-马酚，大豆主要异黄酮，通过gpr30介导的部分途径抑制脂多糖刺激的大鼠星形胶质细胞产生一氧化氮

摘要

累积的证据表明，雌激素受体(ER)激动剂可减轻神经炎症。雌马酚是大豆中的主要异黄酮，具有雌激素样的生物活性，但其对炎症反应的作用尚未得到充分证实。在这里，我们研究了年代-雌马酚对一氧化氮(NO)产生的影响，这是众所周知的脂多糖刺激星形胶质细胞的炎症变化。年代-雌马酚可降低脂多糖诱导的NO生成，同时可诱导NO合酶(iNOS)表达减少。年代-雌马酚不影响脂多糖诱导的细胞内ROS生成的增加。胞内内质网阻滞剂ICI 182.780无作用年代-雌马酚诱导的NO生成减少。添加G-15, G蛋白偶联受体30的拮抗剂，位于细胞表面的非基因组ER，部分恢复年代-equol诱导的NO生成衰减。这些结果表明，一氧化氮的产生被年代-雌马酚可减轻脂多糖诱导的星形胶质细胞神经炎症。年代-马酚可能通过非基因组效应，至少部分地发挥胶质保护作用。

1.介绍

近年来，神经炎症在阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、中风等神经退行性疾病的发病机制中扮演了重要的角色[1，2］．在这些病理状态下，小胶质细胞和星形胶质细胞被激活;它们产生促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α（肿瘤坏死因子α), interleukin-1β(il - 1β)和干扰素-γ(干扰素γ)，以及一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)，导致神经元损伤;所有这些变化都会导致中枢神经系统紊乱[1- - - - - -3.］．一些证据表明雌激素受体(ER)激动剂可以减轻神经炎症[4- - - - - -6］．全身注射雌激素抑制脑室内注射脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞活化[7］．ER激动剂也能降低TNFα和il - 1βLPS处理后培养星形胶质细胞的分泌[8］．降低的雌激素水平增强βAD模型小鼠淀粉样肽沉积[9］．这些结果表明，雌激素可以通过抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化来缓解神经炎症。ER激动剂调节转录活性通过核内质网信号[10］．除了这种“基因组”效应，雌激素还对位于质膜上的受体起“非基因组”作用，激活多种信号通路来调节细胞功能[11］．G蛋白偶联受体30 (GPR30)作为质膜受体，具有雌激素的生物活性[12，13］．小胶质细胞中GPR30的表达有助于PD和缺血性卒中模型的神经保护作用[14，15］．然而，内质网在神经炎症中的基因组和非基因组作用仍有待充分阐明。

异黄酮是一种天然的多酚化合物，具有植物雌激素的作用[16]，并具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤特性[17］．雌马酚是大豆中主要的异黄酮化合物。肠道细菌，如Lactococcus garvieae代谢大豆苷,年代-equol [18].类似于other isoflavones such as genistein and daidzein, equol exhibits antioxidant property [19］．由于其相似的构象结构(见图)1），年代-雌马酚具有雌激素的亲和力，具有雌激素样的生物活性[19］．在外周，马雌酚抑制前列腺癌变[20.也能保护和减少紫外线引起的皮肤老化[21］．这种作用被认为是由于抗氧化作用和诱导细胞凋亡。在中枢神经系统细胞中，大豆异黄酮如染料木素、大豆黄酮和雌马酚已被报道对初级皮质神经元的缺氧具有神经保护作用[22］．在胶质细胞方面，以往的研究多集中于异黄酮对小胶质细胞的影响;染料木黄酮(23]和大豆苷元[24抑制脂多糖诱导的小胶质细胞的激活，对雌马酚也是如此[25］．与小胶质细胞相比，异黄酮对星形胶质细胞影响的报道较少;染料木素抑制溶血液引起的神经炎症变化[26]或淀粉样β［27］．由于马雌酚对星形胶质细胞炎症反应的影响尚未被研究，马雌酚在神经炎症反应中的作用尚不明确。

LPS是革兰氏阴性菌的外膜成分，它直接结合并激活toll样受体(TLRs)及其信号级联，产生多种炎症介质，包括促炎细胞因子，如TNFα, il - 1β,干扰素γ．脂多糖引起的变化被认为与神经退行性疾病相似[28，29］．在这里，我们研究了年代-雌马酚对NO产生的影响，这是众所周知的由LPS激活的星形胶质细胞的炎症变化。

