CD107a水平增加,细胞内细胞因子刺激PBMCs - 2从子宫内膜异位症患者

文摘

假设,子宫内膜异位症患者的免疫系统受损,与注意指向自然杀伤(NK)细胞。具体地说,它被假定改变周边血液中NK细胞的数量与内膜异位损伤的存在。本研究旨在评估周边NK细胞表面标记物的水平在子宫内膜异位症CD107a刺激- 2的存在。外周血单核细胞(PBMCs)从7妇女子宫内膜异位和7获得女性子宫内膜异位症。PBMCs被分为两组,重组- 2处理或不及时治疗。PBMCs向靶细胞的细胞毒性活动(K562)评估。然后,两组人cocultured 4天。CD107a的表情,TNF -α和干扰素-γ用流式细胞术测定分析。没有区别之前CD107a刺激- 2的表达在PBMCs相比女性的子宫内膜异位症女性子宫内膜异位症。然而,我们观察到upregulation表达的表面标记CD107a治疗后子宫内膜异位症组。此外,CD107a有显著差异表达在子宫内膜异位症组刺激- 2(之前和之后< 0.01)。我们还发现生产TNF -没有区别α和干扰素-γ之前和之后在- 2治疗组。CD107a的水平显著增强在外周血取自- 2治疗后子宫内膜异位症的女性。

1。介绍

子宫内膜异位是最常见的一种良性妇科疾病和组织学上表现为子宫内膜组织的存在是在子宫外(1]。子宫内膜异位引起痛经、性交困难、骨盆疼痛和不孕在生育年龄的女性2]。尽管其高患病率和失能的症状,子宫内膜异位的具体致病机制并不完全清楚。免疫功能障碍在腹膜环境中被认为是一个关键因素在子宫内膜异位症的发展,流离失所的子宫内膜细胞能够避免免疫识别(3]。多项研究表明,炎症导致疾病的病理生理学,主要通过改变免疫细胞的功能和增加促炎细胞因子的水平在腹腔,子宫内膜,和血液4]。

自然杀伤(NK)细胞是免疫系统的组件中扮演重要的角色对病毒免疫和肿瘤免疫监视5,6]。这些细胞主要是血液中循环,他们占∼5 - 15%的循环淋巴细胞(7]。NK细胞颗粒淋巴细胞产生大量的炎性细胞因子和释放细胞毒性颗粒组件对感染细胞产生杀伤机制。NK细胞参与子宫内膜异位症的发病机制允许或抑制生存,植入,子宫内膜细胞的增殖3]。这些机制似乎改变子宫内膜异位,表明NK细胞的细胞毒性作用的下降,使子宫内膜细胞附着异位网站(7]。

NK细胞的细胞质中含有高浓度的预成型的设计独特的诱导的细胞毒性颗粒死亡或靶细胞释放,最终导致细胞凋亡的诱导8]。这些颗粒也被称为分泌溶酶体和含granzymes,穿孔素,和lysosome-associated膜蛋白质1(灯)1 (CD107a) LAMP2 / CD107b, LAMP3 / CD63 [9,10]。在NK细胞和细胞毒性T细胞,CD107a是最丰富的蛋白质在细胞毒性颗粒。其细胞表面表达被描述为一个标记对细胞毒性t细胞脱粒和已被证明是强烈刺激调节后沿穿孔素的损失(11]。当脱粒发生,分泌溶酶体释放,CD107a被运送到NK细胞的表面,呈现他们访问抗体绑定,从而使识别NK细胞,激活了放松管制。NK细胞还分泌炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和干扰素-γ(IFN -γ)[12]。在许多情况下,有效释放肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ是充分的NK细胞的效应函数没有perforin-dependent杀死的其他细胞。

改变数字和减少细胞毒性NK细胞的活性被发现在外周血和腹水与子宫内膜异位症的女性,表明NK细胞功能缺陷;然而,这种抑制的机制尚不清楚7]。此外,细胞表面的水平细胞毒性标记CD107a也显著降低在这个疾病,可能导致免疫逃避的经期子宫内膜碎片回流进入腹膜腔(13]。许多细胞因子的水平,包括interleukin-1β(il - 1β)、il - 6、引发,TNF -α转化生长因子-β(TGF -β),更高的腹水与子宫内膜异位症的女性比健康的控制(14]。

一个增强的免疫机制的理解发生异位病变发展的网站应该提供宝贵的见解疾病发病机理(3]。CD107a化验有前途的新工具的特征和可能的免疫治疗使用endometriosis-specific NK细胞(15]。测量检测NK细胞的活化的表面CD107a和检测细胞因子的生产需要加强知识的免疫机制参与子宫内膜异位的发展。

