乙醇提取的石榴(石榴)皮在DSS-Induced老鼠增加Caspase-3的表达式

文摘

背景。结直肠癌(CRC)是一种恶性肿瘤源自于腺上皮细胞在结肠。炎症性肠病(IBD)患者更容易患CRC。癌症扩散的特点是抑制细胞凋亡的损失,其中包括caspase-3激活。本研究调查了石榴皮提取物对小鼠caspase-3墓穴的表达细胞由葡聚糖硫酸钠(DSS) 2%。方法。六组进行了实验研究。所有治疗都在42天。DSS诱导的组织都是通过水喝,除了正常的集团只有水。给出的治疗方法包括石榴提取物在两个剂量(240毫克和480毫克/公斤体重/天),阿司匹林和鞣花酸。标本被固定和免疫组织化学染色评分caspase-3的表达,并统计分析。结果。每个治疗组的h值分别为213.23±8.32 (DSS), 243.81±18.69(正常组),226.10±12.38(石榴皮提取240毫克/公斤/天),238.84±15.81(石榴皮提取480毫克/公斤/天),227.47±12.15(阿司匹林)和224.01±18.39(鞣花酸)。统计差异被发现在单向方差分析(方差分析)事后分析在DSS组、正常组,剂量2组(石榴皮提取480毫克/公斤/天)。结论。乙醇提取的石榴能够诱导细胞凋亡,这是证明了的增加caspase-3表达式。

1。介绍

结直肠癌(CRC),恶性肿瘤也被称为结直肠腺癌,来源于腺上皮细胞在结肠1]。CRC是癌症的死亡率最高的国家之一(1,2]。炎症性肠病(ibd)增加发展中CRC的风险。尽管没有已知的遗传因子能够解释协会,结肠黏膜的慢性炎症协会提供了一个更可能的解释是长期患结肠炎患者有更高的几率CRC (3,4]。癌症扩散的特点是损失或抑制细胞凋亡5]。在正常细胞中,细胞凋亡是重要的平衡在基底细胞增殖层(6]。细胞凋亡是分为两条途径:内在动力和外在的途径。细胞凋亡的途径都同样caspase-3诱导激活,进一步启动细胞凋亡(7]。caspase-3在启动细胞凋亡的作用使其CRC治疗有效的目标。

已经讨论了慢性结肠炎症可能导致CRC的发展(7]。目前的炎症性肠病的治疗包括抗炎药,其中一些是5-aminosalicylates (5-ASA)、糖皮质激素和免疫抑制或免疫调节因子(8]。然而,使用5-ASA可能引起一些副作用如头痛、恶心、消化不良、腹泻、胰腺炎、淤胆型肝炎9]。在预防CRC,阿司匹林也降低发病率和癌症死亡风险较低的风险五年后,包括CRC (10]。阿司匹林的使用,然而,有一些副作用,包括胃肠道不适包括恶心、胃炎消化道出血(11]。在预防儿童权利公约的发展,鞣花酸等活性化合物已经被提到有抗炎作用,可以治疗溃疡性结肠炎。鞣花酸是非常丰富在石榴和葡萄12]。

石榴(石榴)是一种灌木家庭的千屈菜科(13)常见在伊朗,印度北部,中国,美国和地中海沿岸地区(14]。石榴的提取是发现有一些影响,如抗菌(15),抗氧化,抗炎,antiangiogenetic,诱导细胞凋亡,抗癌,抗诱变剂的14]。抗炎、抗增殖和石榴中提取的抗癌效应,通过调节各种细胞信号通路使它有效的作为一个可能的癌症治疗(13]。然而,很少有研究解释了石榴皮提取的影响在增加caspase-3表达小鼠冒号。这项研究调查了石榴皮提取物对caspase-3的表达在老鼠石榴提取物的管理。重大影响的表达caspase-3提取的石榴可以进一步发展CRC的治疗。

2。材料和方法

2.1。研究设计和伦理间隙

本研究是一个在活的有机体内进行了研究,在瑞士韦伯斯特12-16-week-old雄性老鼠重约20 - 30 g。老鼠繁殖的研究和开发健康研究所(LITBANGKES)。老鼠一直在标准实验室条件下的温度22°C,湿度65%。饮食标准的啮齿动物颗粒和水随意在治疗。33小鼠随机分为6个处理组组成的五到六老鼠。费德勒的样本量确定公式(t- 1)(n- 1)≥15组数字(t6)和最小样本容量为每个组(n≥4)计算。实验进行的解剖病理,医学院,印尼雅加达,印度尼西亚,从2016年8月至2017年5月。伦理批准这个实验动物机构伦理委员会被授予的印尼。