2.材料和方法

2．1．化学品和抗体

除非另有说明，本研究中使用的所有化学品和试剂均为分析级。使用的化学物质和抗体如下：马血清和Dulbecco改良鹰培养基（DMEM），来自美国纽约州格兰德岛Gibco BRL；来自大肠杆菌0127:B8，蛋白酶抑制剂鸡尾酒，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，2 '，7 ' -二氯二氢荧光素二乙酸酯(H₂(7α, 17β-[9-(4,4,5,5,5-五氟戊基亚砜基)壬基]estra-1,3,5(10)-三烯-3,17-二醇β-actin和抗gfap，以及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(全分子)抗体，来自Sigma Aldrich公司，圣路易斯，密苏里，美国;年代-(-)equol from Toronto Research Chemicals, Toronto, ON, Canada;日本大阪Wako Pure Chemical公司的染料木素和大豆苷元;日本熊本Dojindo的2,3-二氨基萘(DAN)， 4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)和3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT);g - 1(1 -[(3级 ，4 ，9 b3) 4 - (6-Bromo-1 3-benzodioxol-5-yl), 4、5、9 b-tetrahydro-3H-cyclopenta [c[喹啉-8-基]-乙烷);G-15 (3aS,4R,9bR)-4-(6-溴-1,3-苯二酚-5-基)-3a,4,5,9b-四氢- 3h -环戊酮[c]喹诺酮;Cell Signaling Technology, Inc.， Danvers, MA, USA的抗细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、抗双磷酸化erk1 /2、抗p38-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和抗p38-MAPK抗体;抗cd11b抗体来自英国牛津AbD Serotec公司;Immobilon™Western Chemiluminescent辣根过氧化物酶substrate from Millipore Corp.， Billerica, MA, USA。如前所述提供iNOS抗体[30.］．

2．2.星形胶质细胞的制备与培养

这项研究得到了大阪府立大学动物实验伦理委员会的批准。制备大鼠原代皮质星形胶质细胞，并将其保存在含10%FBS、100%的DMEM中 μg/ml链霉素和50单位/ml青霉素，在95%空气和5%CO的增湿空气中₂如前所述[31］．在实验中，星形胶质细胞于第14天或之后被复制到培养皿或平板(细胞密度:4 × 10)⁵ 细胞/ml）。在我们的实验中，通过GFAP免疫组织化学测定，有95%以上的星形胶质细胞（图2）.

２．３．没有测量

亚硝酸盐是NO的稳定代谢物，如前所述，亚硝酸盐的产生被测量[31］．在96孔板上接种星形胶质细胞，用1μg/ml LPS处理24 h，含或不含异黄酮。使用带有ARVO 1420多标记计数器的DAN试剂荧光法测定无细胞上清中的亚硝酸盐浓度(Wallac, Turuk, Finland;激发/发射:355/460 nm)。

２.４.细胞生存能力分析

如前所述，用比色MTT法测定星形胶质细胞活力[31］．用ARVO 1420多标记计数器测量585 nm处的吸光度。

2.5.细胞内活性氧的测量

细胞内ROS的生成由H₂DCFDA，细胞渗透性荧光染料，如前所述[31］．简单地说，用1μg/ml LPS，含或不含50μ3、6、24 h。在那之后,5μM H₂将DCFDA加入无血清培养基中，37℃孵育30 min。用ARVO 1420多标记计数器测量细胞中二氯荧光素(DCF)的荧光强度以估计ROS的生成，激发/发射485/535 nm。

2.6。西方墨点法

60毫米培养皿中培养的星形胶质细胞分别用LPS(含或不含50)刺激μ米年代-如前所述，进行凝胶电泳，然后进行免疫印迹[31］．

免疫印迹法检测iNOS(1:10 000)、ERK1/2(1:10 000)、磷酸化ERK1/2 (perk 1/2;1: 1000)， p38-MAPK(1: 1000)，磷酸化p38-MAPK (p-p38-MAPK;1: 1000)，或者β-actin(1: 100,000)。蛋白检测采用增强型化学发光检测试剂，用las4000发光成像分析仪(Fujifilm, Tokyo, Japan)进行定量。

2.7。数据分析

为了测定NO和ROS的含量，每组6个培养板进行实验。实验使用了5个分离的细胞幼苗。数据显示为平均值±扫描电镜。采用单因素方差分析，然后采用Tukey-Kramer多重比较程序或Student多重比较程序-当 ．