2。材料和方法

2.1。主题

九名女性(平均年龄35.11±1.87年)在博士被诊断出患有子宫内膜异位症Cipto Mangunkusumo总医院参加本研究从2017年2月至12月。七个健康妇女(平均年龄24.00±0.53年)被招募为控制。所有的受试者收到任何激素治疗前至少3个月的研究。从每个主体获得知情同意,这项研究是医学院伦理委员会的批准,印度尼西亚大学(46 / UN2.F1 / ETIK / 2017)。

2.2。外周血单核细胞(PBMC)隔离

9毫升血液收集的健康志愿者和子宫内膜异位症妇女和转移到含有抗凝管(肝素)。PBMCs准备从新鲜周围静脉血Ficoll-Hypaque密度梯度离心法(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。每个血样稀释1:1 (v / v) Ficoll-Hypaque RPMI 1640中型和9毫升。然后,混合物在离心机离心外开式转子在400×20°C g和30分钟。PBMCs收集的间期,在磷酸盐缓冲盐水洗(PBS)计算,评估可行性和台盼蓝染料(0.2% (v / v)在PBS)。然后,孤立PBMCs cryovials整除,储存在−80°C到使用或文化。

2.3。细胞培养

PBMCs在完全培养基培养(RPMI 1640补充10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素,链霉素100毫克/毫升、两性霉素B和1%;所有从Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)总量的5毫升在37在潮湿的环境中^oC公司5%以下₂。细胞被分成2井10⁵PBMCs在每个。第一个刺激了100 ng / ml白介素2 (2)(Sigma-Aldrich)和培养3天(72小时)。另一个是培养没有任何刺激。细胞系(K562)添加了第三天,孵化24小时。细胞培养后,1μl (GolgiStop (BD生物科学,圣何塞、美国)包含莫能菌素添加到每6毫升细胞培养,并彻底混合。然后,混合物被孵化文化的另一个终止前4小时。

2.4。细胞染色

细胞被染色的NK细胞表面标记CD56-fluorescein异硫氰酸酯(FITC)和CD107a-phycoerythrin (PE)抗体(BD生物科学)30分钟50在4°Cμl染色缓冲区(PBS +的边后卫0.25%)。染色的细胞被洗两次缓冲区。表面染色后,这些细胞被resuspended彻底;然后,250年μl固定/透化作用的解决方案是添加,混合物在4°C孵化20分钟。这些细胞被洗两次1毫升的BD洗缓冲区。接下来,allophycocyanin - (APC)共轭anti-TNF -α和anti-IFN -γ抗体被用来染色的细胞内细胞因子在4°C PBMCs 30分钟。相应的同形像控制是利用负控制。细胞内染色后,细胞被洗两次,1毫升的BD烫/清洗缓冲和resuspended在染色前缓冲流仪分析。

2.5。流仪结果

三色流式细胞术分析使用FACScan流式细胞分析仪(贝克曼库尔特FC50)和数据分析与CellQuest软件(BD生物科学)。的荧光通道FL1 (FITC) FL2 (PE)和FL3 (APC)是用来测量细胞表面抗原和细胞内细胞因子。Anti-CD56 (FITC)和anti-CD107a (PE)抗体被用来识别NK细胞群(16]。所有的数据表示为百分数。

2.6。统计分析

进行了统计分析和皮尔逊相关分析软件(GraphPad软件)使用棱镜5。女性之间的差异变量没有子宫内膜异位子宫内膜异位和女性使用独立样本进行评估t测试。配对t测试每一个变量的值进行比较之前和之后的治疗。皮尔森相关系数是用来确定两组变量之间的相关性。的值< 0.05被认为是指示意义。所有数据都表现为平均数±标准差,除非另有指示。

3所示。结果

细胞生存能力被定义为细胞反映细胞的数量与锥虫蓝染色为阴性而积极的一个。细胞总数和细胞的生存能力如表所示1。细胞的数量明显减少低温贮藏后对照组;然而,无显著差异的低温贮藏前后子宫内膜异位症组(表1)。我们还观察到显著减少细胞冷冻保存(表之前和之后的可行性1)。

PBMCs进行评估子宫内膜异位症组- 2治疗前和对照组。没有差异的表达CD107a, TNF -α或干扰素-γ子宫内膜异位组和对照组之间(表2)。

评估的影响- 2在NK细胞表面标志和细胞内细胞因子水平,PBMCs被培养在- 2的存在。我们观察到upregulation表达的表面标记CD107a治疗后(图1(一))。此外,有一个显著差异CD107a表达在子宫内膜异位症组刺激之前和之后(图- 21 (b))。

