文摘
这项研究进行了评估的适应impedimetric方法检测裂解性感染沙门氏菌特殊技能噬菌体,并提供一个高选择性的快速检测方法沙门氏菌种虫害通过使用特定的代理。三个噬菌体和12株沙门氏菌种虫害进行测试。每个十二株分别用来接种TSB和每一个噬菌体。培养液浓度之间106和107细胞cfu / mL,:噬菌体的比例1:100。从示例分析,基于电导(G)测量(),感染可以检测到,通过观察探测时间延迟和不同的曲线趋势。动力阻抗的检测微生物的主要结论与噬菌体分型构成的方法确定一个测试微生物敏感抗菌素和一个方法来评估是否裂解性噬菌体存在于样本,通过影响细菌生长速率/代谢改变。
1。介绍
阻抗监测是一个快速、可重复的和敏感的方法,测量了生化的变化引起的细菌生长或代谢1,2]。细菌生长,代谢大弱带电分子(多糖、脂肪、蛋白质)和产生较小的高度带电代谢副产品(有机酸、脂肪酸、氨基酸),所以通过测量阻抗参数,决定了大部分生长介质的离子强度变化。最终的电信号频率依赖也随温度(3]。
微生物,这取决于他们的数量和代谢活动,诱导特定时刻显著改变导致的变形曲线。这个拐点是称为检测时间(DT)。这个检测的时间变化将是最初的数量成反比的生物接种到井(4),也将由介质的成分(例如,可发酵碳水化合物会给一个大的电导率变化与发酵细菌)。
食品加工机生产标准产品每天在相似的条件下,该产品的校准曲线可以快速建立和用于评估微生物状态,但只要粮食生产的条件,媒体,和温度中使用的工具,等等,保持不变(5]。使用一个自动impedimetric系统细菌计数,甚至有可能预测食品的微生物行为在不同的环境条件和确定生成时间。
这个和其他快速方法可以受到竞争对手的干扰微生物和/或食物碎片。竞争对手生物可以和探测系统给假阳性检测交叉反应或可以长到一定程度,将“面具”的目标生物(6]。使用噬菌体的研究克服这些缺点产生检测政权与最小分析时间,但最大可靠性。噬菌体是一种病毒,这种病毒只感染和繁殖细菌。一旦他们知道,他们建议作为对抗病原菌的治疗药物。后,这些病毒被申请打字和正在接受调查的抗菌剂的食物(7]。从裂解性感染,释放子代噬菌体伴随着父母的感染细胞的破坏。它已经被描述为一种检测噬菌体在乳酸发酵剂通过评估探测时间参数和电导的变化百分比8,9]。
2。材料和方法
2.1。噬菌体
三个不同的噬菌体进行这项研究(39岁,2/2,38)噬菌体分离、特征和在电子商务项目Phagevet-P米尼奥大学布拉加,葡萄牙。档案股票每个噬菌体的菌株保持在0.90% (w / v)氯化钠溶液在冷藏库。枚举噬菌体粒子在这些实验中,遇到空斑实验方法之前执行连续稀释0.90% (w / v)氯化钠(卡尔森,2005)。
2.2。菌株
三种噬菌体宿主(S1400/94、869、128)。除了这些沙门氏菌菌株,九(172,205,002,161,195,204,152,23岁和39)从ESB被任意选择沙门氏菌文化的集合。细菌培养工作方便维护与冷冻保护剂(30% (v / v)甘油)。在实验期间,所有的孤立文化被储存,在实验室的分析,中,TSB含有30% (v / v)甘油。的沙门氏菌文化是准备在10毫升的大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB、Pronadisa、葡萄牙),一夜之间,生长。
2.3。电导测试
执行的测试是在一个impedance-based系统(Bactometer型号64 BioMerieux Vitek, Hazelwood,密苏里州,美国)。档案的每个噬菌体菌株连续稀释0.90% (w / v)氯化钠溶液,立即在除了井模块和插入到Bactometer处理单元(BPU)。细菌的浓度给最短的检测时间确定在不同的初始实验。每个菌株和噬菌体的混合悬浮测试在几个细胞噬菌体比率。在每个模块(16井),一个包含无菌生理盐水和另一个与TSB样品的无菌检测的介质;随时检测时间在测试期间未经消毒试验,这也意味着高概率的受污染的样品在同一Bactometer单位。模块被孵化,电导的变化管连续监测每隔6分钟BPU 24小时。年底这段时间,不断测量电导的变化可以在编辑报告的形式,以“增长曲线”(代谢变化曲线),并存储在电脑作进一步分析。
