抑制促炎细胞因子Cutibacterium曼秀雷敦-诱导HaCaT细胞炎症反应Buddleja davidii水提物

摘要

痤疮是一种皮肤炎症性疾病;虽然市场上有一些治疗痤疮的消炎药，但它们有相当大的副作用;因此，需要新的治疗选择。本研究中，从韩国济州岛提取的16种用于抗炎试验的植物水提物中，b . davidii显示出抗炎过程中促炎细胞因子表达的强烈下降c·曼秀雷敦在人类的HaCaT角质化细胞。b . davidii下调COX-2的，iNOS的41％的57％的表达，以及促炎细胞因子TNF-α的29％αIL-1的32％β，IL-6的21％，和IL-8的35％。此外，b . davidii抑制NF-κBκ由toll样受体2 (TLR-2)激活的角质形成细胞中的B和MAPK信号级联c·曼秀雷敦。鉴于这些结果,b . davidii是减少对促炎细胞因子表达的电位剂c·曼秀雷敦诱导的炎症，并可能提供给目前的药物替代。

1.简介

痤疮是一种慢性炎症性疾病的皮脂囊在下巴，脸颊，前额和背部。病情严重时可出现囊肿和瘢痕。虽然痤疮是一种皮肤病，但它可以导致心理问题，影响患者的生活质量。在痤疮发病机理,c·曼秀雷敦已被确定为主要病原体之一。c·曼秀雷敦，共生革兰氏阳性厌氧的，定殖皮脂腺滤泡的管道，引起先天免疫应答[1]。

炎症是感染人体的初始复回应。由炎症引起的过程c·曼秀雷敦始于与toll样受体(TLRs)结合识别的肽聚糖(PGN)和脂壁酸(LTA)激活TLR信号通路，并触发重要的细胞内信号通路，包括有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子kpa - b (NF-)κB）的途径。这导致的转录因子，如激活蛋白-1（AP-1）和NF-核易位κB，最终导致多种促炎细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子(TNF)α，白细胞介素（IL）1β、IL-8和IL-6 [2,3.]。

具有抗炎药相关的不良影响已变得越来越普遍，包括增加胃肠道溃疡，出血，心脏发作的风险，并与非甾体抗炎药（NSAIDs）相关肾病[4]。一些抗炎药物干扰减活的和超激活细胞信号网络或转录因子[4]。因此，为了限制的不利影响，下一代的抗炎药物需要靶向仅在受影响的组织或炎症的靶基因的一个小的子集的操作或者酶或信号通路。

药用植物已经长期被用作治疗活性化合物，这也是一种流行传统医学治疗炎性疾病的来源。使用治疗炎症的传统药物可以与现有的常规治疗相比，提供更安全的替代品。有证据表明，草药具有副作用较低的速率与常规的药物[比较5]。此外，药用植物用于皮肤的目的与低或没有副作用是越来越受欢迎的传统医学和化妆品行业。Buddleja davidii是一种多年生草本植物，属于阴囊科，泛热带分布于南亚、非洲和美洲。它的根、叶和花被民间医学用于抗氧化、抗炎、抗病毒、抗疟原虫和抗真菌作用[6,7]。

本研究的目的是测定其抗炎活性b . davidii对c·曼秀雷敦感染并探讨其在人类角质细胞系的作用机制。

2.材料和方法

2.1。细菌的制备

c·曼秀雷敦（CCARM9009）从首尔女子在高丽大学耐药性微生物（CCARM）的培养物保藏中心。c·曼秀雷敦在增强Clostridial培养基(RCM)琼脂(Becton, Dickinson and Company, USA)中，在GasPak™EZ厌氧容器系统(Becton, Dickinson and Company, USA) 37℃厌氧条件下生长48-72小时。c·曼秀雷敦在RCM肉汤中培养至100 MOI，然后在80℃下热灭活30分钟，在进一步的实验中[使用前2]。