3.结果与讨论

３．１．-马酚可降低脂多糖刺激的星形胶质细胞iNOS蛋白表达和NO生成

中枢神经系统的免疫反应在AD、PD、卒中等神经退行性疾病中发挥着重要作用，这已被广泛接受[1，2］．在这些病理条件下，炎症反应被用来刺激星形胶质细胞和小胶质细胞，导致包括tlr在内的模式识别受体的激活。这种激活产生炎症介质，包括促炎细胞因子，如TNFα和il - 1β、自由基和NO。LPS直接结合并激活TLR4，其信号级联被认为模仿神经退行性疾病[28，29］．因此，用LPS刺激星形胶质细胞是研究神经炎症的一个有用模型。

我们首先检查了年代-雌马酚对lps刺激的NO产生有抑制作用。培养的星形胶质细胞用1μg/ml LPS处理年代-雌马酚作用24 h，测定培养基中NO的产生。在…面前年代-雌马酚lps诱导的NO产生呈剂量依赖性减弱(图)3(一个)).用该方法观察到显著的抑制作用年代-雌马酚浓度为25μ米或更高。年代-马酚，浓度高达100μM用于本研究，不影响细胞活力(图3 (b)）.

探索其机制年代-马酚抑制脂多糖诱导的NO产生，我们接下来用western blotting研究iNOS的表达。LPS处理星形胶质细胞时加入或不加入50μ米年代-马雌酚作用24 h;比较iNOS的表达水平。类似于NO的产生，年代-雌马酚显著抑制lps诱导的iNOS表达(图)3 (c)）.

我们还检测了其他异黄酮对NO产生的影响。染料木素和大豆黄酮是大豆中常见的异黄酮，也作为植物雌激素[16，17].类似于年代-雌马酚、染料木素和大豆黄酮均显著抑制lps诱导的NO生成(图)3 (d)）.染料木素的这一结果证实了之前的报道，即染料木素可以防止星形胶质细胞的神经炎症变化[26，27］．这些结果表明，这些异黄酮可以减少神经炎症的变化，如lps刺激培养的星形胶质细胞中NO的产生。

３．２．-雌马酚对lps诱导的细胞内ROS生成无影响

抗氧化性能年代-雌马酚在一些细胞系中有很好的记录，如巨噬细胞[32]和主动脉内皮细胞[33在炎症)。此外，用LPS处理星形胶质细胞可产生ROS，随后诱导iNOS表达[34，35］．因此，减少了NO的产生年代-equol(图3(一个))可能是由于活性氧生成减少所致。为了验证这一点，我们研究了细胞内ROS的生成年代-equol-treated星形胶质细胞。LPS处理星形胶质细胞在3、6和24小时增加了ROS的产生(图)4(一))，如先前报道[31].增加50 μ米年代-雌马酚至少在24小时内不能降低脂多糖诱导的ROS生成。此外,应用年代100年-equolμM，本研究中减少NO产生的最有效剂量(图3(一个))，在本研究中ROS产生最高的6 h时，并没有减轻lps诱导的ROS产生(年代-马酚，113.2±3.1;Lps, 156.1±5.5;年代-雌马酚+ LPS，对照组173.7±10.1 %)。使用其他异黄酮，染料木素和大豆苷元也得到了类似的结果，尽管单独使用这些异黄酮对ROS的产生没有显著影响(图)4 (b)）.至少在目前的研究中，异黄酮不太可能清除ROS和减轻星形胶质细胞的氧化应激。

众所周知，LPS激活MAPKs，介导与细胞增殖、分化、存活和死亡等多种细胞活动相关的细胞内信号级联[36，37］．澄清…的可能机制年代-Equal诱导的NO生成抑制，我们检查了年代-雌马酚对MAPK激活的影响。LPS刺激或不刺激星形胶质细胞年代western blotting检测不同时间(1、3和6 h)中总p38-MAPK和磷酸化(激活)ERK1/2的变化。LPS显著提高了p38-MAPK在1,3,6 h的磷酸化水平。Cotreatment与年代-雌马酚和LPS对p38-MAPK激活无影响(图)5(一个)- - - - - -5 (c)）.此外，LPS诱导的ERK1/2磷酸化增加趋势不受添加的影响年代-equol在1,3,6 h(图5 (d)- - - - - -5 (f)）.这些结果表明，除ROS或MAPKs以外的其他因子，如p38-MAPK和ERK可能是减少NO产生的原因年代-equol。澄清这个问题需要额外的工作。

3．3．马酚通过非基因组途径发挥作用

众所周知，雌激素通过细胞内核受体家族(ER)发挥基因组效应α和ERβ，位于细胞质或核膜上[10］．探讨一氧化氮抑制的分子机制年代-马酚在lps激活的星形胶质细胞中，我们接下来检测了细胞内内质网拮抗剂ICI 182.780对NO产生的影响。增加1μ对M ICI 182.780没有影响年代-equol诱导的NO生成减少(图6）.