胞内细胞因子如TNF -α和干扰素-γ由外围NK细胞也在这项研究评估。在刺激,TNF的表达没有明显差异α和干扰素-γ子宫内膜异位症的女性和女性之间没有治疗前后子宫内膜异位症(- 2数据2和3分别)。

4所示。讨论

众所周知,- 2诱导NK细胞的发展和扩散17]。此外,刺激导致- 2激活和CD56的扩张^明亮的人口高溶细胞的活动对NK细胞目标(18]。在这项研究中,我们发现,NK细胞的细胞毒性的表达没有明显不同子宫内膜异位和控制之间的外周血组。有趣的是,NK细胞的细胞毒性颗粒的水平如granzyme B,穿孔素,CD107a减少腹水的女性子宫内膜异位症(19]。与- 2治疗后,我们观察到的表达CD107a显著增加了子宫内膜异位症组相对于对照组。Martinovic等人在转移性黑色素瘤患者的研究表明,CD107a的表达也增加了2治疗后(20.]。此外,和白介素- 2的结合产生一个更强有力的影响增加CD107a表达式在NK细胞(20.]。此外,席尔瓦等人报道,CD107a的表达明显高于2刺激相比,如果没有刺激后上皮卵巢癌腹水(游离21]。这些结果表明,NK细胞的细胞毒性可以通过免疫调节恢复治疗。

此外,我们也评估TNF -的生产α在PBMC C107a + CD56 +细胞没有子宫内膜异位子宫内膜异位症的女性和女性。我们发现在TNF -没有区别α团体之间的生产。众所周知,肿瘤坏死因子-α是一个重要的促炎细胞因子,参与子宫内膜异位症发病机制(22]。肿瘤坏死因子-α异位tissue-induced刺激中也扮演了重要的角色在基质金属蛋白酶的表达,积极参与入侵和内膜异位损伤矩阵重构。王等人的一项研究报道,子宫内膜异位症患者的腹水包含一个数量的增加激活巨噬细胞分泌当地产品重要的血管生成属性,包括TNF -α(23]。这个结果与最近的研究显示,在协议TNF -的浓度α腹水中明显高于与子宫内膜异位症的女性比没有子宫内膜异位症的女性(24]。肿瘤坏死因子-α激活巨噬细胞分泌的炎症、细胞毒性和血管生成属性和参与子宫内膜异位的发展25]。在这项研究中,我们还报道,TNF -α表达式显示没有区别- 2后的子宫内膜异位和控制组织的刺激。

此外,这项研究表明,在干扰素的表达——没有区别γ在CD107a + CD56 +细胞之间的女性子宫内膜异位症,子宫内膜异位症。尽管增加CD107a + CD56 +细胞百分比与- 2治疗后观察子宫内膜异位症组干扰素-的数量γ由CD107a + CD56 +细胞产生在这组略有下降。另一方面,Tarokh等人的研究展示了一种干扰素-水平下降γ在子宫内膜异位症组相对于对照组(26]。同样,Gmyrek等人表明,干扰素的生产γ在子宫内膜异位症(外周淋巴细胞减少27]。干扰素-γ已发现的第NK细胞细胞毒性较低,而细胞毒性NK细胞表达低水平的干扰素-γ(28]。另外,干扰素-γ被诱导阻力的靶细胞NK细胞溶解。NK细胞的细胞溶解的功能是由大量的激活和抑制受体,和目标细胞识别等通过激活受体NKG2D导致干扰素的生产γ(29日]。

本研究的局限性之一是小数量的受访者。的受访者数量太小,概括NK细胞的细胞毒性活动在子宫内膜异位症。然而,进一步研究在较大的样本量可能产生更精确的结果。

5。结论

总之,刺激与2 CD107a + CD56 +细胞的百分比增加PMBCs女性的子宫内膜异位,但没有增加这些细胞产生的细胞因子的水平,TNF -α和干扰素-γ。肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ分泌物和NK细胞的细胞毒性被视为两个不同的功能几乎没有协同作用结果早期协会的两个函数NK种群的不同子集。

数据可用性

数据不免费提供第三方使用,因为这是不受伦理批准这个项目。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢Muhammad Ikhsan Herdinda博学Rizkinya, Mardhatillah Fuady援助在样本收集。作者还要感谢印尼资助这项研究通过菩提授予合同没有。nkb - 1584 / UN2.RST / HKP.05.00/2020。

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