2.2。植物材料和提取

候选植物为具有抗炎作用的中草药，从韩国济州岛获得。这些植物用蒸馏水清洗，然后用冷冻干燥机干燥(韩国伊尔申)。干燥后取300克干药草在3升蒸馏水中提取3次，80℃回流8小时。在50℃的减压条件下，使用与冷冻浴循环器(Jeio Tech，韩国)连接的旋转蒸发器(EYELA，日本)浓缩500毫升提取物[8]。煎剂用薄纱布，随后由Whatman（GE Healthcare公司，USA）1级滤纸在进一步使用前过滤，使用冷冻干燥机（ILSHIN，韩国）冻干，并贮存在4℃[9]。为准备实验用的样品，将提取粉(10 mg)存于1 ml二甲亚砜(DMSO)中。

2.3。细胞培养

人HaCaT角质形成细胞[10在含10%胎牛血清和100 U/ml青霉素的杜尔贝克改良的Eagle 's培养基(DMEM)中，在37℃、5% CO的湿化培养箱中生长₂。

2.4。定量实时PCR

HaCaT cells (seeded at a density of 5 × 10⁵孵育24小时，用不同浓度(12.5、25、50和100)进行预处理μ取植物水提液1小时，然后用热灭活处理c·曼秀雷敦(100 MOI, 5×10⁷ CFU per well) for 24 hours. Total RNA was isolated from the HaCaT cells using TRIzol reagent (Life Technology, Thermo Fisher Scientific, USA) according to the manufacturer’s protocol. A reverse transcriptase (NanoHelix, Korea) reaction was prepared using 1 μg的RNA来获得cDNA。以cDNA为模板进行real-time PCR (qRT-PCR)，用QGreen2倍SybrGreen qPCR Master Mix(韩国CellSafe)。引物序列用于检测TLR-2、iNOS、COX-2、TNF-α，IL-8，IL-6，IL-1β， GAPDH在表中列出1。GAPDH用作内源对照。δ-增量CQ公式用于计算基因表达。

2.5。Western印迹分析

HaCaT细胞被处理b . davidii水性提取物和热灭活c·曼秀雷敦如上所述。The cells were then lysed using radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) lysis buffer containing 150 mM sodium chloride, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 50 mM Tris (pH 8.0), and complete protease inhibitor cocktail (BIOMAX, Korea). Protein concentration was determined with the Bradford ((Sigma-Aldrich, USA) assay using bovine serum albumin as a standard and detected using a UVITEC imaging system (Uvitec Ltd, UK). Protein samples (50 μ克）通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE分离），并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。The membranes were blocked with 5% skim milk in TBST buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, and 0.1% Tween 20, pH 7.6) for 1 hour at room temperature and then subsequently incubated with primary antibodies including p-NF-κB / NF-κB (sc-101752/8242S)、p-p38/p38 (sc-17852/sc-535)、p-JNK/JNK (sc-6254/sc-7345)和GAPDH (sc-25778) (Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA)在4℃过夜。然后用二抗在室温下振荡膜1小时。使用ECL试剂获取信号，UVITEC成像系统设备检测信号。p-NF-的相对蛋白表达κB和NF-κ使用ImageJ检测western blot数据中B、p-p-38、p-p-38、p-JNK和JNK(相对于GAPDH)。

2.6。细胞活力测定

采用MTT(3-(4,5 -二甲基噻唑-2-yl)- 2,5 -二苯基四唑溴化铵)测定细胞活力[3.]。HaCaT细胞以10的密度接种⁴每100人μ在96孔板升培养基。b . davidii水提取液加入各种浓度从100的稀释系列 μ50 g / ml,μg / ml, 25岁μ12.5 g / ml,μ克/毫升，6.25 μ3.125 g / ml,μ微克/毫升，和1.5625 μ克/毫升。温育24小时后，将细胞用细胞培养基在加湿培养箱5％CO下0.1％MTT溶液4小时，在37℃下温育₂。丢弃MTT溶液，加入DMSO使活细胞中产生的MTT-formazan晶体溶解。黑暗孵育2小时后，在540 nm处测定吸光度[16]。

2.7。统计分析

All data are presented as mean ± standard deviation (SD) of at least three independent experiments and were analyzed using one-way ANOVA. Student’st当只有两个组进行比较测试中使用。差异被认为在统计学上显著 , 。