2.2。药物和化学物质

鞣花酸是购自圣克鲁斯生物技术(美国达拉斯,TX)。阿司匹林是购自印尼PT拜耳。葡聚糖硫酸钠(DSS)的分子量60 kDa从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。caspase-3主要是从Abcam购买的抗体。剂量计算在这个实验中提到一项由Kusmardi et al。16]。纯鞣花酸的剂量是由一个转换在参考美国食品和药物管理局(FDA)剂量的26个毫克/公斤/天。本研究中使用的剂量的阿司匹林是43个毫克/公斤/天计算的剂量转换到一个老鼠剂量诱导抗炎效应(17]。

石榴皮提取物的剂量计算确定鞣花酸的化合物在石榴使用高效液相色谱法(单位)。丰富的鞣花酸石榴被发现是240毫克/公斤/天然后成为参考剂量管理石榴皮提取在这项研究。第二个剂量的石榴皮提取物是480毫克/公斤/天通过等比数列。

2.3。鞣花酸含量的测定高效液相色谱法

提取剂量决定基于一个转换的研究在参照美国食品和药物管理局(FDA)在大鼠的有效抗炎剂鞣花酸26毫克/公斤体重。用高效液相色谱检测水平的鞣花酸化合物在下列条件下。(1)列类型:安捷伦Zorbax SB-C18 4.6×150毫米×3.5 m;(2)探测器:UV 254海里;(3)流量:1毫升/分钟;(4)溶剂:甲醇-水的组合。鞣花酸含量的测量测试药物样品始于第一标准复合曲线的测定。从每个标准鞣花酸溶液的浓度(25 - 250 ppm),曲线得到,其中规定的峰值位置鞣花酸化合物在一定的保留时间。每个浓度最高的区域值的标准溶液被使用线性回归的标准曲线方程y=一个x +b在Microsoft Excel^®程序。测试提取进行了相同的程序标准化合物的解决方案。石榴提取物的浓度(EP)高效液相色谱测试是2000 ppm。鞣花酸含量计算进入最高的区域价值进入回归方程。计算结果是鞣花酸含量的百分比在测试药物样品。

鞣花酸的浓度(EA)通过高效液相色谱法,鞣花酸的含量在石榴提取物(% EA)如下:% EA = (EAHPLC: EP)×100% EA =中鞣花酸含量的石榴提取物EAHPLC =鞣花酸的浓度的高效液相色谱(ppm)EP =石榴提取物浓度(ppm)

2.4。实验设计

这项研究是在六个治疗组的3×14天治疗(42天)。所有治疗都是通过饮用口服。正常组小鼠接受口头只有水在整个实验。其余的组有水有2% DSS七天开始的时候,第二,第四,第六周。DSS的政府是用7天的时间间隔的水喝。负对照组不给予任何其他治疗DSS。两组有石榴皮提取物在两个不同的剂量为每组实验的第一周的开始。阿司匹林和纯粹的鞣花酸被卖给其它两组在第一周的开始。所有的组老鼠都牺牲了DSS的最后治疗三天后得到冒号,然后清洗和冲洗水。组织获得分析结肠组织从近端到远端3毫米的厚度。 The specimens were fixated using 10% buffered neutral formaldehyde (BNF).

2.5。样品制备

组织固定后,formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)准备根据病理实验室的标准程序。FFPE 3片μ米用切片机和放入poly-D-lysine-coated幻灯片,温暖,经历了deparaffinization过程根据标准的实验室程序。

2.6。免疫组织化学(包含IHC)分析

给出的标本免疫化学染色观察caspase-3的表达。这个实验的观测和分析包含IHC专注于小鼠隐窝细胞的细胞核。细胞用积极caspase-3表达会出现黄棕核,而细胞的负面表达caspase-3会出现蓝色的细胞核。

caspase-3表达式的计算是通过使用一个组织学评分(h),决定使用一个包含IHC测量应用,ImageJ 1.53米。通过显微镜观察,五种力量领域被随机的放大400倍。基于颜色的强度,分数范围从0,1,2,3,代表着消极、软弱,媒介,强烈的颜色强度水平。h值的计算可以归纳为如下公式(16]:

2.7。统计分析

数据分析使用单向方差分析(方差分析),其次是邓肯的事后分析。的价值 表示一个重要的区别。本研究的总体统计分析是使用IBM进行的^®SPSS^®统计22软件(美国、IBM、纽约Armonk)。

3所示。结果

3.1。测量的结果鞣花酸化合物的水平

测量的结果ethanolic鞣花酸的提取石榴皮的面积值为5.898时获得的。这个值是然后进入回归方程y= 26925x+ 16943,这样的鞣花酸含量208.432 ppm或11.047%。回归方程得到的色谱数据处理的结果的面积5纯鞣花酸化合物的浓度,也就是说,25岁,50岁,100年,150和200 ppm。区域色谱的结果为每个纯鞣花酸浓度和标准曲线呈现在图1。

鞣花酸的含量测定的高效液相色谱法的提取,鞣花酸的含量在石榴中提取EA (%) = (216.7: 2000)×100 = 11.047%。众所周知的文学的有效抗炎剂鞣花酸是26毫克/公斤体重。所以,当转换成石榴提取,提取剂(毫克/公斤)用于本研究=(26:11047)×100 = 240毫克/公斤体重。各治疗组体重的变化测量每周如图2。