2.4。噬菌体敏感性的“现场测试”
在执行Bactometer测试之前,12的易感性沙门氏菌测试菌株感染的噬菌体被记录使用“现场测试”的方法。这种方法是建立在描述的空斑实验d 'Herelle噬菌体枚举(10]。与细菌细胞而不是混合噬菌体倒在一层软琼脂、整除的噬菌体悬挂放置在电影“顶级琼脂中生长的细菌的表面。被感染时形成一个光环,这意味着分离是容易噬菌体并产生斑块(+积极的迹象),而负面(−)表明,没有观察到(表斑块1)。它将获得类似的结果使用“抽查”或电导测试。
3所示。结果
3.1。电导的优化方法
细菌细胞和细胞的接种水平噬菌体比操作参数,是进行大规模测试前噬菌体的影响沙门氏菌spp。没有噬菌体,沙门氏菌菌株显示类似的电导率变化过程中孵化模式。此外,几乎所有菌株,检测时间接种水平成反比。最短在接种浓度的检测时间获得和cfu /毫升。获取检测时间值进行分析,这个实验是一式三份的噬菌体宿主菌株(S1400/94, 869,和128年隔离;见表2)。
接种物的电变化最大和cfu /毫升,注册50%自启动(图变化的信号1)。它也必须考虑,在接种浓度之间和cfu / mL,曲线模式看起来像“细菌生长曲线”形状特征的期望Bactometer图表。同样的不能观察到浓度越高,和有一个延迟检测时间。
在噬菌体感染的实验中,使用cfu /毫升接种浓度。在这项研究中使用Bactometer感染的检测,在噬菌体的缺席,所有沙门氏菌菌株显示电导率变化在增长的模式类似,在此选择接种浓度。
另一个优化的方法是由研究细胞噬菌体的影响比电导曲线上的每台主机的沙门氏菌,使用相应的噬菌体。从cfu /毫升接种浓度为基础水平,不同浓度的噬菌体悬挂被添加。每台主机的压力测试对其特定的噬菌体,这样对比数据造成样品不含噬菌体和样品接种一个已知浓度的噬菌体裂解感染的检测。
电导变化后检测时间是唯一的参数与噬菌体浓度有关。电导的变化百分比值约为5小时后接种是逆相关的初始数量每mililiter点状单位(空斑形成单位/毫升,图2)。从细胞到噬菌体比研究,观察到检测时间受噬菌体在文化但改变初始噬菌体的数量成正比。样品感染(b)比和(c)空斑形成单位/毫升,表现为控制(a)(没有噬菌体控制)在接种后4到5小时,但是电导变化6到8小时后停止。
有显著的延长检测时间细胞:噬菌体的比例控制和其他样品相比,指示一个高度在细菌生长抑制作用,这是选择单元格:噬菌体比率进行进一步的实验。在接种后三小时之前,是不可能区分化验;不同浓度下相同的指数显示这种类型的变化模式。除了一个非常稳定的测定与非常低的标准差,和其他人一样,其模式允许建立一个数字之间的关系不仅检测时间和控制分析,还通过积分计算(计算面积)。同样重要的是,要提到小检测时间是理想的快速测定。类似的结果在869年和128年的宿主菌株与他们特定的噬菌体,39岁,38岁,分别如表所示3。
3.2。定义测试的敏感性和特异性
噬菌体的电导检测技术允许在所有测试样品导致检测延迟时间和影响电导的百分比变化曲线,主要在最初几个小时,表所示4。因此,电导技术特征,可以作为敏感的方法。
当一个菌株及其溶解性噬菌体接种和细胞样品中同时被感染,这是预计将在检测时间和观察一个大延迟较小的总电导的变化,因此,一个更大的差距之间的区域控制曲线和样品的比当处理noninfective噬菌体;在这种情况下,这些值应该小。