3.结果

3.1。筛选植物的水提物的潜在抗炎活性

植物水提取物对基因的表达的影响在表中给出2。

炎症过程增加的COX-2和NO合成酶的表达，其产生炎症介质[12,17]。另外，促炎细胞因子如TNF-αα，IL-1β，IL-6，和IL-8触发和迅速放大炎性反应，以限制感染的传播[2,18]。在这项研究中，16种植物从测试其对抗炎活性是济州岛（韩国）提取c·曼秀雷敦全身的炎症。表中描述的基因表达百分比2计算基于基因表达的比率c·曼秀雷敦用含水植物提取物在一个没有植物含水萃取物视为相比增加100％感染的HaCaT细胞c·曼秀雷敦无HaCaT细胞。降低的值表示COX-2、NO和促炎细胞因子如TNF-的表达受到抑制α，IL-1βIL-6和IL-8。表格2节目答:粳稻答:灰色,b . davidii,一，八角和P.炎水性提取物降低引起的炎症过程c·曼秀雷敦。其中,b . davidii水性提取物显示出最强的抑制朝向炎症过程引起的c·曼秀雷敦通过还原的iNOS, COX-2, TNF-α，IL-1β、IL-6、IL-8表达情况(表)2)。

3.2。C.抑制由B.刺水提取丙酸杆菌诱导的HaCaT细胞中TLR-2的表达

c·曼秀雷敦通过激活toll样受体(TLRs)，特别是TLR-2，促进痤疮炎症[2,19]。在最初的筛选中，b . davidii水提取物所显示的促炎细胞因子的表达的强下降c·曼秀雷敦处理过的HaCaT细胞(表)2)。的影响b . davidii在模式识别受体的表达水提取物TLR-2显示c·曼秀雷敦用50诱导TLR-2表达μ克/毫升b . davidii与对照组相比，水提液可使TLR-2 mRNA表达降低30%c·曼秀雷敦-处理HaCaT细胞不b . davidii水提取物（图1)。

3.3。在C.减少NF-kB的磷酸化B.刺水提取丙酸杆菌治疗HaCaT细胞

TLR-2信号导致NF-的激活κ乙途径，然后NF-κB被释放并转移到细胞核中，在那里调节一系列基因的表达，进而刺激促炎细胞因子如IL-1的释放β、IL-6、IL-8和TNF-α(2- - - - - -4]。该NF-κ激活B通路c·曼秀雷敦toll样受体2 (TLR-2)表达增加(图)1） 和....相比c·曼秀雷敦-自由。b . davidii含水提取物剂量依赖性地减少的量对NF-κB和NF-κ这可能是由于基因表达的减少，如使用蛋白质印迹法（图B蛋白2)。这些结果表明，抗炎活性b . davidiiHaCaT细胞与含水提取物c·曼秀雷敦诱导的炎症可能是由于NF-κB的抑制κB信号通路。

3.4。advidii水提物抑制acns诱导的p38和JNK表达及磷酸化

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在调节多种炎症介质的产生中发挥重要作用[2,4,20]。的影响b . davidii上含水提取物c·曼秀雷敦使用western blotting检测p-JNK和p-p38对-诱导的MAPK通路的活性(图)3.)。c·曼秀雷敦HaCaT细胞和治疗诱导的MAPK活性b . davidii水提物提取物剂量依赖性地抑制MAPK活性。这些结果表明b . davidii水提物通过抑制MAPK信号通路发挥抗炎作用。

3.5。抑制C. B.刺水提取丙酸杆菌诱导的促炎性细胞因子的表达诱导的HaCaT细胞

主要的促炎细胞因子是IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α在炎症中扮演重要角色[4,18]。为了评估的影响b . davidii上含水提取物c·曼秀雷敦-诱导促炎细胞因子表达时，HaCaT细胞用指定浓度(12.5、25、50和100)预处理μg / ml)b . davidii1小时加入之前含水提取物热灭活c·曼秀雷敦(100 MOI) 24小时。c·曼秀雷敦- 处理的HaCaT增加IL-1的表达β、IL-6、IL-8和TNF-α。然而，表达IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α是剂量依赖性的下降c·曼秀雷敦治疗后处理的细胞b . davidii水提取物（图4)。il - 1β、IL-6、IL-8和TNF-α表达在50减少约32％，21％，35％，和29％ μg/ml，分别与未处理细胞比较。因此,50μ克/毫升b . davidii水性提取物是的提取物显示出最清晰的效果的最高浓度。这些结果表明b . davidii水提取物可以具有通过抑制促炎细胞因子表达的抗炎作用。