3.2。免疫组织化学Caspase-3的表达

免疫染色的显微观察,图所示3表明乙醇提取石榴皮(剂量1和剂量2),阿司匹林,和鞣花酸caspase-3的表达增加,所示的阳性染色强度brown-stained细胞。与阴性对照组相比,强度较弱的brown-stained和一些蓝色细胞也可以看到的,这表明低到没有caspase-3的表达式。caspase-3表达的定量测量是使用h值。

单向方差分析的结果显示在图4。平均每个治疗组分别为213.23±8.32 h值获得组(DSS), 243.81±18.69(正常组),226.10±12.38(石榴皮提取240毫克/公斤/天),238.84±15.81(石榴皮提取480毫克/公斤/天),227.47±12.15(阿司匹林)和224.01±18.39(鞣花酸)。收集的数据有一个均匀的方差的正态分布。单向方差分析测试表现出显著差异 ,和邓肯的事后分析显示显著差异之间的负对照组和正常组和负控制剂量2(石榴皮提取480毫克/公斤/天)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现,我们提取的鞣花酸浓度大约是11%,据估计为石榴皮提取物的活性化合物。因此,给老鼠的剂量调整的浓度与FDA的建议计算提取。有趣的是,在这项研究中,我们显示在图2没有减肥组收到提取被观察到,而在观察其他组减肥。

此外,这项研究的结果表明,乙醇提取石榴皮可以增加在DSS-induced caspase-3老鼠的表达。老鼠caspase-3隐窝细胞的表达增加的剂量提取增加了。caspase-3表达水平的增加的提取研究中超过了caspase-3阿司匹林和纯粹的鞣花酸的表情。Caspase-3表达剂量2提取甚至接近Caspase-3表达正常的组织,代表一个正常的细胞凋亡水平。DSS是硫酸多糖,水溶性和带负电。DSS是常用的小鼠诱导炎症引起的结肠上皮损伤层,从而释放促炎细胞因子从下面的组织18]。DSS诱导的小鼠模型常用的进行研究与炎症性肠病(IBD) (18,19]。阿司匹林作为一个积极的控制在这个研究。阿司匹林,作为一个类型的非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药),发现诱导细胞凋亡在CRC细胞(20.]。增加caspase-3的表达式进行的另一项研究中发现了燕et al。21通过AP-2)发生α退化。鞣花酸是一种活性物质,在这项研究作为主动控制。鞣花酸,苯酚物质之一,众所周知,释放细胞反应,其中之一是通过一连串的分子激活细胞凋亡。这项研究由李等人。22)发现鞣花酸促进caspase-3的表达,从而在膀胱癌T24细胞诱导细胞凋亡。

caspase-3表达式的显著增加在这个研究类似于研究Shaban et al .,显示出类似的结果中有一个表达增加的caspase-3老鼠的石榴皮提取物和一群老鼠相比,是未接受治疗(23]。研究邓小平等人确定石榴提取增加了伯灵顿的表情比/ bcl - 2和促进了caspase-3的激活细胞凋亡执行人(24]。类似caspase-3表达的增加也影响所做的研究中发现Sepehr Sineh et al。25)和Bishayee et al。26]。除了caspase-3表达的增加,石榴皮的提取物也增强的表达caspase-9 Abdul Ghani等进行的一项研究。这项研究得出结论,石榴皮提取物通过线粒体途径诱导细胞凋亡(27]。

石榴是已知抗癌效果,得到了高含量的多酚。石榴的抗癌作用源于其抗增殖,anti-invasive, antimetastatic品质。注入细胞凋亡效应也激活石榴bcl - 2通过调制,upregulation p21和p27 cyclin-CDK组织的差别,对这些28]。Amer等人证明了石榴也已知活动抑制活性氧是需要激活的炎症过程,特别是抑制细胞增殖和活化的免疫细胞。因此,石榴的anti-ROS活动不过是用来减轻炎症并减少细胞死亡由于氧化应激(29日]。

虽然这个实验的方法是用石榴皮提取物作为预防CRC IBD发展后,这些结果显示提取的力量开发治疗疗法。石榴的能力在增强caspase-3作为细胞凋亡的表达执行人使其成为一个强有力的物质与caspase-3进一步研究作为抗癌药物分子的目标。

5。结论

Caspase-3,扮演着一个重要的角色在细胞凋亡诱导,在抗癌治疗中显示能力作为目标。与高水平的石榴皮多酚的提取已知抗癌效果,其中一个是通过诱导细胞凋亡,而在这项研究中,证明了增加caspase-3的表达式。仍需要进一步的研究来探索疗效和安全性的石榴皮提取物诱导细胞凋亡作为一种防止CRC发展IBD。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢理事会的研究和创新,印尼,资金菩提Q3(合同编号。nkb - 1855 / UN2.RST / HKP.05.00/2020)。

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