期望从电导测试结果类似的结果,在软琼脂草坪形成斑块的能力,比较建立了两个测试的结果,如两个表所示1和3。电导法的敏感性定义为样本,发现显示的百分比电导曲线控制和phage-infected文化之间的差异。特异性被定义为样本被发现对应的百分比斑测试结果。然而,不能计算因为溶解性和特异性nonlytic DT噬菌体产生了延迟;Bactometer方法显示阳性结果(DT延迟和减少总电导的变化),对所有噬菌体-沙门氏菌组合。在十二个菌株中,只有5个(S1400/94‘869’, 128年,172年和152年)显示,预期结果与各自的裂解性噬菌体Bactometer测试。然而,剩下的七株还显示与nonplaque-forming噬菌体的电导曲线的差异。作为一个例子,869年39噬菌体感染宿主的空斑实验,但没有产生斑块161隔离。观察Bactometer结果,注册的曲线不以同样的方式描述这两个菌株;他们表现出类似的曲线模式,基于噬菌体检测时间和微分值39。
在Bactometer阳性,没有斑块大小之间的关系被发现和检测时间,也与曲线之间的差异。例如,噬菌体38有类似的感染性行为在斑块S1400/94和172隔离,尽管对电导测量,这噬菌体似乎影响172年的孤立的代谢行为多S1400/94”。
4所示。讨论
从分析数据的,它可能会得出结论,该方法不是特定检测裂解性噬菌体,虽然是敏感、快速、检测感染和宿主细胞代谢的改变但不产生细胞溶菌作用和生产成熟的噬菌体粒子。然而,这是一个方法,将电导测量和识别特定的噬菌体沙门氏菌种虫害和延迟检测的检测时间,很简单,自动化的能力。动能由电导检测微生物pathogen-specific噬菌体的构成方法确定一个未知的微生物测试目标生物,也是一种技术来确定是否一个特定的噬菌体存在于样本,通过影响细菌生长速率/代谢改变。
在这个工作中,是不可能得出结论,确定一个测试隔离的目的是容易沙门氏菌基于特殊噬菌体,电导测定比空斑实验。一个假设之间的差异观察斑块的形成和Bactometer结果可能是,尽管噬菌体可能感染的应变的能力沙门氏菌,因为某些原因被感染的细胞不会产生完整的噬菌体粒子和不溶解的噬菌体周期。然而,噬菌体基因组可能仍然有能力重定向感染细胞的代谢过程从而导致检测延迟时间。还有可能的是,这种感染可能lysogenise细菌细胞。
不可能来比较这两种不同的方法(在斑块和Bactometer监测抽查)评价裂解性噬菌体感染的媒体具有不同的物理结构;噬菌体斑块的增长之间的差异和汤在斑块的扩张阶段发生在固体介质的物理结构降低噬菌体与宿主扩散,防止总环境混合,可能引起当地噬菌体多样性远高于一个观察噬菌体的大部分生产中肉汤。也许是错误的分类Bactometer方法不太特定的比较它与现货(斑)测试。可以肯定的是,必须使用新的方法来评估性能的噬菌体进行这项工作,(11),试过高效液相色谱法,12例如,]发达immunomagnetic separation-bacteriophage化验。
电导参数是选择从三个电的变化,可以测量Bactometer,尽管其他作者使用了其他信号(8,9,13- - - - - -15]。这种方法还需要进一步的研究相关的各种病毒和噬菌体的特点,以及验证预期的降低噬菌体检测浓度,所描述的(8]。
在进一步的研究中,使用Bactometer或探索一种不同的方法,一组决定,如噬菌体的初始浓度和裂解性感染的一些动力学因素(MOI, phage-coded功能和增加细菌分离株的数量)。事实上,细菌的营养状况,如果噬菌体的细菌机械最大限度利用其繁殖,可以显著影响破裂的大小,但phage-coded功能聚合酶和调节蛋白等必不可少的噬菌体生产(他们固有的低效率可能不允许噬菌体细菌资源的充分利用,因此破灭的大小可能是有限的)在爆炸中发挥更大的影响大小(16]。
未来的研究应该调查是否细菌感染和生产延误nonlytic噬菌体(即Bactometer检测时间。,而不是产生斑块在现场测试),这为什么发生?可能的研究途径是:(a)附件噬菌体和注射的DNA,但出于某种原因的噬菌体基因组并不代码生产新的噬菌体,(b)可能的DNA噬菌体的限制性内切酶降解,或(c)充分修改的细菌代谢导致推迟DT,但不是生产成熟的噬菌体。这些(以及其他)假设应该Bactometer研究更好地理解我们的结果。
承认
作者感谢EC喉炎的财政支持项目”Phagevet-P,不。2005 - 7224年”。