3.6。菝?水提物在菝?中的细胞毒性研究

要确定的细胞毒作用b . davidii上HaCaT细胞的含水萃取中，使用MTT测定。该细胞用b . davidii水提取物24小时，其浓度范围从0.39 μ克/ ml至100 μg / ml,b . davidii水性提取物对HaCaT细胞无显著细胞毒性作用（图5)。

4。讨论

尽管寻常痤疮的确切发病机制尚未阐明，但炎症已被认为是寻常痤疮发展和加重的关键因素。已被证实c·曼秀雷敦在炎症性痤疮病变的发生中起重要作用[1,4]。c·曼秀雷敦促进TLR-2在角质形成细胞的活化，加重炎症反应[2,4]。事实上，c·曼秀雷敦感染开始激活的单核细胞TLR-2，由NF-的活化诱导的主要信号传导途径κB或的MAPK信号传导途径，其又产生了细胞因子，趋化因子，粘附分子的表达，和粒细胞因子[4,18,20]。根据这些资料，b . davidii水提液能有效预防炎症引起的炎症c·曼秀雷敦通过抑制TLR-2对NF-的表达κ角质形成细胞中的B级联信号传导(图)1和2)。

近来，已经研究了MAPK信号通路在编码炎症介质[许多基因的诱导的炎症反应和协调的调节起着重要的作用13,19,20]。b . davidii含水提取物通过与处理过的HaCaT细胞抑制P-p38和P-JNK抑制促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）c·曼秀雷敦(图3.)。的TLR-2介导的下游MAPK信号传导途径的活化负责炎性细胞因子产生。MAPK激活在临床痤疮损害已经发现，表明MAPK信号传导的抑制是寻常痤疮的一般[重要的发病机制4,20]。使用MAPK抑制剂正在成为抗炎药物的一种有吸引力的替代品，因为它们可以减少促炎细胞因子的合成[20]。本研究结果表明b . davidii水性提取物调节促炎细胞因子的表达（TNF-α，IL-1β通过抑制NF-， IL-6和IL-8在炎症过程中发挥作用κB和MAPK激酶途径(图)4和6)。因此,b . davidii水提物可能是治疗细菌感染引起的炎症的一种潜在的MAPK抑制剂。

先前，R.田泡,美国mukorossi和侧柏水性提取物已被报道是抗炎[21- - - - - -23];然而，在这项研究中，R.田泡,美国mukorossi和侧柏水提物没有显示其抗炎活性(表)2)。此外，答:粳稻答:灰色,b . davidii,一，八角和P.炎水提物对引起的炎症有抑制作用c·曼秀雷敦（表2)。在这里,b . davidii水性提取物表现出更强的抑制朝向炎症过程引起的c·曼秀雷敦比一，八角该报道在以前的研究[15),答:粳稻答:灰色,P.炎（表2)。

b . davidii是一种众所周知的，传统的，草药和粉刺等炎症性疾病[治疗有希望的候选6,7]。更好地了解的机制b . davidii’s的抗炎活性不仅为我们了解炎症的动态平衡提供了机会，也为未来发现副作用更少的新型抗炎化合物提供了机会。

总之，这项研究提供了第一手的证据表明，b . davidii是否通过抑制NF-这两种途径来达到抗炎作用κB和MAPK激酶，导致促炎细胞因子表达降低。这些发现表明b . davidii是一种潜在有效的治疗寻常性痤疮的药物。但是，要充分了解其作用机理，确定其活性成分，还需要进一步的研究b . davidii抗炎活性，如木犀草素、槲皮素、橙皮素和秋水仙碱[6,24]。另外，评价其在体内的作用b . davidii需要在临床应用中使用。

数据可用性

没有数据来支持这项研究。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

这项研究是由京畿道GRRC计划（GRRC - 庆熙2018（B04）），大韩民国资助。

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