR (MAMA-PCR) [24),单链构象多态性分析(25),后者有检测突变在邻近位置的优势,但都难以标准化、自动化。实时PCR也被使用,使用TaqMan探测器(26)或通过熔融峰分析(27),也用于检测A2075G 23 s rRNA相关基因的突变大环内酯物抵抗弯曲杆菌spp。28]。本文提供的实时PCR的设计gyr和23 s rRNA基因SNP检测利用探针的修改提供增加热稳定性允许短探针被使用,因此,赋予增加sequence-specificity相比普通DNA探针,也就是说,TaqMan与MGB探针结合的配体结束和LNA核苷酸探针在不同的位置。这个特性允许我们设计探针,避免多态网站所描述的威尔逊el al。26在第三的位置gyr调查,从而获得更好的等位基因歧视。同样重要的是其他可能的突变序列内认可的探针的描述gyr一个基因(A256G、萘啶酸阻力有关,但不耐环丙沙星)和23 s rRNA基因(A2058C,更高的红霉素麦克风)c .空肠隔离(29日,30.]。这些突变很可能产生消极的或不确定的结果,实时PCR和需要测序分析。然而,在这项研究中,从未如此抗力移转萘啶酸和环丙沙星被发现在所有的隔离,在协议在西班牙的其他研究[13,31日],红霉素麦克风很低。这里,实时PCR检测到正确的基因型在所有情况下提供一个快速和可再生的筛选耐喹诺酮、大环内酯物检测的方法,这使得分析一组更大的压力。因此,而隔离的数量太小,提供任何测试表型统计决议,显著降低喹诺酮肉牛的电阻率比其他物种可以观察到由实时PCR分析结果。
耐氟喹诺酮类原料药增加了在过去的几年中在世界的许多地方1- - - - - -3]。在西班牙,fluoroquinolone-resistantc .空肠从人类分离于1988年首次报道(32)和阻力患病率增加了自那以后高水平(13,31日,33]。红霉素的活动c .空肠人类隔离,选择的抗生素治疗腹泻所致弯曲杆菌菌株(尤其是在婴儿),似乎保持稳定利率低于5% (13,31日]。这与缺乏稳定的大环内酯物活动协议在本研究动物隔离观察。这个敏感性是安心但活性和更广泛的抗菌药物监测弯曲杆菌从动物需要允许未来的明智的决定如何大环内酯物抗生素可用于食用动物同时保障人体健康。本文提供的实时SNP歧视协议提供所需的加工性能等目的。执行大量的孤立的分析,结合麦克风决心在一个较小的选择,应该帮助在抗性发展的早期检测。
利益冲突声明
作者都没有任何利益冲突。
确认
作者感谢博士van der细胞膜(荷兰瓦赫宁根你的中央兽医研究所)请提供CNET的菌株。这项工作是由巴斯克政府(农业和渔业部),西班牙de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria INIA (rta2006 - 00105 - 00 - 00),和菲德尔。