最近的一些证据表明，雌激素也作用于位于质膜上的受体，激活调节细胞功能的多种信号通路[11- - - - - -13］．来确定这些非基因组途径是否负责年代研究了GPR30激动剂/拮抗剂的作用。增加1μmg -15, GPR30的拮抗剂，部分恢复年代-equol诱导的NO生成衰减。此外，与GPR30激动剂G-1 (100 nM)共同处理LPS，而不是年代-雌马酚能显著抑制NO的产生，但其作用不如雌马酚年代-equol。这些结果表明年代-雌马酚可通过gpr30介导的途径减少脂多糖诱导的NO产生。

雌马酚对星形胶质细胞功能的影响目前尚未得到充分的研究。在本研究中，我们首次揭示了年代-雌马酚可降低脂多糖诱导的星形胶质细胞NO生成。因为NO的过量产生会加重神经退行性疾病的神经元损伤[1- - - - - -3.，我们的研究结果表明年代-马雌酚在中枢神经系统炎症反应减弱中的作用。一般来说，异黄酮被认为是一种抗氧化剂，事实上，大豆苷元已经被报道在lps诱导的神经炎症中抑制小胶质细胞中ROS的产生[24］．此外，巨噬细胞内ICI 182.780存在时被拮抗的雌激素抑制lps诱导的NO生成[38，表明这些效应是由经典基因组途径介导的。相比之下,年代-马酚在星形胶质细胞中没有显示出抗氧化作用(图4）.因此，在效果上的差异年代-雌马酚对星形胶质细胞和小胶质细胞的作用可能与ER的表达有关。而且，GPR30拮抗剂并没有完全恢复年代提示其他非基因组途径，如PI3激酶- akt信号通路也可能对一氧化氮的影响负责年代-equol [39，40］．需要更多的研究来揭示由年代-equol。因为雌马酚的化学结构被认为比其他异黄酮更容易通过血脑屏障[22，41]，我们的结果显示了对摄入年代-马酚可用于治疗中枢神经系统疾病。

4.结论

总之，我们的研究表明大豆异黄酮年代-雌马酚是调节神经胶质激活引起的神经炎症的关键因素。年代-雌马酚至少部分通过非基因组途径发挥作用。

缩写

广告:	阿尔茨海默病
DAPI:	4, 6-Diamidino-2-phenylindole
贴现:	二氯荧光素
DMEM:	杜尔贝克改良的鹰牌培养基
呃:	雌激素受体
兵:	细胞外信号调节激酶
的边后卫:	胎牛血清
GPR30:	G蛋白偶联受体
H2DCFDA:	2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯
干扰素γ：	干扰素-γ
il - 1β：	Interleukin-1β
伊诺:	诱导型一氧化氮合酶
有限合伙人:	脂多糖
MAPK：	丝裂原活化蛋白激酶
麻省理工:	(3) - 4 5-Dimethyl-2-thiazolyl 2, 5-diphenyl-tetrazolium溴离子
没有:	一氧化氮
帕金森病:	帕金森病
ROS:	活性氧
通常:	toll样受体
肿瘤坏死因子α：	肿瘤坏死因子-α．

信息披露

Kenji Kawabe先生目前的住址是日本冈山大学医学研究生院再生科学系，牙科和制药科学，冈山。

利益冲突

作者宣称不存在利益冲突。

作者的贡献

三和木森山构想并设计了实验;森山三和木、桥本绫野、川边健二、小川水和佐藤秀代进行了实验;Moriyama Mitsuaki, Katsura Takano和Yoichi Nakamura分析了数据;三和木森山和中村洋一撰写了这篇论文。

致谢

这项工作部分得到了JSPS KAKENHI基金7K08127(对森山三和木)、15K07768(对中村洋一)和17K15390(对高野桂太郎)的支持。

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